Gli autori desiderano ringraziare Nicole Hasenkampf e Amanda Tardo per il supporto tecnico. Ringraziamo anche Drs. Linden Hu e Adriana Marques per raccomandazione del dispositivo di contenimento LeFlap, ed il Dott. Lise Gern per istruzioni sul metodo di alimentazione capillare. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NCRR di Grant 8 P20 GM103458-09 (MEE) e dal Centro Nazionale per le Risorse della Ricerca e l&#39;Ufficio Programmi di infrastrutture di ricerca (ORIP) dei National Institutes of Health attraverso la concessione P51OD011104/P51RR000164.

Uno schema sperimentale di zecca inoculazione e di alimentazione su animali per la ricerca della malattia di Lyme è illustrato in Figura 1. 1. Inoculando nymphal zecche Ixodes con B. burgdorferi Uso capillare Tube-alimentazione Quando si esegue manipolazioni con le zecche, camice bianco con maniche elastici, guanti e cappellini bouffant usa e getta sono usurati. <ol><li> La nostra tecnica è una versione modificata di quella riportata da Broadwater et al. 49. Preparare tubi capillari da riscaldamento e tirando pipette Pasteur a rompere magrezza con un estrattore pipetta. Utilizzando una pinza e sezionare la portata, rompere le punte al diametro ottimale (circa 0,2 mm). Un tubo standardizzato rispetto alla dimensione tick mouthpart viene utilizzato come guida dimensionamento. La visiera deve essere indossato durante la preparazione delle pipette. </li><li> Crescere B. burgdorferi a tra 2-8 x 10 7 / ml (fase mid-log) in BSK-H medio (Sigma) concontenenti siero di coniglio 6%. </li><li> Utilizzare zecche ninfa che sono stati conservati a 23 ° C per 4-6 settimane molt post-larvale. Luogo zecche su un piccolo piatto di mm 60 x 15 Petri con nastro biadesivo sulla superficie inferiore esterna del piatto. Posizionare il lato ventrale zecche rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Immergere la punta capillare in B. burgdorferi provetta di coltura dopo la miscelazione. Posizionare il tubo capillare sul ipostoma delle parti tick bocca utilizzando un ambito dissezione. Utilizzare argilla stampaggio per fissare il tubo in posizione, come mostrato nella Figura 2A. </li><li> Porre le capsule di Petri con le zecche appositi all&#39;interno di una grande vasca di plastica trasparente per un ulteriore livello di contenimento. Asciugamani di carta bagnati sono aggiunti per fornire umidità. Collocare le zecche in un incubatore termica 37 ° C per 30 minuti-2 ore fino defecazione è evidente. Ciò indica che i supporti contenenti spirochete è passato attraverso il segno di spunta. </li><li> Appoggiare le zecche per 2-4 settimane a 23 ° C per consentire l&#39;adattamento all&#39;ambiente tick prima della poppatali su animali. </li></ol> 2. Infettando topi con B. burgdorferi by Tick <ol><li> Diluire ketamina magazzino 01:10 in acqua sterile. Anestetizzare ciascun topo con 100 mg / kg di ketamina mediante iniezione intraperitoneale con una siringa da tubercolina </li><li> Una volta che il mouse è completamente anestetizzato, radere il topo dalle orecchie a metà schiena con una multa (Remington liscia e setosa) trimmer elettrico. </li><li> In una padella bianco senza altri oggetti vicini, trasferire le zecche ninfali (che porto B. burgdorferi) da un pennello inumidito per la zona glabra del mouse. In alternativa, zecche infetti possono essere messi sui topi per Xenodiagnosis di topi con sospetta infezione. L&#39;utilizzo di una superficie bianca pulita per il posizionamento tick aiuta a garantire che eventuali zecche slegati saranno facilmente visibili. </li><li> Posizionare il mouse in gabbie specializzata (Allentown Ingabbiare, Allentown, PA). La gabbia è costituito da una griglia in acciaio inox elevato dal fondo della gabbia. Tegli top gabbia è stata modificata dalla nostra officina in-house per elevare il supporto della bottiglia di acqua sufficiente a consentire il libero movimento del mouse sotto. Il piatto è riempito con circa ½ centimetro di acqua per trattenere eventuali zecche che cadono fuori i topi (Figura 3A). Per ridurre al minimo il rischio di ipotermia, cuscinetti termici riutilizzabili, scaldati prima dell&#39;uso, sono posti sotto le gabbie fino a quando i topi si svegliano completamente dall&#39;anestesia. Gli animali sono spesso atassica come recuperare da anestesia e strofinare contro il cibo e vaschette, per cui questi devono essere rimossi. Il livello dell&#39;acqua è abbastanza basso per prevenire membra di topi da sommersione. </li><li> Posizionare la gabbia all&#39;interno di un vassoio che è stato rivestito con trappola groviglio di pasta (Contech, Victoria, BC, Canada) e nastro per garantire l&#39;intrappolamento degli artropodi. I topi sono in gabbia singolarmente e osservati continuamente durante il periodo di anestesia. </li><li> Entro 2 ore, quando i topi sono completamente svegli dall&#39;anestesia, il vassoio di cibo e una bottiglia d&#39;acqua sono sostituiti alla gabbia. Dopo 24 ore, l&#39;arricchimento custodia costituito da una capanna di plastica e Nylabone viene sostituito. </li><li> Dopo 3, 4, e 5 giorni, controllare il mouse, gabbia e acqua gabbia per zecche fed. L&#39;acqua gabbia setacciata attraverso un tegame di metallo bianco (vale a dire &quot;cercatore d&#39;oro&quot;). Sciacquare alimentato zecche in acqua pulita e conservare in vasetti di plastica (Figura 3B). Nei giorni 3 e 4, sostituire l&#39;acqua in gabbia con acqua pulita. Il giorno 5, controllare non solo la gabbia, ma il mouse accuratamente per le zecche. Di solito a questo punto tutte le zecche hanno alimentato ed i topi possono essere restituiti a ingabbiamento regolare. </li><li> Collocare tutti i rifiuti dalle gabbie del mouse, inclusi i liquidi, in contenitori a rischio biologico per autoclave e smaltimento. Tenere un registro del numero di zecche fatti su topi e quelli recuperati in ogni momento. </li></ol> 3. Nutrire zecche su primati non umani per l&#39;infezione con B. burgdorferi o Xenodiagnosis <ol><li> Preparare il dispositivo di zecca di contenimento: Tagliare un cerchio di 1 ¾ di pollice di diametro nel 3 pollici x3 pollici LeFlap (lembo) utilizzando un bisturi pulito e la guida di misura. Utilizzare il cut-out come modello per tagliare i cerchi di dimensioni identiche nella Biatane schiuma e Duoderm. La schiuma viene utilizzato per elevare lembo sulla superficie della pelle e prevenire possibili frantumazione di zecca. Il Duoderm aggiunge un altro strato di ammortizzazione e sovrappone i bordi del dispositivo di contenimento per una maggiore sicurezza dal tick fuga. Lo schema del dispositivo di contenimento è mostrata in Figura 4. </li><li> Personale veterinario sarà anestetizzare l&#39;animale con 5-8 mg / kg Telazol per iniezione intramuscolare. </li><li> Agganciare il pelo dell&#39;animale con trimmer elettrico (Oster) dotato di dimensioni 40 lame. Tutte le aree che saranno oggetto della giacca sono ritagliati: posteriore, anteriore, parte superiore delle braccia. Utilizzo di crema da barba e dual-blade rasoi usa e getta, strettamente radere una superficie di circa 25 centimetri in verticale x 20 cm orizzontale. Pulire con tovaglioli di carta umidi e asciugare a bassa temperatura per asciugare la pelle. </li><li> Posizionare