Gli autori desiderano ringraziare Malinda Spry per l&#39;assistenza tecnica. Riconosciamo inoltre fonti di finanziamento attuali e passati: il National Cancer Institute (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), Wendy Will causa Cancer Research Fund, il Cancer Foundation Markey, i bambini Miracle Network e Jennifer e David Dickens Melanoma Research Foundation.

1. Preparazione di forskolina per topica Amministrazione da un greggio estratto di radice della pianta Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) <ol><li> Protocolli per esperimenti murini hanno seguito le linee guida per una condotta etica nella cura e l&#39;uso di animali e sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso l&#39;Università del Kentucky (protocollo # 00768M2004). L&#39;estratto di radice è composto al 40% peso / volume in una base dermatologica tenore di etanolo al 70%, 30% di glicole propilenico. </li><li> Pesare 200 g di estratto di radice forskolina greggio e trasferirlo in un becher. Per fare 500 ml di 40% (w / v), risospendere 200 g di estratto di radice forskolina grezzo aggiungendo maggior parte ma non tutto il volume del veicolo (70% etanolo, 30% di glicole propilenico) e portare la soluzione al circa 450 ml. </li><li> Agitare per un&#39;ora a temperatura ambiente. La soluzione sarà leggermente viscoso e può richiedere agitazione manuale &quot;lift&quot; dell&#39;estratto in soluzione primal&#39;ancoretta è in grado di prendere il sopravvento. </li><li> Dopo un&#39;ora di agitazione, si versa la miscela in un cilindro graduato e portare il volume a 500 ml con veicolo che è stato utilizzato per &quot;lavare&quot; il becher utilizzato per mescolare l&#39;impasto (per massimizzare il recupero di forskolina dal bicchiere) . </li><li> Trasferire l&#39;impasto per 50 ml provette per centrifuga in polipropilene. Centrifuga (1.500 xg, a temperatura ambiente, 15 min) utilizzando una centrifuga da tavolo. A questo punto, il materiale insolubile sarà abbastanza compatta, permettendo il supernatante di essere facilmente travasato. </li><li> Filtrare la soluzione attraverso una membrana di acetato di cellulosa 0,22 micron per rimuovere il materiale insolubile residuo dall&#39;estratto. Utilizziamo un sistema per bottiglia progettata per coltura cellulare, insieme con l&#39;uso di prefiltri fornite con l&#39;unità per evitare un precoce intasamento della membrana da componenti insolubili della radice estratto. Quando si effettuano grandi volumi di dell&#39;estratto, filtrare circa 100 ml per volta, cambiando la scommessa prefiltroween ogni volume aggiunto. </li><li> Se conservato a temperatura ambiente, l&#39;estratto mantiene l&#39;attività biologica per fino ad un anno. </li></ol> 2. Preparazione di C57Bl / 6 K14-Scf Mice per trattamenti topici <ol><li> Rimuovere la pelliccia dorsale dagli animali da taglio elettrico. Brevemente anestetizzare gli animali con isoflurano inalatoria per facilitare taglio di pelliccia dorsale con cesoie elettriche attrezzati con una testa di preparazione chirurgica 0,25 mm (Fisher Scientific). Preferibilmente utilizzare un solo tipo di anestesia (es ketamina / xilazina) per minimizzare il rischio di overdose di anestetico. La camera di inalazione satura comporta dei rischi sul lavoro quando viene utilizzato al di fuori di una cappa aspirante e fornisce quantità sconosciuta di anestetico per animali. Idealmente dovrebbe essere usato un vaporizzatore precisione. </li><li> Per rimuovere stoppie capelli residui, trattare gli animali con un depilatorio chimico. Somministrare anestesia per l&#39;animale con una iniezione ip di ketamina 40 mg / kg e xilazina 4 mg / kg </li&gt; <li> Una volta che gli animali sono adeguatamente anestetizzati (come giudicato da pinch tep), applicare una quantità dito dimensioni di crema depilatoria per la pelle dorsale tranciato con un dito guantato. Strofinare la crema