Name: mirna expression analyses in prostate cancer clinical tissues
Uploaded: 2015-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
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Ringraziamo il Dr. Roger Erickson per il suo sostegno e assistenza alla preparazione del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Cancer Institute presso il National Institutes of Health (Grant Numero RO1CA177984, RO1CA138642), progetto del programma VA sul cancro alla prostata (BX001604).

Campioni freschi cancro alla prostata congelato fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) o sono stati ottenuti dalla SFVAMC. Campioni di pazienti con cancro alla prostata sottoposti a prostatectomia radicale a SFVAMC. Consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti e lo studio è stato approvato dal Comitato UCSF per la ricerca umana. In alternativa, tessuti di cancro alla prostata microarray sono stati acquistati da fonti commerciali e utilizzati per le analisi da miRNA ISH. Informazioni clinicopatologica e follow-up per i pazienti affetti da cancro alla prostata analizzati sono stati raccolti. 1. I campioni di tessuto <ol><li> Tagliare campioni di tessuto del cancro della prostata in 10 sezioni micron utilizzando un microtomo e macchia con H &amp; E seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Commenta vetrini colorati per l&#39;identificazione del cancro alla prostata foci così come adiacente normale epitelio ghiandolare. Nota: Una scheda certificata patologo dovrebbe rivedere le diapositive H &amp; E macchiato e mark per tumore e aree normali. Utilizzare le diapositive contrassegnate come guide in successive sezioni per miRNA analisi da tumore vs aree normali. </li></ol> 2. Le analisi di espressione di miRNA Quantitative Real-time PCR Nota: Questo flusso di lavoro prevede le seguenti fasi: cattura microdissezione laser, isolamento di RNA totale (compresi i miRNA e mRNA), il saggio dei miRNA maturi utilizzando i saggi di espressione TaqMan MicroRNA come dettagliato nelle sezioni seguenti. <ol><li> RNA Estrazione <ol><li> Isolamento di miRNA da cancro della prostata FFPE tessuti <ol><li> Microdissezione laser (LCM) Nota: Eseguire i passi 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 in una cappa. <ol><li> Preparare vetrini di tessuto (10 sezioni micron) per LCM. Deparrafinize sezioni di tessuto di immersione in xilene (2x), per 10 minuti ciascuno, quindi reidratare i tessuti incubando i vetrini per 5 minuti ciascuna in etanolo graduata (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) seguita da distillata acqua(5 minuti). </li><li> A seguito di reidratazione, sezioni macchia con ematossilina per 30 secondi seguiti da acqua. </li><li> Inserire tessuti in etanolo graduata (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (5 min ciascuna) e xilene (5 min). </li><li> Scivoli asciutti in una cappa aspirante e quindi inserire nello strumento LCM per microdissezione. </li><li> Eseguire microdissections con il sistema LCM conformemente alle istruzioni del produttore 24. Usa patologo marcato diapositive come guide per l&#39;identificazione di cancro alla prostata foci così come il tessuto normale adiacente. Utilizzare il raggio laser ad una 10-20 impulsi diametro micron con una potenza di 70-90 mW. </li><li> Cattura aree di interesse con impulsi laser infrarossi sui tappi LCM. Combina le celle da 2-5 tappi per l&#39;estrazione di miRNA per campione. Per garantire l&#39;integrità di RNA estratto, immediatamente elaborare cellule catturate per l&#39;estrazione miRNA. </li><li> In alternativa, le cellule Lisare nel buffer di estrazione miRNA (secondo il protocollo del produttore) e store lisati a -80 ° C. </li></ol></li><li> miRNA Estrazione e analisi da LCM microdissezione tessuti <ol><li> Estratto RNA totale da tessuti FFPE microdissezione utilizzando un kit commerciale seguendo le istruzioni del produttore. Nota: La resa di RNA da cattura laser miscrodissection è tipicamente basso. Pertanto, l&#39;RNA viene eluito in volumi bassi (20-30 mL) e utilizzato per la profilazione espressione utilizzando Taqman microRNA saggi di espressione seguito le istruzioni del produttore (anche descritto nella sezione 2.2). Ottimizzazione di ingresso dell&#39;RNA per PCR real time il rilevamento dei miRNA maturi suggerisce che 5 ml di RNA eluizione è ottimale per ogni reazione di trascrizione inversa specifici miRNA-. Come un controllo endogeno, è usato RNU48 / RNU24. Per le reazioni di controllo, 2 microlitri del RNA eluito viene utilizzato per la reazione di trascrizione inversa. </li></ol></li></ol></li><li> Isolamento di miRNA da cancro della prostata congelati tessuti <ol><li> Omogenize congelati tessuti della prostata resezione dalla macinazione dei tessuti in azoto liquido con un mortaio e pestello. Trasferire il tessuto omogeneizzato in una provetta con una spatola raffreddato. Mantenere la malta / pestello e spatola alla stessa temperatura per immersione in azoto liquido tessuto omogeneizzato così può essere facilmente trasferiti. </li><li> Aggiungere guanidina isotiocianato-fenolo commerciale reagente (1 ml / 0,1 g di tessuto) al tessuto omogeneizzato ed incubare a temperatura ambiente per 5 min. Nota: i tessuti omogeneizzate della guanidina commerciale isotiocianato-fenolo reagente possono essere conservati a -80 ° C per diversi mesi. </li><li> Aggiungere cloroformio per l&#39;omogeneizzato (0,2 ml di cloroformio / ml) e si agita energicamente per 30 sec. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 3-5 min seguita da centrifugazione a 10.000 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Trasferire la fase acquosa superiore ad una provetta sterile da 1,5 ml fresco RNasi-free. </li><li> Aggiungere un volume uguale di alcool isopropilico. Mescolare e incubare per 10 min a RT seguita da centrifugazione a 12.000 xg per 20 min a 4 ° C per sedimentare il RNA. </li><li> Aspirare il surnatante e lavare il pellet di RNA con 1 ml di etanolo al 70%. Centrifugare a 12,000 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante. Pellet di RNA a secco a temperatura ambiente per 5-10 minuti. Sciogliere RNA in 50-100 acqua priva di nucleasi microlitri. </li><li> Eseguire la quantificazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop e determinare l&#39;integrità dell&#39;RNA con un bioanalizzatore. Regolare le concentrazioni di RNA a 10 ng / ml. Utilizzare 10-50 ng RNA per miRNA- reazione cDNA specifico seguito da PCR in tempo reale le analisi (paragrafo 2.2). </li></ol></li></ol></li><li> PCR quantitativa in tempo reale per miRNA analisi di espressione Nota: miRNA maturi Assay utilizzando un protocollo RT-PCR in due fasi come descritto sotto. <ol><li> Reverse trascrizione (RT) <ol><li> Reverse trascrivere cDNA da RNA utilizzando un kit di trascrizione inversa miRNA in conformità con le istruzioni del produttore.Utilizzare 10-50 ng di RNA totale con miRNA primer specifico dal kit MicroRNA Assays e RT. Utilizzare RNU48 / RNU24 / RNU6B come controlli. Diluire cDNA 1: 5 a 1:10 (seconda dall&#39;abbondanza del miRNA analizzati) e utilizzare in tempo reale di rilevamento PCR come descritto nel passaggio seguente. </li></ol></li><li> Real-time PCR per il rilevamento di miRNA maturo <ol><li> Amplifica prodotti di PCR di campioni di cDNA utilizzando i saggi MicroRNA con una master mix universale veloce secondo le istruzioni del