Gli autori desiderano ringraziare il personale tecnico dell&#39;Unità di Ricerca Traslazionale; Maria Economou, José Galván, Caroline Martello, Dominique Müller, Liliane Schöni e il Team Informatica presso l&#39;Istituto di Patologia, Università di Berna.

NOTA: Questo studio è stato approvato dal comitato etico locale dell&#39;Ospedale Insel, Berna, Svizzera (07-10-13). I tessuti sono stati ottenuti dalla banca Tumori di Berna, Istituto di Patologia, Università di Berna. 1 Pianificazione e progettazione (Consulting) <ol><li> Pensate alla domanda di ricerca a cui rispondere. Decidere i tipi di tessuto da inserire nel progetto. Determinare quali strutture istologiche sono importanti per rispondere alla domanda. </li><li> Accertare il diametro del nucleo più utile e il numero di core per paziente per il progetto. Decidere il numero di copie della nuova generazione Tissue Micro Array (ngTMA) in base alla quantità di biomarcatori da indagare. </li><li> Considerare aspetti statistici come la dimensione del campione e l&#39;analisi dopo il microarray tissutale (TMA) è costruito. Determinare il numero di pazienti per l&#39;inclusione nello studio e stabilire i tessuti di controllo per l&#39;array. </li><li> Recuperare il istologica (odiagnostica) Ematossilina e Eosina (H &amp; E) slides di ogni paziente. Brevemente rivedere le diapositive e identificare quelli contenenti informazioni e istologia rilevanti per il progetto. NOTA: Fare nuove sezioni dei blocchi di paraffina, se macchia speciale o immunoistochimica scivolo è desiderato per la scansione di diapositive e annotazione, invece di H &amp; E diapositive </li></ol> Scansione 2 Far scorrere <ol><li> Accendere il PC e scanner per diapositive e software di scansione aperto. Selezionare &quot;modalità automatica&quot; per la scansione campo chiaro dalla schermata di anteprima. </li><li> Clicca su &quot;Opzioni di scansione&quot; per regolare i parametri di qualità di scorrimento. A questo punto, selezionare se vetrini devono essere sottoposti a scansione direttamente alla piattaforma digitale accessibile via web o su un&#39;unità locale (o disco esterno) e impostare il tipo di scansione e il numero di punti di messa a fuoco. </li><li> Clicca su &quot;Parametri server&quot; per eseguire la scansione al &quot;centro Caso&quot;. A questo punto, aggiungere più riviste, etichettare tutte le diapositive e impostarela cartella nella causa Center, dove devono essere conservati gli scivoli. Ogni scomparto può contenere fino a 25 diapositive. </li><li> Verifica qualità / pulizia dei vetrini istologici effettivi per la scansione. Se necessario, i vetrini puliti con etanolo al 70%. </li><li> Caricare fino a 25 diapositive per la rivista con le etichette che punta verso l&#39;interno (figura 3A) </li><li> Posizionare la rivista nello scanner. Per più di una rivista, metterli uno sopra l&#39;altro. </li><li> Avviare la scansione di diapositive facendo clic sulla freccia verde (Figura 3B). Quando tutte le diapositive scansione, scaricare riviste e spegnere lo scanner programma, PC e scivolo. </li></ol> 3 Far scorrere Digital Annotazione <ol><li> Inserire l&#39;indirizzo del browser per il digitale centro di gestione di diapositive e scaricare il software visualizzatore diapositiva digitale gratuito. </li><li> Aprire il software visualizzatore diapositiva digitale e selezionare la cartella contenente i vetrini digitali (Figura 4A). </li><li> Aggiungere note, riordinare e gestire la digitacartella di diapositive l o assegnare diritti utente ai colleghi o aggiungere allegati alla cartella. </li><li> Clicca su desiderata diapositiva digitale che appare nel visualizzatore di diapositive digitale. </li><li> Utilizzando lo strumento di ingrandimento, di valutare la diapositiva e trovare le aree di interesse per l&#39;integrazione nel ngTMA. </li><li> Utilizzando il &#39;strumento di annotazione TMA&#39;, selezionare la dimensione del nucleo desiderato e il colore dell&#39;annotazione. Posizionare l&#39;annotazione sulla diapositiva digitale facendo clic su di esso (Figura 4B). </li><li> Spostare l&#39;annotazione alle strutture istologiche desiderati per incorporazione nella ngTMA (Figura 4C). </li><li> Ripetere questo processo di annotazione di nuovo utilizzando lo strumento di annotazione, selezionare una dimensione di base ed un colore di annotazione desiderato. Ripetere la visione di diapositive e annotazione su tutte le diapositive nella cartella. </li><li> In alternativa, inserire nuclei di tessuto per PCR in provette da 0,2 ml, piuttosto che l&#39;integrazione nella TMA. Annotare le diapositive utilizzando un colore diverso per identificarequesti punti per ulteriori analisi molecolare. </li><li> Creare un elenco di tutti i casi con le loro annotazioni e colori corrispondenti. </li></ol> 4. Tissue Microarray Costruzione <ol><li> Recuperare i corrispondenti blocchi di tessuto paraffina per tutte le diapositive digitali annotati, ordinare i blocchi nell&#39;ordine desiderato per microarraying tessuto. </li><li> Assicurarsi che i blocchi di tessuto hanno un minimo di spessore 4 mm. Se no, reembedding di tessuto è necessario. </li><li> Accendere il PC &quot;ON&quot; e strumento microarrayer tessuti automatizzato. Aprire il software microarrayer tessuti e fornire un nome al progetto </li><li> Eseguire un &quot;Cambio utensile&quot; e selezionare il diametro utensile necessario per il progetto (ad esempio, 0.6, 1.0, 1.5, o 2.0 mm). </li><li> Caricare fino a 12 blocchi &#39;destinatario&#39; TMA nella macchina. Dare un ID a ciascuno dei 12 blocchi </li><li> Creare un layout TMA per ogni blocco destinatario. Osservare un design TMA con il numero di righe, colonne, e appropriarsi prioritariamenteLinee y così come la distanza tra i core. Creare un nuovo layout per ogni blocco destinatario o utilizzare lo stesso layout ripetutamente. </li><li> Posizionare il cursore sul blocco di layout destinatario di prendere il primo nucleo. </li><li> Avanti, caricare fino a 60 blocchi di donatori nel microarrayer tessuto (Figura 5A). Mettere dieci blocchi in ogni riga da A a F. Dare ad ogni blocco un ID donatore. Osservare le immagini di ogni blocco donatore sullo schermo del computer acquisita automaticamente dal microarrayer tessuti. </li><li> Partendo con il primo blocco, cliccare su &quot;scorrere&quot;. Osservare la diapositiva digitale annotato memorizzato nel centro di gestione diapositiva digitale (o sul disco esterno) utilizzando il visualizzatore di diapositive digitale. Mostra l&#39;immagine del blocco donatore e il lato side-by-diapositiva digitale. </li><li> Selezionare i punti di riferimento l&#39;immagine sul blocco per sovrapporre l&#39;immagine del blocco donatore con la slitta digitale </li><li> Dopo aver cliccato su &quot;Avanti&quot;, osservare le annotazioni su una più grande immagine del blocco. (Figura 5B &lt;/ Strong&gt;). Clicca sopra le annotazioni per confermare e fare clic su &quot;Start&quot;. NOTA: Ciò induce la microarrayer tessuti per avviare un foro di 0,6 mm di diametro nel blocco destinatario al punto di partenza selezionato. Poi, in una seconda fase, usando l&#39;utensile di punzonatura, lo strumento punzoni foro nel tessuto dal blocco donatore selezionato l&#39;esatto regione annotata e confermata. Nuclei vengono poi trasferiti dal donatore al blocco destinatario. </li><li> Dopo circa 500 anime, pulire lo strumento trapano e punzonatura con un tampone di xilene. </li><li> Se nuclei di tessuto si desiderano (invece di pugni in un ngTMA), fare clic sullo strumento &quot;PCR&quot; per il blocco, confermare fino a 4 annotazioni e premere &quot;Start&quot;. Questo pugno e trasferire i nuclei in una provetta 0,2 ml. </li><li> Ripetere punto 4,9-4,11 con il secondo blocco donatore, e così via. </li><li> Dopo aver utilizzato tutti i blocchi donatori, inserire una seconda tornata di blocchi donatori (61-120) nel microarray tissutaleer e continuano passaggi 4,8-4,11. </li><li> Aggiornare donatori e destinatari bloccati, mentre lo stato di avanzamento del progetto, mentre la foratura e punzonatura è in corso (Figura 5C). </li><li> Eseguire un &quot;Export&quot; dopo che il progetto è completo. Individuare il file xslx con gli ID dei donatori e dei destinatari bloccati, la localizzazione di tutti i punzoni all&#39;interno della TMA, nonché il layout TMA / design, nella cartella esportata. Salvare tutte le immagini di blocco donatore con tutte annotazioni sovrapposto come immagini jpg nella cartella esportata (Figura 5D). Il blocco finale TMA è pronto. </li></ol>

