Le zecche sono ectoparassiti ematofagi, Rhipicephalus microplus, popolarmente noto come zecca del bestiame ha un enorme impatto economico negativo sul bestiame nelle aree tropicali. Inoltre, le crescenti preoccupazioni per le condizioni ambientali degradate e le preoccupazioni per la salute pubblica causate dall'uso inappropriato di acaricidi chimici e dalla crescente resistenza delle popolazioni di zecche ai parassiti tradizionali, stanno stimolando la ricerca su metodi di controllo alternativi, come l'uso di funghi entomopatogeni. Questi entomopatogeni infettano attivamente gli ospiti degli artropodi, attraverso la loro cuticola e colonizzano il loro corpo.
L'artropode può avere risposte diverse all'infezione fungina. Il sistema immunitario degli artropodi è diviso in risposte umoristico e cellulare. La risposta umoristica coinvolge il processo di emoagglutinazione e la produzione di molecole antimicrobiche, mentre gli emociti mediano la risposta immunitaria cellulare.
La maggior parte degli studi sulla risposta immunitaria degli artropodi sono riportati usando insetti mentre le risposte alle zecche rimangono meno esplorate. Inoltre, l'inoculazione patogena e la raccolta dell'emolinfa di zecca sono tecniche scarsamente diffuse necessarie per comprendere meglio la risposta immunitaria dell'artropode. Di conseguenza, queste tecniche di indirizzo video\utilizzate per filmare l'inoculazione, la raccolta e l'elaborazione dell'emolinfa.
Poiché gli emociti di zecca che raccolgono affrontano alcune limitazioni, come l'interruzione delle cellule, il basso valore dell'emolinfa e la bassa concentrazione di cellule recuperate. Infettare direttamente la configurazione e l'analisi delle celle. Dopo la raccolta delle zecche, lavare le femmine ingoiate.
Utilizzare acqua del rubinetto e immergerli in una soluzione di ipoclorito di sodio dello 0,5% per tre minuti in un recipiente di becher di vetro da 500 millilitri. Per l'igiene delle cuticola, dividere le femmine in gruppi omogenei con 20 femmine ciascuna. Sono state eseguite tre repliche di ciascun gruppo.
Le blastospore metarhizium robertsii sono state utilizzate nel processo di inoculazione. Aggiungere un liquido di cinque microlitri metarhizium blastospores sospensione sulla superficie di un film di paraffina di plastica. Per accelerare il processo di inoculazione, è possibile aggiungere più bolle alla superficie della pellicola di paraffina di plastica, ogni bolla corrispondente a cinque microlitri.
Utilizzare una siringa per insulina ultra-fine di un millimetro e un ago da 0,3 millimetri per mettere una sospensione e inocularla nel segno di spunta. Ricordarsi di esentare tutta l'aria dalla siringa prima di usarla. Inoculare 5 microlitri di sospensione fungino nella femmina tick tra lo scutum e il capitulum.
Un piccolo volume di emolinfa può essere presente sull'inquadratura dopo l'incisione dell'ago. Fare attenzione a non inoculare l'aria. Inoculare le femmine con sospensione fungina tra la coscia della gamba e il corpo della femmina utilizzando una siringa di insulina ultra-fine da un millilitro accoppiata a un ago da 0,3 millimetri.
Quando l'inoculazione delle blastospore del metarhizium viene eseguita tra la coscia della gamba e il corpo della femmina di zecca, un piccolo volume di emolinfa può essere presente sulla coscia dopo l'inserimento dell'ago. Fare attenzione a non inoculare l'aria. Utilizzare la parte in gomma di un set di infusione alato un tubo capillare da 0,3 miliimetri e una punta del filtro per eseguire la raccolta dell'emolinfa.
Interrompere la cuticola dorsale femminile usando un ago di 0,3 millimetri. Dopo l'interruzione applicare una leggera pressione sulla parte anteriore del corpo di zecca. Osserva un pool di liquidi quasi trasparente fuori dal sito di interruzione.