sulla pelle per 30-60 secondi o fino a quando i capelli sono chiaramente visibili nella crema come viene spostato. Lasciare la crema solo per il tempo minimo necessario per la depilazione come l&#39;esposizione prolungata porta a bruciare chimica della pelle, ripartizione epidermica e la morte da perdita di integrità epidermica. </li><li> Pulire la pelle dorsale con garza imbevuta di acqua più volte fino a tutto crema è stato rimosso. Animali asciugare con asciugamani di carta morbidi, e consentire loro di recuperare in un luogo appartato caldo (ad esempio le gabbie pulite collocati su un tappetino di riscaldamento). Depilare gli animali uno per uno e monitorare attentamente tutta la procedura. </li></ol> 3. Somministrazione topica di forskolina o Vehicle Control <ol><li> Gli animali devono essere trattati uno alla volta. Brevemente anestetizzare con inspirazioned isoflurano posizionando il mouse sulla cima di un filtro di nylon permeabile all&#39;aria forma-misura in base al quale è stato posto un tovagliolo di carta isoflurano satura in un barattolo di vetro con coperchio isoflurano satura in una cappa aspirante. Esporre il mouse per isoflurano per un tempo sufficiente per sopprimere i movimenti muscolari volontari ma per preservare la respirazione spontanea (tipicamente 10-20 sec). Lasciando l&#39;animale in isoflurane troppo a lungo si tradurrà in soppressione respiratoria e morte. E &#39;meglio sbagliare sul lato di &quot;andare luce&quot; e dover ri-esporre il mouse brevemente più isoflurano, piuttosto che a un eccesso di esporre l&#39;animale alla morte di droga e di rischio. </li><li> Rimuovere l&#39;animale dalla camera di isoflurano e posizionare su una panchina pad assorbente pulita. </li><li> Usando una micropipetta 1.000 ml dotato di una punta in polipropilene monouso, elaborare 400 ml di 40% di estratto di forskolina greggio (animali di controllo del veicolo riceveranno il 70% di etanolo, 30% glicole propilenico solo). </li><li> Trasferire l&#39;estratto suldorso dell&#39;animale per gocciolamento esso sulla pelle e poi, usando il lato della punta della pipetta, spalmare l&#39;estratto sulla pelle dorsale finché tutta la pelle è stata coperta. Non c&#39;è bisogno di asciugare la pelle dopo l&#39;applicazione. </li><li> Riportare il mouse per sua gabbia, e osservare attentamente fino a che non recupera dall&#39;anestesia. </li><li> In modo che gli effetti cAMP non-pigmento non devono confondere gli esperimenti di sensibilità ai raggi UV, interrompere tutti i trattamenti topici 2 giorni prima della esposizione ai raggi UV (effetto pigmento dura diversi giorni al di là ultimo trattamento topico). </li></ol> 4. Pelle misurazione del colore da riflettente Colorimetry <ol><li> Brevemente anestetizzare il mouse con isoflurano inalato (vedi sopra). </li><li> Calibrare un colorimetro Minolta posizionando la testa portatile sulla superficie bianca standard predisposta con il colorimetro. </li><li> Posizionare la testa di misura portatile del filo colorimetro con la pelle dorsale dell&#39;animale garantire che il 1 cm2 turno aperture è completamente premuto sulla pelle. Prendere almeno tre misurazioni distinte in diverse aree della pelle dorsale. </li><li> Calcola medio di L * punteggio ± SD per animale e per gruppo di trattamento. Colorimetria riflettente può essere fatto in qualsiasi punto nell&#39;esperimento. </li></ol> 5. Determinazione della sensibilità UV da Calcolo di &quot;Minimal eritematosa Dose&quot; (MED) <ol><li> Utilizzare animali che sono stati pre-trattati con veicolo o forskolina come descritto sopra. Anestetizzare gli animali con l&#39;iniezione intraperitoneale di una miscela standard di ketamina e xilazina (vedi sopra). </li><li> Preparare un pezzo di nastro UV-occlusiva per il test MED. Per generare buchi nel nastro, usare un buco pugno pesante con un 1 cm 2 ritaglio circolare (Figure 2A e B). Avere fori