l&#39;aletta sul tegli animale del dorso, appena sotto la scapola, su entrambi i lati della colonna vertebrale. Usare un pennarello per tracciare il cerchio in quel punto. Preparare la zona di pelle intorno al cerchio strofinandola con SkinPrep. Questo rimuove l&#39;olio in pelle che potrebbero influenzare l&#39;adesione dei dispositivi di colla e di contenimento. Lasciando circa 1 cm circonferenza di spazio intorno al cerchio, applicare uno strato di colla pelle (SkinBond) con una larghezza di circa 4 cm. </li><li> Rimuovere la pellicola adesiva dalla schiuma Biatane e apporre la pelle nel punto appropriato. Gli animali sono di nuovo anestetizzati dal personale veterinario con 5 mg / kg Telazol. Sigillare i bordi con colla di pelle e nastro Hypafix. Rimuovere la protezione adesiva dal lembo e apporre sulla parte superiore del Biatane. Luogo nastro Hypafix intorno ai bordi del LeFlap, poi il nastro lungo il lembo di maglia del lembo e posizionare la giacca sull&#39;animale. Tape ed aggroviglia Trappola pasta viene applicata al pavimento in un perimetro che circonda la gabbia dei primati non umani per una maggiore sicurezza. </li><li> Per ridurre al minimo gli effetti della chemicals utilizzati nella Fase 3.4 sull&#39;alimentazione tick, le zecche sono aggiunti 24 ore dopo che il dispositivo di contenimento è a posto. A questo punto, la sicurezza del dispositivo è anche controllato e rinforzato se necessario. Tipicamente, 20 ninfe unfed (molt 4-8 settimane post-larvale) vengono aggiunti alla pelle all&#39;interno del dispositivo con un pennello. </li><li> Rimuovere il foglio adesivo dalla maglia del lembo e sigillare in posizione. Infine, rimuovere il supporto Duoderm per esporre l&#39;adesivo, e posto sulla parte superiore del dispositivo di contenimento. Aggiungere un pezzo di nastro Hypafix attraverso il cerchio maglie aperte, e sostituire la giacca. Il dispositivo di contenimento è mostrato nella figura 5A. </li><li> Dopo 5 giorni, anestetizzare gli animali come sopra e le giacche vengono rimossi. Rimuovere il nastro prima di ispezionare l&#39;alimentazione tick attraverso la rete (Figura 5B). Facendo attenzione la Duoderm lontano dal lembo. </li><li> Tirare indietro la parte di rete ai bordi per fornire l&#39;accesso alle zecche. Zecche Fed si trovano spesso vicino o sottoil cerchio di schiuma (Figura 5C) e sono rimosso e collocato in acqua pulita con un pennello. Rimuovere il dispositivo una volta tutte le zecche alimentati visibili sono raccolti (Figura 5D). </li></ol> Nota: Spesso, il dispositivo di contenimento può essere semplicemente staccato dalla pelle. Se l&#39;adesione è forte e potrebbe potenzialmente danneggiare la pelle, Unisolve solvente viene applicato all&#39;area per la rimozione delicata. La pelle viene pulita con isopropanolo e zecche sono conservati a 23 ° C. Se utilizzato per le infezioni, le zecche possono essere schiacciati per confermare il numero che conteneva B. burgdorferi. Se utilizzato per Xenodiagnosis, le zecche sono conservati per 1-3 settimane prima dell&#39;analisi del contenuto dell&#39;intestino medio.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Al fine di ottenere le zecche che porto B. burgdorferi per studi a valle, le zecche possono essere: (1) alimentati con topi infettati allo stadio larvale, (2) immerso in B. culture burgdorferi alle due larvale o ninfale fase 48; (3) microiniettati con B. burgdorferi 47; o (4) capillare tubo-fed B. burgdorferi 49. Mentre ciascuno di questi metodi ha il suo scopo, per assicurare che una gran parte delle zecche da utilizzare per porto infezione <...