Raccogliere l'emolinfa succhiando il liquido attraverso la punta del filtro accoppiata a una parte di gomma di un set di infusione alato e un tubo capillare di 0,3 millimetri. Non premere il corpo del segno di spunta difficilmente durante la sua immobilizzazione perché questo può interrompere il midgut e contaminare l'emolinfa. Attendere che una pressione delicata possa espellere il fluido senza contaminazione.
Immobilizza il segno di spunta. Taglia un pezzo di gamba anteriore. Una o più gambe possono essere tagliate così come la stessa gamba può essere tagliata più di una volta.
Applicare una leggera pressione sulla parte posteriore del corpo del segno di spunta. Osservare una bolla liquida trasparente che si presenta sul lato tagliato e raccoglierla con il tubo capillare. Non premere il corpo del segno di spunta a malapena, durante la sua mobilitazione perché questo può interrompere il midgut e contaminare l'emolinfa.
Attendere che una pressione delicata possa espellere il fluido senza contaminazione. Dopo la raccolta dell'emolinfa, depositarlo in 1,5 mililitri microtubo precedentemente riempito con 30 microlitri proteasi cocktail e 82 microlitri tampone salino. Tieni i microtubi sul ghiaccio per tutta la collezione di emolinfa.
I campioni di centrifuga e il pellet morbido di emociti si formeranno dopo la centrifugazione dell'emolinfa. Per la quantificazione dell'emolinfa, quantificare il volume dell'emolinfa ottenuto contando il volume totale all'interno del microtubo e scontando il volume di cocktail proteasi e tampone salino. Rimuovere con cura l'emolinfa supernatante priva di cellule e sospendere delicatamente le cellule.
Quantificare gli emociti posizionando 10 microlitri di emociti ri-sospesi nella camera Neubauer. Per le cellule è stato utilizzato un supporto di coltura. Tagliare la gamba anteriore del segno di spunta, applicare una leggera pressione sulla parte posteriore del corpo del segno di spunta, osservare una bolla liquida trasparente sul sito di taglio.
Applicare le gocce di emolinfa direttamente sulle diapositive del microscopio pulite. Successivamente utilizzare metodi appropriati per macchiare le cellule. L'inoculazione tra la coscia della gamba e il corpo femminile di zecca può anche danneggiare gli organi interni del segno di spunta come il midgut e i tubuli malpighiani.
Quando il midgut di zecca viene interrotto dall'ago nella raccolta dell'emolinfa dorsale, il fluido ottenuto è rosso, non trasparente. Ciò indica una raccolta di emolinfa errata. In questo caso, l'emolinfa deve essere scartata in quanto contaminata.
La contaminazione da emolinfa può anche essere osservata quando il segno di spunta è naturalmente infetto da alti carichi di agenti patogeni o nelle fasi finali dopo il processo di morte causate da agenti patogeni inoculati. Il volume dell'emolinfa ottenuto dopo la raccolta dorsale è superiore al volume ottenuto nella raccolta attraverso la gamba. Nonostante l'easiness della contaminazione è più elevato nel primo metodo di raccolta.
La concentrazione di emociti era anche significativamente più alta nella collezione dorsale. Quando viene eseguita corretta la raccolta degli emociti è possibile ottenere un buon striscio ed è possibile distinguere diversi emociti dopo la colorazione. Questo video ha fornito informazioni sui metodi per eseguire l'inoculazione di agenti patogeni, in particolare funghi entomopatogeni, nelle zecche e raccogliere la loro emolinfa.
Le tecniche qui presentate richiedono risorse tecnologiche molto basse nei nostri passaggi classici per studi sulla fisiologia delle zecche, sulla patologia delle zecche e sulla risposta immunitaria di Tick. La corretta raccolta delle cellule artropodi e l'emolinfa senza cellule è fondamentale per fornire informazioni affidabili per studi successivi. Per questo motivo, è anche importante essere consapevoli degli errori più comuni osservati nell'esecuzione di queste tecniche.
Inoltre, le proposte del presente studio determinano il sito più appropriato per la raccolta dell'emolinfa mediante deformazione o taglio delle gambe, considerando la differenza di volume ottenuta e la probabilità di contaminazione.