produttore. Normalizzare campioni a RNU48 / RNU24 / controllo RNU6B. Utilizzare il metodo comparativo Ct (ciclo soglia) per calcolare le relative variazioni nell&#39;espressione genica su Fast Real Time PCR sistema. Analizzare ogni campione in triplicato. </li></ol></li></ol></li></ol> Analisi 3. miRNA Espressione di ibridazione in situ (ISH) <ol><li> Pre-trattamento dei tessuti <ol><li> Tagliare 5 sezioni micron da blocchi di tessuto di cancro alla prostata FFPE utilizzando un microtomo. </li><li&gt; Fix sezioni di tessuto incubando i campioni a 56 ° C per 1 ora. Nota: Le diapositive possono essere conservati a temperatura ambiente per diverse settimane per miRNA analisi. </li><li> Deparrafinize tessuti immergendo i vetrini con xilene (2x), per 15 minuti ciascuno. </li><li> Reidratare i tessuti incubando i vetrini per 5 minuti ciascuna in etanolo graduata (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%) seguito da acqua distillata (5 min). </li><li> Fissare i vetrini con 4% paraformaldeide in PBS a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> Lavare i vetrini con PBS (2x) a temperatura ambiente per 5 minuti ciascuna. </li><li> Trattare i vetrini con 10 ug / ml proteinasi K a 37 ° C per 10 min in proteinasi pre-riscaldato tampone K (5 mM Tris-HCL pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCl). </li><li> Dopo il trattamento proteinasi-K, sciacquare i vetrini con lo 0,2% glicina in PBS per 30 sec. </li><li> Lavare i vetrini in PBS (1x) a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Fissare i vetrini con 4% paraformaldeide in PBS per 15 min. </li><li> Sciacquare i vetrini conPBS per 5 min. </li></ol></li><li> Ibridazione <ol><li> Pre-ibridare i vetrini con soluzione pre-ibridazione per 3-4 ore a 55 ° C in una camera umidificata. Utilizzare tessuto salviettine imbevute di laboratorio nel 50% formammide / 50% 5x SSC per mantenere la camera umidificata. </li><li> Utilizzare 5 &#39;sonde marcate con digossigenina ad una concentrazione di 20-50 nM in tampone di ibridazione. Diluire sonda specifica per miRNA (20-50 nM) e una piccola sonda di controllo U6 RNA nucleare (20 nM), calore a 90 ° C per 4 minuti, posizionarlo su ghiaccio, e aggiungere al ghiaccio tampone di ibridazione freddo (2-4 ng / ml ). </li><li> Rimuovere la soluzione pre-ibridazione, aggiungere soluzione di ibridazione (sonda + tampone di ibridazione, 100 ml per vetrino), incubare per 12-16 ore a temperatura di ibridazione specifica sonda (temperatura di ibridazione = sonda-Tm 21 ° C). Eseguire ibridazioni in una camera umidificata (50% formammide / 50% 5x SSC). </li></ol></li><li> Lavaggio Steps <ol><li> Lavare i vetrini con 2x SSC per 10 minuti a 45 ° C. </li><li> Lavare tscivola con 1,5x SSC per 10 minuti a 45 ° C. </li><li> Lavare i vetrini con 0.2x SSC (2x) a 37 ° C per 20 minuti ciascuno. </li><li> Incubare i vetrini con la soluzione 1x di blocco per 1-2 ore a temperatura ambiente </li></ol></li><li> Rilevamento <ol><li> Incubare i vetrini con 1: 100 PBS diluito anticorpo anti-digossigenina AP-coniugato per 1-4 ore o una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare i vetrini con PBS (3x) a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno. </li><li> Lavare le diapositive (2x) con fosfatasi alcalina tampone (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20) a temperatura ambiente per 5 minuti ciascuna. </li><li> Incubare i vetrini in substrato BM Viola AP al buio a temperatura ambiente per 1-20 ore. </li><li> Risciacquare i vetrini con PBS contenente 0,1% di Tween-20 e lavaggio (2x) in acqua. </li><li> Montare le diapositive utilizzando un mezzo di montaggio acquoso ed esaminare al microscopio. </li></ol></li></ol>