di dimensioni definite e disposizione simmetrica nel nastro facilita il riconoscimento di alterazioni cutanee dopo l&#39;irradiazione. Più di ogni foro nel nastro, applicare una piccola ma facilmente staccabile pezzo<html> di nastro che può essere rimosso in tempi definiti durante l&#39;esposizione UV per consentire la somministrazione di dosi UV diversi. </li><li> Una volta che gli animali siano adeguatamente sedato, posizionare il nastro sulla superficie dorsale. Lubrificante occhio deve essere sempre utilizzato sotto anestesia. </li><li> Accendere la sorgente UV costituito da due Westinghouse F15T8UV-B lampade con una potenza massima di 313 nm e una gamma di 280-370 nm. Lasciare che la lampada raggiunga la un&#39;uscita UV costante come misurato da un fotometro UV con un sensore UVB (richiede in genere un paio di minuti per le lampade per riscaldare). </li><li> Sulla base della velocità di trasmissione UV misurata dal fotometro UV, calcolare il tempo di esposizione UV per ogni dose desiderata. Ad esempio, le misure di uscita della nostra lampada UVB 2,4 mW / cm 2. Pertanto, per amministrare 5 kJ / m 2, la pelle dovrebbe essere esposto a 208 sec (che è 3 min e 28 sec) di radiazione UVB, calcolata di seguito: upload/50670/50670eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Posizionare animali sedati (ciascuna con nastro occlusiva in luogo) ventrale superficie fino a garantire l&#39;esposizione anche ai raggi UV. Per amministrare le dosi scelte di radiazioni UV, in sequenza rimuovere i piccoli nastri occlusive che coprono i fori per esporre uno centimetri 2 zone di pelle alle corrette dosi di radiazioni. Pertanto, usando l&#39;esempio precedente, se il 40 kJ / m 2 è la più grande dose di nell&#39;esperimento, poi l&#39;animale sarebbe sotto la lampada per 27 min e 47 sec totale e la pelle nella condizione 40 kJ / m 2 avrebbe alcun sovrastante il nastro tutto il tempo. Tuttavia, nastro sovrastante la condizione 5 kJ / m 2 verrebbe eliminato quando c&#39;è 208 sec rimanente nella esposizione. Tempo di rimozione del nastro dovrebbe essere fatto in modo tale che ciascuna condizione termina contemporaneamente. </li><li> Dopo l&#39;esposizione ai raggi UV, staccare il nastro dalla pelle dorsale con attenzione, facendo attenzione a non strappare la pelle con movimenti bruschi o eccessivamente forti. Mettere gli animali in un luogo caldo e tranquillo per consentirerecupero dall&#39;anestesia. </li><li> Controllo topi per 24-48 ore a cercare le zone discrete di eritema (arrossamento) o edema (gonfiore) corrispondenti ai siti anatomici trattati con la dose specifica di irradiazione UV. Documentare i risultati della pelle fotograficamente. </li><li> MED valore corrisponde alla dose minima di UV che causa l&#39;infiammazione come definito da eritema e / o edema dell&#39;intero cerchio di pelle esposta. Si noti che la pigmentazione della pelle può impugnare la determinazione del MED, tuttavia, eritema ed edema possono ancora generalmente essere valutati con precisione, grazie anche alla forma definita delle aperture del nastro durante l&#39;esposizione ai raggi UV. </li></ol> 6. Analisi statistica Analizzare i dati tra coorti di topi da una ANOVA con test post Bonferroni (grafico Pad Prism). Valori di p &lt;0,05 sono considerati statisticamente significativi.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Utilizzando un modello animale dell&#39;essere umano pelle chiara, troviamo che l&#39;applicazione topica di un estratto di radice di greggio ricco di forskolina scurisce con fermezza l&#39;epidermide stimolando la produzione di melanina nella pelle. Epidermal melanizzazione dipende dalla espressione del fattore di cellule staminali nell&#39;epidermide basali, come avviene in pelle umana ma non in pelle geneticamente modificato mouse. La pelle dorsale di topi geneticamente modificato manca un numero sufficiente di melan...