Nel 2011, la malattia di Lyme è stato il sesto più comune malattia a livello nazionale Notifiable in Nord America ( <a href="http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html" target="_blank">http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html</a> ). B. burgdorferi è un microbo versatile, sia geneticamente e antigenicamente (rivisto in 1). La sua costituzione genetica comprende una grande (&gt; 900 kB) cromosoma e fino a 21 plasmidi (12 lineari, circolari 9), con contenuto plasmide variabile tra gli isolati. Molto può essere imparato su questi spirochete, superiore al 90% del plasmide open reading frames estranei a qualsiasi sequenze batteriche conosciuti 2,3. B. burgdorferi presenta una grande varietà di antigeni come potenziali bersagli di immunità dell&#39;ospite. Tuttavia, un&#39;infezione non trattata spesso persiste. L&#39;interazione del spirochete con l&#39;ambiente tick e l&#39;ambiente ospite vertebrato richiede adattamenti in B. burgdorferi tutto il processo di infezione. Diversi plasmidicageni sono noti per essere differenzialmente espressi in risposta alle variazioni di temperatura, pH, densità cellulare e persino fase del ciclo di vita tick 4-8. Lo studio di B. adattamento burgdorferi tutto il suo ciclo leucosi e risposta dell&#39;ospite dopo l&#39;infezione per via naturale si basa sulla capacità di alimentare zecche su modelli animali appropriati. Tali studi sono soddisfatti con le sfide tecniche di generazione di zecche che ospitano B. burgdorferi, e garantire la trasmissione efficiente e / o l&#39;alimentazione delle zecche sul modello di accoglienza. Inoltre, il contenimento e il recupero di zecche infette è essenziale. Tra i modelli utilizzati sono topi e primati non umani, ognuno dei quali funge da strumento prezioso nella ricerca sulla malattia di Lyme. Come con il mouse zampe bianche, che è un host serbatoio naturale per B. burgdorferi, il topo di laboratorio è un host altamente sensibile che supporta l&#39;infezione persistente da parte di B. burgdorferi 9. Folsivo infezione di topi suscettibili alla malattia, come il ceppo C3H, le spirochete diffondere a più tessuti, compresa la pelle, della vescica, i muscoli, le articolazioni e il cuore. Risposte infiammatorie alle infezioni portano a cuore malato e tessuti articolari. Mentre le spirochete persistono in questa struttura e rimangono contagiosi, lesioni infiammatorie possono diventare intermittente, non diversamente dal processo negli esseri umani. Il modello di topo ha quindi fornito molte informazioni su B. burgdorferi patologia indotta, tra cui l&#39;artrite e cardite e ospitare le risposte immunitarie 10-12. Dal punto di vista del patogeno, alcuni geni differenzialmente espressi durante l&#39;infezione mammiferi sono stati caratterizzati, come avere qualche necessaria per la trasmissione della zecca vettore 13-21. Sebbene diverse specie animali sono stati utilizzati per studiare la malattia di Lyme 22, macachi rhesus più strettamente imitare il carattere multi-organo di malattia umana 23. A differenza di altrimodelli animali, l&#39;ampiezza delle manifestazioni della malattia, quali eritema migrans, cardite, artrite, e la neuropatia del sistema nervoso centrale e periferico sono osservate nei macachi. Nei topi, l&#39;ospite serbatoio per B. burgdorferi, malattia varia da ceppo di topi e 24 anni, mentre le precoci e tardive diffuse manifestazioni sono infrequenti 9. Inoltre, altri roditori, lagomorfi, e canini tutti riescono a esporre malattia neurologica da B. burgdorferi 25. È importante sottolineare che, macachi mostrano segni che sono caratteristici di tutte e tre le fasi della borreliosi di Lyme, vale a dire, precoce localizzata, precoce disseminata e in fase avanzata della malattia di Lyme 26-28. L&#39;eritema migrante (EM) è pensato per verificarsi nel 70-80% dei casi umani 29, e si vede anche nei macachi rhesus 28,30. Dopo l&#39;infezione, le spirochete diffondere dal sito di inoculazione di organi multipli. DNA spirochetal è stato rilevato in mu scheletricoscles, cuore, vescica, dei nervi periferici e del plesso, nonché nel sistema nervoso centrale (cervello, cervelletto e tronco cerebrale, midollo spinale, e dura madre) 31. Spunta nutrendosi di topi è stato utilizzato da noi e da altri gruppi di ricerca per la moltiplicazione delle colonie di zecche, in competenza serbatoio studia 32-36 e negli studi di B. burgdorferi patogenesi 37-40. Questa tecnica è stata utilizzata anche per Xenodiagnosis e test di efficacia del vaccino nei topi 41-44. Abbiamo nutrito zecche Ixodes su primati non umani per il modello di sviluppo 28, uno studio di efficacia del vaccino 45, e per Xenodiagnosis nella valutazione della persistenza trattamento post-antibiotico 46. Le zecche che porto B. burgdorferi può essere mantenuta in un ciclo leucosi naturale nutrendosi di larve sui topi infetti e con le ninfe per gli studi, le spirochete sono trasmessi attraverso le fasi della vita. In questo rapporto, Ci spiegherà come generare zecche infettate con wild type o mutante B. burgdorferi, utilizzando capillare tubo di alimentazione. Questo può anche essere realizzato mediante microiniezione 47 e 48 per immersione. Lo scopo della introduzione artificiale di B. burgdorferi nelle zecche possono essere di studiare ceppi mutanti la cui trasmissibilità è sconosciuto, per generare un gruppo di zecche, con un alto tasso di infezione, e per ridurre il rischio di errore mantenendo un segno di spunta colonia pulito e altrimenti non infetto. Inoltre, dimostriamo alimentazione segno di spunta su topi e primati non umani, in modo da assicurare il contenimento e il recupero delle zecche piene. L&#39;uso di alimentazione tick è essenziale per gli studi futuri di risposte immunitarie a B. burgdorferi, potenziale efficacia del vaccino di Lyme, e Xenodiagnosis a rilevare le infezioni occulte.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSK-H</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-8291</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tangle Trap coating Paste</td>
			<td>Ladd research</td>
			<td>T-131</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SkinPrep</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>177364</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LeFlap, 3" x 3"</td>
			<td>Monarch Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hypafix tape</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>191523</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SkinBond</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>554536</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>UniSolve</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>176640</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Biatane Foam, adhesive 4"x4"</td>
			<td>Coloplast</td>
			<td>3420</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border </td>
			<td>Convatec</td>
			<td>187971 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom</td>
			<td>Lomir Biomedical Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 700C</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dark field microscope</td>
			<td>Leitz Wetzlar</td>
			<td>Dialux</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Zoom 2000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mouse caging</td>
			<td>Allentown caging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