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The authors have no financial disclosures.

In questo articolo, si descrive un flusso di lavoro semplificato per miRNA profilatura in FFPE archiviati o cancro alla prostata congelato tessuti clinici freschi. Nel cancro della prostata, diversi studi suggeriscono un ruolo importante dei microRNA nel cancro alla prostata iniziazione, la progressione e la metastasi. Tuttavia, risultati contrastanti sono spesso ottenuti su uno specifico miRNA 22 in quanto l&#39;estrazione miRNA e analisi metodi differiscono ampiamente. In considerazione degli elementi di pr...

Il cancro della prostata è un tumore maligno maschio comunemente diagnosticato che è una delle principali cause di mortalità per cancro correlati tra gli uomini. Negli Stati Uniti, si stima che 220,800 nuovi casi e 27.540 decessi saranno presentate nel 2015 1. Il cancro della prostata è una malattia eterogenea con malattia molto variabile corso- tumori possono essere indolenti o molto aggressivo. Una sfida importante nel cancro della prostata gestione clinica è rappresentata dal inadeguatezza dei metodi attualmente in uso / biomarcatori per lo screening della malattia, la diagnosi, la prognosi e il trattamento 2. Metodi di screening attuali includono l&#39;antigene prostatico specifico (PSA) e un esame rettale digitale (DRE) seguito da biopsie prostatiche 3. Antigene prostatico specifico (PSA) è il biomarcatore cancro alla prostata più diffuso che ha rivoluzionato in modo significativo la gestione clinica e miglioramento dei tassi di sopravvivenza 4. Tuttavia, a causa dei limiti intrinseci di PSA compreso lack di specificità, screening di PSA-ha causato oltre diagnosi e sopra il trattamento della malattia. In considerazione di ciò, intensi sforzi sono orientati verso la ricerca di alternative biomarcatori del cancro alla prostata, in particolare quelli che possono prevedere l&#39;aggressività della malattia e guidare le decisioni terapeutiche migliori 4,5. Nel corso degli ultimi anni, microRNA (miRNA) sono emersi come promettenti alternative biomarcatori del cancro alla prostata. I microRNA (miRNA) costituiscono una classe evolutivamente conservata di piccoli RNA non codificanti che sopprimono l&#39;espressione genica livello post-trascrizionale tramite interazioni sequenza-specifiche con le regioni 3&#39;non tradotte (UTR) del target mRNA affini. Si stima che il&gt; 60% di mRNA sono conservate bersagli di miRNA 6. geni miRNA sono localizzati nelle regioni intergeniche o all&#39;interno introni o esoni di proteine ​​/ non-codificanti proteine ​​geni 7. Questi geni sono preferenzialmente trascritti dalla RNA polimerasi II in primamiRNA ry (pri-miRNA, lunga diversi kilobasi) che ad anello a forma di gambo strutture secondarie forma a gomito. Questi pri-miRNA vengono trasformati in miRNA precursori (pre-miRNA, lungo 60-75 nucleotidi) che vengono esportati al citoplasma e successivamente trattati in miRNA maturi (lunghi 18-25 nucleotidi) 8-10. miRNA regolano processi cellulari chiave, tra cui la proliferazione, lo sviluppo, la differenziazione e l&#39;apoptosi 11. Gli studi suggeriscono una disregolazione diffuso di profili di espressione dei miRNA in diversi tumori umani tra cui il cancro alla prostata 12-15. Sono stati riportati i profili di espressione di miRNA ad essere ampiamente disregolazione nel cancro della prostata primari e metastatici. MiRNA Altered sono stati collegati con la progressione del cancro alla prostata, l&#39;aggressività e la ricorrenza mettendo in evidenza il potenziale prognostico di miRNA 12,14,16-19. Un crescente corpo di evidenze indicano che i miRNA svolgono ruoli importanti meccanicistici nell&#39;iniziazione cancro alla prostata, lo sviluppo, il progressoioni e metastasi. Nel complesso, miRNA stanno emergendo come biomarcatori alternativi promettenti per la diagnosi del cancro alla prostata e la prognosi in grado di distinguere tra tessuti e gli aiuti normali e tumorali nella stratificazione di tumori della prostata 12. Inoltre, miRNA sono obiettivi importanti per lo sviluppo di terapie efficaci contro il cancro alla prostata 20. A causa delle loro piccole dimensioni e la resistenza all&#39;attività RNasi endogena, miRNA sono biomarcatori stabili che possono essere facilmente rilevati nei tessuti fissati in formalina 21 e 22 biopsie prostatiche. Inoltre, i profili di espressione di miRNA sono stati confrontati in tessuti congelati e fissati in formalina e sono stati trovati per essere fortemente correlato 21. Tuttavia, miRNA profiling in cancro alla prostata tessuti clinici è spesso difficile a causa della eterogeneità del tumore, gli errori di campionamento, contaminazione stromale ecc Lo sviluppo dei miRNA come biomarcatori efficaci per il cancro alla prostata pesantemente relies sul loro rilevamento accurato nei tessuti clinici. Qui si descrive un flusso di lavoro semplificato utilizzato nel nostro laboratorio per miRNA profilatura in FFPE archiviati o cancro alla prostata congelato campioni clinici freschi. Ci avvaliamo di una combinazione di quantitativa real-time PCR e ibridizzazione in situ per miRNA le analisi di campioni clinici, con l&#39;ex producendo maggiori informazioni quantitative e la seconda per visualizzare l&#39;espressione differenziale delle potenziali biomarcatori miRNA in una vasta gamma di tessuti. All&#39;interno di questo flusso di lavoro, ottimizziamo le metodologie esistenti per l&#39;estrazione miRNA da FFPE e tessuti della prostata congelati, espressione analizza da Taqman-sonda basato miRNA RT-PCR e miRNA in situ tecnica di ibridazione con acido nucleico bloccato (LNA) -based sonde 23. Sonde basato LNA-offrono una maggiore sensibilità e specificità rispetto al DNA o RNA sonde based e consente il rilevamento affidabile di tutte le sequenze di miRNA, indipendentemente dal loro contenuto GC e permettono anche discriminazione delle famiglie miRNA. Il nostro protocollo miRNA ISH ottimizzato può essere applicato alle diapositive di cancro alla prostata di tessuto o microarray di tessuti di cancro alla prostata (TMA), con quest&#39;ultimo che offre il potenziale di accelerare miRNA biomarcatore scoperta.