L&#39;incidenza del melanoma, la forma più letale di cancro della pelle, è aumentato drasticamente negli ultimi decenni negli Stati Uniti, in particolare tra gli individui di pelle chiara. Prova molecolare ed epidemiologiche forte implica radiazioni UV come un importante fattore ambientale causale 2-5. Esposizione ai raggi UV Aumento in forma di esposizione al sole e l&#39;uso lettino abbronzante è probabile che sia responsabile di gran parte degli aumenti di incidenza melanoma 6-7. Rischio di melanoma sembra particolarmente legata scottature 8, in particolare quelli in giovane età 9-10. Rischio di scottature è legata non solo alla dose e intensità di esposizione UV, ma anche da fattori ereditari che influenzano reazione cutanea alle radiazioni UV. Pigmentazione della pelle è uno dei fattori determinanti più importanti di sensibilità ai raggi UV, il rischio di scottature e rischio di cancro. Il melanoma si verifica circa venti volte più spesso nelle persone di pelle chiara rispetto a individua pelle scuraLS 11-13. La melanina, un pigmento prodotto dai melanociti nell&#39;epidermide, è il principale determinante della carnagione. La melanina viene in due varietà principali: (1) eumelanina, un marrone / nero pigmento scuro efficace per assorbire l&#39;energia della radiazione UV, e (2) Feomelanine, un rossastro / pigmento bionda meno efficace ad impedire la penetrazione di fotoni UV nella pelle. Il colore della pelle, la sensibilità ai raggi UV e rischio di melanoma sono in gran parte determinate dal contenuto epidermica eumelanina 14-15. Eumelanina più nell&#39;epidermide, meno fotoni UV può penetrare nella pelle. A causa dei bassi livelli innate di eumelanina, individui dalla pelle chiara sono molto più inclini a effetti acuti e cronici delle radiazioni UV 16-18. Pigmentazione della pelle, rischio di melanoma e la capacità di &quot;tan&quot; dopo l&#39;esposizione ai raggi UV tutto correlano con la capacità di segnalazione del recettore melanocortina 1 (MC1R), G s-coupled sette transmembrana srecettore urface su melanociti 19-22. Quando MC1R vincola il suo affine ligando ad alta affinità, α-melanocita ormone stimolante (α-MSH), vi è l&#39;attivazione di adenilato ciclasi e la produzione del secondo messaggero cAMP 23. La normale risposta fisiologica della pelle dopo l&#39;esposizione UV comprende la produzione epidermica di α-MSH dai cheratinociti 24-29. Noi e altri ipotizziamo che cheratinociti derivata α-MSH lega a MC1R su melanociti epidermici, avviando la produzione a valle del secondo messaggero cAMP attraverso l&#39;attivazione di adenilato ciclasi 30. livelli di cAMP controllano molti aspetti di differenziazione dei melanociti, comprese le vie di sopravvivenza, la riparazione del DNA e la sintesi del pigmento. Segnalazione MC1R e cAMP inducono chiaramente i livelli degli enzimi del pigmento e la produzione di eumelanina. Quando la segnalazione MC1R è intatto e livelli di cAMP melanocitici sono robusti, eumelanina viene prodotta e la pelle si scurisce. Tuttavia, se la segnalazione MC1R è difettoso elivelli di cAMP citoplasmatici restano bassi, feomelanina è prodotto invece 1. Sintesi di eumelanina può essere stimolata farmacologicamente da agenti che aumentano i livelli di cAMP 1,14,31-35. Poiché la proteina MC1R è un importante regolatore del rischio di melanoma negli esseri umani 36-46, siamo interessati a meccanismi attraverso i quali MC1R protegge contro i melanociti carcinogenesi indotta da UV. Come base per i nostri studi, abbiamo generato un MC1R-variante di modello murino transgenico su un C57BL / 6 background genetico puro 1. In questo modello, fattore delle cellule staminali (SCF) è costitutivamente espressa nell&#39;epidermide basali e melanociti epidermici interfollicolari vengono mantenuti nella pelle per tutta la vita 47, in contrasto con i topi non transgenici in cui melanociti localizzare al derma nei follicoli piliferi. Con il transgene K14-Scf incorporato, la epidermide diventa pigmentato con la particolarità melanina pigmenti del pigmentoceppo degli animali 1. topi K14-SCF sullo sfondo genetico C57BL / 6 con il tipo selvatico segnalazione MC1R avere la pelle nerissima caratterizzata da livelli molto elevati di pigmento eumelanina. Non sorprendentemente, questi animali sono altamente resistente ai raggi UV. Al contrario, geneticamente abbinati K14-SCF C57BL / 6 animali che ospitano un mutante inattivo MC1R non hanno quasi alcun eumelanina nell&#39;epidermide. Invece, questi animali &quot;estensione&quot; (MC1R e / e) hanno una carnagione chiara della pelle causata da deposizione di pigmento feomelanina (Figura 1A) e sono molto più UV-sensitive 48-49. Composti farmacologici con proprietà chimiche che consentono la penetrazione nella pelle hanno mostrato di indurre potentemente eumelanina nell&#39;estensione (MC1R e / e) K14-Scf modello animale manipolando direttamente i livelli di cAMP in melanociti epidermici nella pelle. La melanina upregulation in questo modello è stato reported dall&#39;attivazione ciclasi 1 nonché della fosfodiesterasi 4 inibizione 35. In questo articolo, dimostriamo la preparazione e l&#39;applicazione topica di forskolina in estensione (MC1R e / e) animali K14-SCF quale modello umano UV-sensitive pelle chiara. Abbiamo dimostrato che l&#39;applicazione due volte al giorno del farmaco promuove melanizzazione accelerata, che oscuramento della pelle è dovuto alla epidermica deposizione di pigmento melanina e quella indotta melanina epidermica protegge contro le scottature solari UV-indotta attraverso la misurazione di &quot;dose minima eritematosa&quot; (MED) 48.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coleus Forskoli extract 20%</td>
			<td>Buckton Scott USA Inc. </td>
			<td>n/a</td>
			<td>Princeton, NJ</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isothesia, Isoflurane , USP</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>NCD 11695-6776-1</td>
			<td>Dublin, OH, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Anased Injection</td>
			<td>LA04612</td>
			<td>Shenandoah, Iowa, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine HCl, USP</td>
			<td>Putney</td>
			<td>NDC 26637-411-01</td>
			<td>St. Joseph, MO, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs.</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Adesco</td>
			<td>05751L</td>
			<td>Solon, OH, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Depilatory cream, Nair</td>
			<td>Church &amp; Dwight</td>
			<td>JF-11 4381322</td>
			<td>Priceton, NJ</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Germicidal Hg Lamp UV-B</td>
			<td>Westinghouse</td>
			<td>F15T8UV-B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Radiometer photometer</td>
			<td>International light</td>
			<td>1LT400A</td>
			<td>Peabody, MA,USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chromameter</td>
			<td>Konica Minolta</td>
			<td>CR-400</td>
			<td>Ramsey, NJ, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Data Processor for 	Chromameter CR-400</td>
			<td>Konica Monilta</td>
			<td>DR-400</td>
			<td>Ramsey, NJ, USA</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