feeding of ticks on animals for transmission and xenodiagnosis in lyme disease research

La trasmissione dell&#39;agente eziologico della malattia di Lyme, Borrelia burgdorferi, avviene l&#39;attacco e l&#39;alimentazione del sangue di specie Ixodes zecche su host mammiferi. In natura, questo patogeno batterico zoonotici possono utilizzare una varietà di host di giacimento, ma il topo bianco-footed (Peromyscus leucopus) è il serbatoio principale per le zecche larvali e ninfali in Nord America. Gli esseri umani sono padroni incidentali più frequentemente infettati da B. burgdorferi dal morso di zecche in fase di ninfa. B. burgdorferi adatta ai suoi ospiti durante tutto il ciclo di leucosi, quindi la capacità di esplorare le funzioni di queste spirochete e dei loro effetti sui ospiti mammiferi richiede l&#39;uso di alimentazione tick. Inoltre, la tecnica di Xenodiagnosis (utilizzando il vettore naturale per il rilevamento e il recupero di un agente infettivo) è utile in studi di infezione criptica. Per ottenere nymphal zecche che porto B. burgdorferi,zecche sono alimentati spirochete vivi in ​​cultura attraverso tubi capillari. Due modelli animali, topi e primati non umani, sono più comunemente utilizzati per gli studi di malattia di Lyme che coinvolgono alimentazione tick. Dimostriamo le modalità con cui queste zecche possono essere alimentati al momento, e recuperato dagli animali sia per infezione o Xenodiagnosis.

A seguito del completamento di alimentazione capillare, le zecche sono tipicamente riposato a 23 ° C per 2-3 settimane prima di essere alimentati su animali per la trasmissione. Utilizzando la tecnica capillare al seno, abbiamo scoperto che oltre il 90% della Fed zecche porto B. burgdorferi. La percentuale di zecche positive viene determinata mediante lavaggio zecche in perossido ed etanolo, poi schiacciandoli in PBS sterile con un pestello a forma di provetta per microcentrifuga. Il contenuto dell&#39;intesti...

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Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

La malattia di Lyme è la più comunemente riportati vector-borne malattia in Nord America. L&#39;agente eziologico, Borrelia burgdorferi è un batterio spirocheta trasmessa da zecche ixodid. Trasmissione e rilevamento di un&#39;infezione in modelli animali è ottimizzata dall&#39;utilizzo di alimentazione tick, che descriveremo qui.

Alimentazione di zecche su animali per trasmissione e Xenodiagnosis a Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.1K Views.  Tulane University Health Sciences Center.  La malattia di Lyme è la più comunemente riportati vector-borne malattia in Nord America. L'agente eziologico, Borrelia burgdorferi è un batterio spirocheta trasmessa da zecche ixodid. Trasmissione e rilevamento di un'infezione in modelli animali è ottimizzata dall'utilizzo di alimentazione tick, che descriveremo qui. 