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems&amp;nbsp;</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus Autopix for LCM</td><td>Arcturus/ Life Technologies</td><td>LCM1621/LCM1110</td><td>Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy FFPE Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>7500 Fast Real-time PCR System&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Universal PCR master mix&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>DIG labeled LNA probe for U6</td><td>Exiqon</td><td>99002-01</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple AP substrate</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Pre-hybridization solution&amp;nbsp;</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-1&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization solution&amp;nbsp;</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-2&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Blocking solution&amp;nbsp;</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-8&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>AP-conjugated anti-digoxigenin antibody</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-7&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Aqueous mounting media&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories&amp;nbsp;</td><td>H-5501&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018&quot;&gt;15596-018&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxylin</td><td>Statlab</td><td>SL200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&amp;nbsp;</td><td>Statlab</td><td>SL201&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

mirna expression analyses in prostate cancer clinical tissues

Una sfida importante nel cancro della prostata (PCa) gestione clinica è rappresentata dal inadeguatezza di biomarcatori attualmente utilizzati per lo screening delle malattie, la diagnosi, la prognosi e il trattamento. Negli ultimi anni, microRNA (miRNA) sono emersi come biomarcatori alternativi promettenti per la diagnosi del cancro alla prostata e la prognosi. Tuttavia, lo sviluppo di miRNA come biomarcatori efficaci per il cancro alla prostata si basa molto sul loro rilevamento accurato nei tessuti clinici. miRNA analisi nel cancro alla prostata campioni clinici è spesso difficile a causa della eterogeneità del tumore, gli errori di campionamento, contaminazione stromale ecc L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un flusso di lavoro semplificato per miRNA analizza FFPE archiviati o cancro alla prostata congelato campioni clinici freschi utilizzando una combinazione di quantitativa real-time PCR (RT-PCR) e ibridazione in situ (ISH). All&#39;interno di questo flusso di lavoro, ottimizziamo le metodologie esistenti per l&#39;estrazione miRNA da FFPE e congelato tissu prostataes e espressione analisi da Taqman-sonda basato miRNA RT-PCR. Inoltre, si descrive un metodo ottimizzato per ISH analizza il rilevamento formiRNA in tessuti prostatici con acido nucleico bloccato (LNA) - sonde based. Il nostro protocollo miRNA ISH ottimizzato può essere applicato alle diapositive di cancro alla prostata di tessuto o microarray di tessuti di cancro alla prostata (TMA).

