La coltura primaria delle cellule neuronali è un sistema modello ideale per studiare i neuroni dissociati nella coltura in vitro. Il vantaggio di utilizzare questo metodo è essere in grado di mantenere le caratteristiche cellulari delle cellule dissociate, come meccanismi, funzioni e morfologia in condizioni in vitro per alcune settimane il più vicino possibile alle condizioni in vivo. Mettere i coperchi rotondi in una piastra da 24 po 'sotto l'armadio della biosicurezza.
Aggiungere 90 microlitri di poli-L-ornitina su ogni slittamento di copertura. Chiudere il cappuccio e posizionare delicatamente la piastra nell'incubatore di 37 gradi per due giorni. Preparare il terreno di coltura e il mezzo di semina e mantenerli a quattro gradi Celsius.
Preparare la soluzione di tripina di lavoro in DMEM/F12 e mantenerla a quattro gradi. Posizionare il mezzo di coltura e il mezzo di semina nell'incubatore a 37 gradi. Togliere la piastra da 24 pozzi dall'incubatrice.
Lavare il coperchio scivola tre volte con doppia acqua distillata. Lasciare asciugare completamente il coperchio per almeno due ore. Preparare tre piastre di Petri piene di PBS freddo, tre piastre di Petri piene di HBSS freddo e cinque piastre di Petri piene di mezzo di dissezione fredda sul ghiaccio.
Asporta le corna uterine e lavatele in PBS freddo tre volte sul ghiaccio. Da qui tutti i passaggi dovrebbero essere eseguiti sul ghiaccio per ridurre al minimo i danni ai tessuti. Dopo l'ultima fase di lavaggio, separare i cuccioli dall'utero in HBSS e trasferirli nel mezzo di dissezione fredda.
Nel mezzo di dissezione, decapitare i cuccioli con le forbici. Aprire il calvario dal foramen magnum al bordo inferiore della cavità orbitale. Usando un paio di forcep fini, rimuovere la base del cranio e rimuovere il cranio dal cervello.
Rimuovere con cura le meningi del cervelletto partendo dalla superficie laterale del peduncolo cerebellare centrale e dei pons. Tagliare entrambi i peduncoli cerebellari e separare il cervelletto dal resto del cervello. Posizionare immediatamente la cerebella raccolta in un tubo conico sterile da 15 ml riempito con DMEM/F12 sul ghiaccio.
Centrifugare il tubo a 1.000 g a quattro gradi per un minuto in DMEM/F12. Ripetere questa procedura tre volte, rimuovendo delicatamente il supernatante con una pipetta e sospendendo il pellet in DMEM/F12 fresco. Aggiungere due millilitri di tripina prerischiata e pipettare delicatamente per mescolarli insieme.
Posizionare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi per 12 minuti. Dopo l'incubazione, portare il tubo nell'armadio di sicurezza e aggiungere 10 ml di DMEM/F12 per inattivare la tripina. Centrifugare la miscela a 1.200 g per cinque minuti.
Scartare il supernatante e resuspend in mezzo fresco seguito da centrifugazione tre volte. Pre-bagnare una pipetta di plastica sterile con DMEM/F2. Aggiungere 3,5 millilitri di soluzione di lavoro DNAsi allo stesso tubo.
Triturare il tessuto con una pipetta più volte fino a quando il fluido raggiunge un colore lattinoso omogeneo. Aggiungere 10 mL di DMEM/F12 freddo alla miscela e procedere alla centrifuga. Centrifugare il campione a 1.200 g a quattro gradi per cinque minuti.
Rimuovere con cura il supernatante senza disturbare il pellet. Rimuovere il mezzo di semina dall'incubatore. Aggiungere 500 microlitri di mezzo di semina prebellico e mescolarlo bene utilizzando la pipetta.
Contare le cellule usando un emocitometro. Diluire la sospensione cellulare con mezzo di semina a una densità di 500.000 cellule per millilitro. Aggiungere 90 microlitri della miscela ad ogni pozzo al centro del coperchio.
Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi per tre o quattro ore. Dopo l'incubazione, aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura prebellico in ogni pozzo. Sostituire la piastra nell'incubatore a 37 gradi.
Dopo sette giorni, sostituire il vecchio mezzo con un mezzo di coltura fresco II.Preparare una piastra separata da 24 porri con la corrispondente organizzazione numerica e aggiungere 100 microlitri di PFA 4% a ciascun pozzo. Dopo i giorni desiderati in coltura, rimuovere delicatamente i coperchi dai pozzi della piastra di coltura originale e posizionarli nei pozzi corrispondenti della piastra PFA descritti nel passaggio precedente. Aggiungere PFA ai pozzali per immergere completamente i coperchi.
Mantenere la piastra PFA a quattro gradi per 30-120 minuti. Dopo l'incubazione, ripristinare la piastra a temperatura ambiente. Lavare il coperchio scivola delicatamente con PBS per cinque minuti tre volte.
La figura due del testo mostra la coltura cellulare cerebellare a partire dall'E18. L'immunofluorescenza per la calbindina mostra i neuroni Purkinje con estensioni assonali di tre giorni in vitro. Da sette a 10 giorni in vitro, i processi dendritici sono evidenti.
A 21 giorni sono presenti rami dendritici complessi. La figura tre del testo mostra le colture cellulari cerebellari a partire da vari giorni embrionali. il rilevamento dell'immunofluorescenza della calbindina mostra i neuroni Purkinje con assoni precoci solo dopo 18 giorni in vitro.
Le culture neuronali purkinje iniziate da E14 ed E15 svilupperanno dendriti, ma mai così complesse come quelle che si sviluppano quando L'E18 è il punto di partenza. La figura quattro del testo mostra che diversi tipi di cellule si sviluppano dalle colture E18 dopo 21 giorni in vitro. L'immunofluorescenza verde calbindina mostra i neuroni purkinje.
L'immunofluorescenza rossa per la parvalbumina in B e C mostra internanti inibitori. L'immunofluorescenza rossa per il canale di tensione del sodio in E e F mostra i neuroni granuli. Il presente protocollo è economico e facile da condurre.
Alla fine di questo video, sarai in grado di raccogliere e coltura i neuroni cerebellari e risolverli ai DIV desiderati.