Video: Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

RNA Interference in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors of human diseases1 and the most important vectors affecting cattle industry worldwide2. Ticks are classified in the subclass Acari, order Parasitiformes, suborder Ixodida and are distributed worldwide from Arctic to tropical regions3. Despite efforts to control tick infestations, these ectoparasites remain a serious problem for human and animal health4,5.
RNA interference (RNAi)6 is a nucleic acid-based reverse genetic approach that involves disruption of gene expression in order to determine gene function or its effect on a metabolic pathway. Small interfering RNAs (siRNAs) are the effector molecules of the RNAi pathway that is initiated by double-stranded RNA (dsRNA) and results in a potent sequence-specific degradation of cytoplasmic mRNAs containing the same sequence as the dsRNA trigger7-9. Post-transcriptional gene silencing mechanisms initiated by dsRNA have been discovered in all eukaryotes studied thus far, and RNAi has been rapidly developed in a variety of organisms as a tool for functional genomics studies and other applications10.
RNAi has become the most widely used gene-silencing technique in ticks and other organisms where alternative approaches for genetic manipulation are not available or are unreliable5,11. The genetic characterization of ticks has been limited until the recent application of RNAi12,13. In the short time that RNAi has been available, it has proved to be a valuable tool for studying tick gene function, the characterization of the tick-pathogen interface and the screening and characterization of tick protective antigens14. Herein, a method for RNAi through injection of dsRNA into unfed ticks is described. It is likely that the knowledge gained from this experimental approach will contribute markedly to the understanding of basic biological systems and the development of vaccines to control tick infestations and prevent transmission of tick-borne pathogens15-19.

A method for RNA interference (RNAi) by injection of dsRNA into unfed ticks is described. RNAi is the most widely used gene-silencing technique in ticks where the use of other methods of genetic manipulation has been limited.

RNA interferenza nelle zecche

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

Metodi per il trasferimento rapido e localizzazione di agenti patogeni malattia di Lyme All&#39;interno della Gut Tick

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Saliva, le ghiandole salivari, e Collection emolinfa dalle zecche Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Tampone Metodo di campionamento per la rilevazione di Norovirus umana sulle superfici

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

Protocolli per Indagare la distribuzione Host-tessuti, trasmissione-mode, e Effetto sul Fitness ospite di un Densovirus in cotone bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Valutazione dei citotossici e gli effetti immunomodulatori di sostanze in fette di polmone umano di taglio di precisione

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

Raccolta e trattamento dei linfonodi da grandi animali per l'analisi del RNA: preparazione per gli studi di trascrittomica di linfonodo di grandi specie animali

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates

American trypanosomiasis is transmitted to humans by triatomine bugs through the ingestion of contaminated food, by blood transfusions or accidently in hospitals and research laboratories. In addition, the Trypanosoma cruzi infection is transmitted congenitally from a&#160;chagasic mother to her offspring, but the male partner&#39;s contribution to in utero contamination is unknown. The findings of nests and clumps of amastigotes and of trypomastigotes in the theca cells of the ovary, in the goniablasts and in the lumen of seminiferous tubules suggest that T. cruzi infections are sexually transmitted. The research protocol herein presents the results of a family study population showing parasite nuclear DNA in the diploid blood mononuclear cells and in the haploid gametes of human subjects. Thus, three independent biological samples collected one year apart confirmed that T. cruzi infections were sexually transmitted to progeny. Interestingly, the specific T. cruzi antibody was absent in the majority of family progeny that bore immune tolerance to the parasite antigen. Immune tolerance was demonstrated in chicken refractory to T. cruzi after the first week of embryonic growth, and chicks hatched from the flagellate-inoculated eggs were unable to produce the specific antibody.&#160;Moreover, the instillation of the human semen ejaculates intraperitoneally or into the vagina of naive mice yielded T. cruzi amastigotes in the epididymis, seminiferous tubule, vas deferens and uterine tube with an absence of inflammatory reactions in the immune privileged organs of reproduction. The breeding of T. cruzi-infected male and female mice with naive mates resulted in acquisition of the infections, which were later transmitted to the progeny. Therefore, a robust education, information and communication program that involves the population and social organizations is deemed necessary to prevent Chagas disease.

The Trypanosoma cruzi agent of Chagas disease produces long-lasting asymptomatic infections that abruptly develop into clinically recognized pathology. The following research protocol describes a short-run family-based epidemiological study to unravel the T. cruzi infection transmitted sexually from parent to progeny.

Trasmissione sessuale dell'americano Trypanosomes da maschi e femmine ai compagni di Naive

American trypanosomiasis is transmitted to humans by triatomine bugs through the ingestion of contaminated food, by blood transfusions or accidently in ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

Trasfezione altamente efficiente dei macrofagi primari con mRNA trascritto in vitro

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

Test standard di alimentazione a membrana per la rilevazione dell'infezione da Plasmodium falciparum in vettori di zanzare Anopheles

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...