Profilo di espressione di miR-203 nel cancro della prostata primario LCM campioni clinici mediante RT-PCR analisi (Figura 1) RT-PCR analisi di espressione relativa miR-203 in LCM prostata primaria tessuti tumorali e le regioni adiacenti normali appaiati è stata effettuata come descritto in Saini et al. 15 RNU48 è stato utilizzato come controllo. La tabella seguente riassume l&#39;espressione relativa miR-203 nei tessuti tumorali del cancro alla prostata...

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miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

Analisi miRNA nel tumore alla prostata tessuti cliniche

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

mirna-expression-analyses-in-prostate-cancer-clinical-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K Views.  University of California San Francisco. Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

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MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Rilevamento MicroRNA in tumori della prostata dal Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Ricerca

Medicina

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results in cancer regression. However, in a significant number of cases, the disease progresses to advanced, castration-resistant prostate cancer (CRPC), which has limited therapeutic options and is often aggressive. Distant metastasis is mostly observed at this stage of the aggressive disease. CRPC is treated by a second generation of AR pathway inhibitors that improve survival initially, followed by the emergence of therapy resistance. Neuroendocrine prostate cancer (NEPC) is a rare variant of prostate cancer (PCa) that often develops as a result of therapy resistance via a transdifferentiation process known as neuroendocrine differentiation (NED), wherein PCa cells undergo a lineage switch from adenocarcinomas and show increased expression of neuroendocrine (NE) lineage markers. In addition to the genomic alterations that drive the progression and transdifferentiation to NEPC, epigenetic factors and microenvironmental cues are considered essential players in driving disease progression. This manuscript provides a detailed protocol to identify the epigenetic drivers (i.e., small non-coding RNAs) that are associated with advanced PCa. Using purified microRNAs from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) metastatic tissues and corresponding serum-derived extracellular vesicles (EVs), the protocol describes how to prepare libraries with appropriate quality control for sequencing microRNAs from these sample sources. Isolating RNA from both FFPE and EVs is often challenging because most of it is either degraded or is limited in quantity. This protocol will elaborate on different methods to optimize the RNA inputs and cDNA libraries to yield most specific reads and high-quality data upon sequencing.

Therapy resistance often develops in patients with advanced prostate cancer, and in some cases, cancer progresses to a lethal subtype called neuroendocrine prostate cancer. Assessing the small non-coding RNA-mediated molecular changes that facilitate this transition would allow better disease stratification and identification of causal mechanisms that lead to development of neuroendocrine prostate cancer.

Sequenziamento di piccoli RNA non codificanti da tessuti fissati in formalina ed esosomi derivati dal siero da pazienti affetti da cancro alla prostata resistenti alla castrazione

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Ricerca sul cancro

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

Microarray identificazione dei singoli HERV Loci Expression: Domanda di Biomarker Discovery in Cancro alla prostata

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un ortotopico Modello murino di Human Prostate Cancer Metastasi

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Profiling di microRNA regolati dagli estrogeni in cellule di carcinoma mammario

