Questo metodo può essere utile nello sviluppo di cosmetici funzionali e agente cutaneo con attività anti-melanogeniche. È lì per funzionare e il risultato può essere ottenuto rapidamente. Inoltre, questo metodo può essere utile per i ricercatori, che vogliono identificare o indagare gli effetti o i composti o indagare le attività antimelanogene o promelanogeniche.
Per misurare l'attività della tirosinasi iniziare seminando melanicidi B16-F10 a cinque volte 10 alla quarta cella per pozzo di una concentrazione di 24 piastre di pozzo in mezzo completo per 24 ore in un incubatore di coltura cellulare. Il giorno successivo, sostituire il supernatante in ogni pozzo con DMEM integrato con un composto di prova e un controllo inibitore appena preparati o un controllo negativo e restituire la piastra all'incubatore per altre 72 ore. Al termine del trattamento sciacquare i pozzi due volte con 300 microlitri di pb freddi per pozzo e posizionare la piastra sul ghiaccio.
Aggiungere quindi 300 microlitri di tampone di lisi a ciascun pozzo utilizzando un raschietto cellulare per raccogliere i liscivi cellulari dopo cinque minuti. Trasferire le sospensioni di particelle cellulari risultanti su singoli tubi di micro-centrifuga da 1,5 millilitri. E omogeneizzare i lisati tre volte per due secondi a 14.500 giri/min sul ghiaccio per rilasciare la tirosinasi intercellulare.
Pellettare i detriti cellulari mediante centrifugazione e trasferire i supernatanti su singoli tubi di centrifuga da 1,5 millilitri sul ghiaccio. Assegnare 70 microlitri di ogni supernatante a singoli pozzi di una micro piastra di polistirolo chiara da 96 polietilene e aggiungere 140 microlitri di soluzione di substrato tirosinasi ad ogni pozzo di supernatante. Scuotendo delicatamente la piastra per mescolare il contenuto del pozzo.
Quindi incubare il piatto a 37 gradi Celsius per due ore. E misurare l'attività della tirosinasi a 475 nanometri su un lettore di micropiastrine. Misurare il contenuto di melanina delle cellule dopo aver raccolto il lysate delle cellule trattate come dimostrato.
Raccogliere i lisati mediante centrifugazione e trasferire i supernatanti su nuovi tubi. Aggiungere 300 microlitri di un normale idrossido di sodio a ciascun pellet per un'incubazione di un'ora a 60 gradi Celsius. Seguito dalla centrifugazione delle sospensioni cellulari disciolte.
Quindi trasferire 200 microlitri dei supernatanti in ogni pozzo di una piastra di 96 pozza. E misurare il contenuto di melanina su un lettore di micropiastrine a una lunghezza d'onda di 400 nanometri. Per fontana-masson colorazione, lavare le cellule trattate due volte con 300 microlitri di pb freddi e fissare le cellule con 200 microlitri del 10% di formalina per un'ora a quattro gradi Celsius.
Risciacquare le cellule spesse con acqua distillata e aggiungere 200 microlitri da 58 a 68 gradi Celsius soluzione di lavoro in argento ammoniacale ad ogni pozzo. Per un'ora di incubazione a 37 gradi Celsius o fino a quando le cellule diventano di colore giallo-marrone. Risciacquare le celle macchiate con acqua distillata seguita da un'incubazione di due minuti in cloruro d'oro allo 0,1% a temperatura ambiente.
Risciacquare le cellule trattate con cloruro d'oro con acqua distillata e aggiungere alle cellule 200 microlitri di soluzione di tiosalfato di sodio. Dopo due minuti sciacquare di nuovo le cellule. Ed etichettare le cellule con 200 microlitri di rosso veloce nucleare per pozzo per cinque minuti.
Quindi lavare le celle macchiate con acqua del rubinetto prima di eseguire l'imaging al microscopio leggero. Per l'analisi della soglia, aprite le immagini nell'immagine J e selezionate l'immagine, regolate e la soglia di colore. Per misurare l'area macchiata con Fontana Masson impostare la barra dei parametri di luminosità su zero e regolare la luminosità nel punto in cui sono incluse tutte le celle macchiate nere o marroni.
Selezionare Analizza e analizza particelle e selezionare la casella riepiloga nella finestra Analizza particelle, quindi fare clic su OK per ottenere un riepilogo dei risultati e copiare e incollare i dati in un foglio di calcolo. Il trattamento con arbutina sopprime significativamente l'attività della tirosinasi cellulare rispetto alle cellule trattate con veicoli di controllo. Allo stesso modo il contenuto di melanina delle cellule stimolate con Arbutin è significativamente ridotto rispetto ai controlli.
Sebbene le cellule siano morfologicamente simili tra i gruppi di trattamento, Arbutin diminuisce l'area del pigmento nero rispetto alle cellule trattate di controllo. Questo metodo è utile per lo screening delle attività utilizzando la nostra libreria composta. Ci sono oltre centinaia di campioni da testare rapidamente.
Inoltre questo metodo può anche essere utilizzato per indagare il meccanismo che coinvolge la melanogenesi. Dopo che i candidati bioattivi sono stati identificati i composti, per la loro testimonianza dello studio dei meccanismi biologici o delle applicazioni commerciali.
