Il protocollo studia i neuroni dei granuli cerebellari attraverso diverse fasi di sviluppo al fine di visualizzare la crescita morfologica chiave. I vantaggi della tecnica includono il targeting specifico delle cellule, la rapida espressione dei costrutti trasfettati e l'etichettatura sparsa delle cellule che consente lo studio degli effetti autonomi delle cellule. Iniziare tagliando un segmento di 11,2 millimetri dalla punta di una pipetta di carico e posizionare la parte tagliata sulla punta della siringa Hamilton come distanziatore per limitare la profondità di iniezione a 1,5 millimetri.
Fissare il distanziatore sulla punta della siringa con adesivo o parafilm. Per studiare la morfologia di singoli CGN elettroporati da sezioni cerebrali sagittali del cucciolo sperimentale, prendere immagini Z-stack a 0,5 micrometri per pila su un microscopio confocale. Immagine di una cella per finestra dell'immagine per consentire una facile analisi delle immagini e la ricostruzione 3D.
Analizza la lunghezza dei neuriti e la formazione dell'artiglio dendritico in cieco usando un semplice tracciante di neuriti. Carica immagini Z-stack a canale singolo di CGN elettroporate nelle Fiji e fai clic su Plugins"Segmentation" e Simple Neurite Tracer"Select Create New 3D Viewer" dal menu a discesa. Scorrere fino alla base di un dendrite che si collega al soma cellulare e iniziare un percorso facendo clic sulla giunzione.
Tracciare manualmente il percorso facendo clic sulle sezioni in cui il segnale di riempimento della cella è più luminoso e premendo Y per mantenere la traccia. Traccia fino alla fine del dendrite e conferma il percorso premendo F.In alternativa, traccia fino alla base dell'artiglio. Quindi, traccia l'artiglio dalla base della struttura fino alla fine del neurite più lungo.
Traccia i rami secondari e terziari tenendo premuto CTRL su Windows o ALT su macOS e facendo clic sul percorso. Confermare il percorso premendo F.Osservare che le misurazioni per le tracce sono visibili in una finestra separata. Sommare tutte le dimensioni dei rami dell'artiglio per ottenere la lunghezza totale per ciascun artiglio.
Nell'analisi rappresentativa, le immagini di proiezione di CGN elettroporate da 3 a 14 giorni dopo l'iniezione hanno mostrato una progressiva diminuzione del numero di dendriti. I CGN hanno subito una fase di crescita dendritica seguita da un affinamento da 3 DPI a 7 DPI che ha portato alla potatura di oltre il 50% dei dendriti in eccesso. Questo evento coincide con il graduale allungamento delle pergole rimanenti nella formazione di strutture simili ad artigli alla fine di ogni dendrito, indicando che questi processi di sviluppo stanno avvenendo contemporaneamente.
Con 7 DPI, gli artigli sono stati trovati su circa il 75% dei dendriti. Ogni CGN marcato è stato ricostruito in NMRS per quantificare l'area superficiale somato-dendritica totale e il volume. Non è stata osservata alcuna differenza significativa nelle dimensioni della CGN durante lo sviluppo.
Sebbene a 7 DPI, i CGN hanno mostrato una significativa diminuzione del 20% del volume rispetto a 3, 5 e 10 DPI. La cosa più importante nella procedura è individuare con precisione il cervelletto prima dell'iniezione. Il metodo può essere adattato per manipolare geneticamente i geni in vivo per studiare il loro ruolo nello sviluppo dei neuroni granuli mediante trasfezione di shRNA, siRNA o Cre Recombinasi.