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

TMEM200A: Un nuovo oncogene che regola EMT e PI3K/AKT nel carcinoma gastrico

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in common cancers by multiomics analysis and used in vitro cell cultures of gastric cells to verify the results. The expression of TMEM200A in several human cancer types was assessed using the RNA-seq data from the UCSC Xena database. Bioinformatic analysis revealed a potential role of TMEM200A as a diagnostic and prognostic biomarker. 
Cultures of normal gastric and cancer cell lines were grown and TMEM200A was knocked down. The expression levels of TMEM200A were measured by using quantitative real-time polymerase chain reaction and western blotting. In vitro loss-of-function studies were then used to determine the roles of TMEM200A in the malignant behavior and tumor formation of gastric cancer (GC) cells. Western blots were used to assess the effect of the knockdown on epithelial-mesenchymal transition (EMT) and PI3K/AKT signaling pathway in GC. Bioinformatic analysis showed that TMEM200A was expressed at high levels in GC. 
The proliferation of GC cells was inhibited by TMEM200A knockdown, which also decreased vimentin, N-cadherin, and Snai proteins, and inhibited AKT phosphorylation. The PI3K/AKT signaling pathway also appeared to be involved in TMEM200A-mediated regulation of GC development. The results presented here suggest that TMEM200A regulates the tumor microenvironment by affecting the EMT. TMEM200A may also affect EMT through PI3K/AKT signaling, thus influencing the tumor microenvironment. Therefore, in pan-cancers, especially GC, TMEM200A may be a potential biomarker and oncogene.

Autore in primo piano: Svelare i marcatori correlati alla famiglia delle proteine transmembrana nel carcinoma gastrico e le implicazioni per le terapie mirate 

Here, a protocol is presented in which multiple bioinformatic tools are combined to study the biological functions of TMEM200A in cancer. In addition, we also experimentally validate the bioinformatics predictions.

Analisi multiomica del TMEM200A come biomarcatore pan-tumorale

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. Gene amplification and expression diagnostic testing using archival material or material that requires transportation to servicing laboratories, needs a more robust and accurate test adapted to current clinical workflows. Our research team optimized the use of Invitrogen&#8482; QuantiGene&#8482; Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) to quantify RNA in archival material using branched-DNA (bDNA) technology on Luminex xMAP&#174; magnetic beads. The gene expression assay described in this manuscript is a novel, quick, and multiplex method that can accurately classify breast cancer into the different molecular subtypes, omitting the subjectivity of interpretation inherent in imaging techniques. In addition, due to the low input of material required, heterogeneous tumors can be laser microdissected using Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections. This method has a wide range of possible applications including tumor classification with diagnostic potential and measurement of biomarkers in liquid biopsies, which would allow better patient management and disease monitoring. In addition, the quantitative measurement of biomarkers in archival material is useful in oncology research with access to libraries of clinically-annotated material, in which retrospective studies can validate potential biomarkers and their clinical outcome correlation.

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. This manuscript describes the optimization of a panel of biomarkers using a multiplex magnetic bead assay to classify breast cancers.

Ottimizzazione di un'analisi di espressione di RNA-ha basato multisala usando materiale archivistico di cancro al seno

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Bioingegneria

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Analisi miRNA nel tumore alla prostata tessuti cliniche

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Rilevamento MicroRNA in tumori della prostata dal Quantitative Real-time PCR (qPCR)

Sequenziamento di piccoli RNA non codificanti da tessuti fissati in formalina ed esosomi derivati dal siero da pazienti affetti da cancro alla prostata resistenti alla castrazione

Microarray identificazione dei singoli HERV Loci Expression: Domanda di Biomarker Discovery in Cancro alla prostata

Un ortotopico Modello murino di Human Prostate Cancer Metastasi

Profiling di microRNA regolati dagli estrogeni in cellule di carcinoma mammario

Analisi multiomica del TMEM200A come biomarcatore pan-tumorale

Analisi multiomica del TMEM200A come biomarcatore pan-tumorale

Analisi multiomica del TMEM200A come biomarcatore pan-tumorale

Ottimizzazione di un'analisi di espressione di RNA-ha basato multisala usando materiale archivistico di cancro al seno

Laser-capture Microdissezione di Human prostatica Epitelio per l'analisi di RNA