pharmacologic induction of epidermal melanin and protection against sunburn in a humanized mouse model

Correttezza di pelle, sensibilità UV e rischio di cancro della pelle tutti correla con la funzione fisiologica del recettore melanocortina 1, una proteina di segnalazione G s-accoppiato trova sulla superficie dei melanociti. MC1R stimola ciclasi e produzione di cAMP che, a sua volta, up-regola la produzione melanocitico di melanina nella pelle. Al fine di studiare i meccanismi attraverso i quali la segnalazione MC1R protegge la pelle contro i danni UV, questo studio si basa su un modello di topo con la &quot;pelle umanizzato&quot;, basato sulla espressione epidermica di fattore della cellula staminale (SCF). K14-SCF topi transgenici mantengono melanociti nel epidermide e quindi hanno la possibilità di depositare melanina nell&#39;epidermide. In questo modello animale, di tipo selvaggio risultati dello stato MC1R in robusto deposizione di nero eumelanina pigmento e un fenotipo con protezione UV. Al contrario, gli animali K14-SCF con difettoso segnalazione MC1R capacità presentano una pigmentazione rossa / bionda, molto poco eumelanina nella pelle eun fenotipo sensibile ai raggi ultravioletti. Ragionamento che eumelanina deposizione potrebbe essere rafforzato da agenti topici che imitano la segnalazione MC1R, abbiamo scoperto che l&#39;applicazione diretta di estratto forskolina alla pelle di MC1R-difettoso topi di carnagione chiara provocato induzione eumelanina robusto e protezione UV 1. Qui si descrive il metodo per la preparazione e l&#39;applicazione di un estratto di radice naturale forscolina contenente al K14-SCF topi con la pelle chiara e segnalare un metodo per misurare la sensibilità ai raggi UV determinando la dose minima eritematosa (MED). Utilizzando questo modello animale, è possibile studiare come induzione epidermica cAMP e melanizzazione della pelle influiscono risposte fisiologiche all&#39;esposizione UV.

C57BL / 6 topi sono stati generati su sfondi eumelanotic, pheomelanotic o amelanotici incorporano il transgene K14-SCF come descritto (Figura 1A). Coorti di estensione carnagione chiara (MC1R e / e, Tyr + / +) topi sono stati trattati per via topica con dosi due volte al giorno di entrambi i veicoli (70% etanolo, 30% glicole propilenico) o del 40% di estratto di Coleus forskohlii radice di greggio (80 micron per dose) per 5 giorni (Figura 2B). Eff...

Watch this Scientific Journal Video about Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model at JoVE.com

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

Melanina epidermica è indotta mediante applicazione topica di forskolina in un modello murino di umano UV-sensitive pelle chiara. Manipolazione farmacologica dei livelli di cAMP nella pelle e dell&#39;epidermide oscuramento fortemente a proteggere contro l&#39;infiammazione UV-mediata (scottature), come misurato dalla dose minima eritematosa (MED) dosaggio.

Induzione farmacologica di melanina epidermica e di protezione contro le scottature in un modello di topo umanizzato

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

pharmacologic-induction-epidermal-melanin-protection-against-sunburn

Research

JoVE Journal

Medicine

18.0K Views.  University of Kentucky College of Medicine.  Melanina epidermica è indotta mediante applicazione topica di forskolina in un modello murino di umano UV-sensitive pelle chiara. Manipolazione farmacologica dei livelli di cAMP nella pelle e dell'epidermide oscuramento fortemente a proteggere contro l'infiammazione UV-mediata (scottature), come misurato dalla dose minima eritematosa (MED) dosaggio. 

Video: Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Un modello murino di Nell&#39;utero Trapianto

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Ricerca

Medicina

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotone Imaging di invasione delle cellule tumorali in un modello di mouse ortotopico di carcinoma orale a cellule squamose

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

L&#39;immunoterapia sublinguale come alternativa di indurre una protezione contro le infezioni respiratorie acute

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. Females are disproportionately afflicted by UTI: 50% of all women will have a UTI in their lifetime. Additionally, 20-40% of these women who have an initial UTI will suffer a recurrence with some suffering frequent recurrences with serious deterioration in the quality of life, pain and discomfort, disruption of daily activities, increased healthcare costs, and few treatment options other than long-term antibiotic prophylaxis. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) is the primary causative agent of community acquired UTI. Catheter-associated UTI (CAUTI) is the most common hospital acquired infection accounting for a million occurrences in the US annually and dramatic healthcare costs. While UPEC is also the primary cause of CAUTI, other causative agents are of increased significance including Enterococcus faecalis. Here we utilize two well-established mouse models that recapitulate many of the clinical characteristics of these human diseases. For UTI, a C3H/HeN model recapitulates many of the features of UPEC virulence observed in humans including host responses, IBC formation and filamentation. For CAUTI, a model using C57BL/6 mice, which retain catheter bladder implants, has been shown to be susceptible to E. faecalis bladder infection. These representative models are being used to gain striking new insights into the pathogenesis of UTI disease, which is leading to the development of novel therapeutics and management or prevention strategies.

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work&#8217;s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Istituzione e caratterizzazione di UTI e CAUTI in un modello murino

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic differentiation and immune function of the genetically modified cells. The humanized Bone-marrow/Liver/Thymus (BLT) mouse model allows for full reconstitution of a human immune system in the periphery, which includes T cells, B cells, NK cells and monocytes. The human thymic implant also allows for thymic selection of T cells in autologous thymic tissue. In addition to the study of HIV infection, the model stands as a powerful tool to study differentiation, development and functionality of cells derived from hematopoietic stem cells (HSCs). Here we outline the construction of humanized non-obese diabetic (NOD)-severe combined immunodeficient (SCID)-common gamma chain knockout (c&#947;-/-)-Bone-marrow/Liver/Thymus (NSG-BLT) mice with HSCs transduced with CD4 chimeric antigen receptor (CD4CAR) lentivirus vector. We show that the CD4CAR HSCs can successfully differentiate into multiple lineages and have anti-HIV activity. The goal of the study is to demonstrate the use of NSG-BLT mouse model as an in vivo model for engineered immunity against HIV. It is worth noting that, because lentivirus and human tissue is used, experiments and surgeries should be performed in a Class II biosafety cabinet in a Biosafety Level 2 (BSL2) with special precautions (BSL2+) facility.

This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.

Cellule staminali base Immunità Engineered contro l&#39;infezione da HIV nel modello umanizzato mouse

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

Generazione di un umanizzato mouse Fegato Utilizzando epatici umani cellule staminali

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Induzione di aterosclerosi accelerata nei topi: il modello "Wire-Injury"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions between cellular and non-cellular blood components during thrombus formation, reliable studies of the physiology and pathophysiology of thrombosis can only be performed in vivo. Therefore, this article presents an ear model in hairless mice and focuses on the in vivo analysis of microcirculation, thrombus formation, and thrombus evolution. By using intravital fluorescence microscopy and the intravenous (iv) application of the respective fluorescent dyes, a repetitive analysis of microcirculation in the auricle can easily be performed, without the need for surgical preparation. Furthermore, this model can be adapted for in vivo studies of different issues, including wound healing, reperfusion injury, or angiogenesis. In summary, the ear of hairless mice is an ideal model for the in vivo study of skin microcirculation in physiological or pathophysiological conditions and for the evaluation of its reaction to different systemic or topical treatments.

The ear model of the hairless SKH1-Hrhr mouse enables intravital fluorescence microscopy of microcirculation and phototoxic thrombus induction without prior surgical preparation in the examined microvascular bed. Therefore, the ear of the hairless mouse is an excellent in vivo model to study the complex interactions during microvascular thrombus formation, thrombus evolution, and thrombolysis.

Intravitale Microscopia e Trombo induzione nel lobo di un mouse Hairless

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have been established by tamoxifen induced deletion of Ccm genes in postnatal animals. These mouse models provide invaluable tools to investigate molecular mechanism and therapeutic approaches for CCM disease. An accurate and quantitative method to assess lesion burden and progression is essential to harness the full value of these animal models. Here, we demonstrate the induction of CCM disease in a mouse model and the use of the contrast enhanced X-ray micro computed tomography (micro-CT) method to measure CCM lesion burden in mouse brains. At postnatal day 1 (P1), we used 4-hydroxytamoxifen (4HT) to activate Cre recombinase activity from the Cdh5-CreErt2 transgene to cleave the floxed allele of Ccm2. CCM lesions in mouse brains were analyzed at P8. For micro-CT, iodine based Lugol&#39;s solution was used to enhance contrast in brain tissue. We have optimized the scan parameters and utilized a voxel dimension of 9.5 &#181;m, which lead to a minimum feature size of approximately 25 &#181;m. This resolution is sufficient to measure CCM lesion volume and number globally and accurately, and provide high-quality 3-D mapping of CCM lesions in mouse brains. This method enhances the value of the established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for CCM and other cerebrovascular diseases.

This protocol demonstrates the induction of cerebral cavernous malformation disease in a mouse model and uses contrast enhanced micro computed tomography to measure lesion burden. This method enhances the value of established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for cerebral cavernous malformation and other cerebrovascular diseases.

Induzione e Micro-CT Imaging delle malformazioni cavernose cerebrali nel modello del topo

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...