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The authors have no disclosures

In questo lavoro, un protocollo per ngTMA è delineato. ngTMA è un concetto di nuova costituzione per microarraying tessuto che coinvolge pianificazione e progettazione, patologia digitale e presentazione di annotazione nonché automatizzata dei tessuti microarraying 12. Rispetto alla microarraying tessuto convenzionale, ngTMA offre molti vantaggi. In una prima fase, la fase di programmazione e progettazione è critica. L&#39;obiettivo è quello di rispondere a una domanda di ricerca mirata. Questo dovrebbe prendere in considerazione le questioni istologiche (per esempio, che le regioni e quanti punti posso desidera includere?), La pianificazione statistica (ad esempio, la dimensione del campione? Come analizzo i miei campioni più tardi?) E le considerazioni logistiche (ad esempio, come molti biomarcatori e quindi il numero di copie ngTMA?). Una specifica ngTMA è fatto per specifiche esigenze, sia che si tratti per lo screening biomarker e high-throughput o destinato a studiare specifici aspetti istologici su pochi cas ben selezionataes. Uno, se non il, più importante svantaggio di microarraying tessuto tradizionale è la bassa precisione con cui sono fatte le marcature sui vetrini istologici. Lo studio di specifiche strutture istologiche, cellule o regioni è fatto quasi impossibile. ngTMA permette per alta precisione, perché le annotazioni vengono inseriti direttamente nelle diapositive digitali. Questo permette al ricercatore di selezionare con precisione le regioni da pugni, comprese le cellule specifiche. In questo esempio, varie zone all&#39;interno dello stesso blocco di tessuto vengono perforati per arraying, come il centro del tumore, l&#39;invasione anteriore e aree di interazione tumore / stroma evidenziato dalla presenza di piccoli gruppi di cellule tumorali o anche singole cellule. Questa precisione può essere raggiunto solo utilizzando ngTMA. In terzo luogo, perché le diapositive vengono sottoposti a scansione su una piattaforma digitale basata sul web, far scorrere la visualizzazione e l&#39;annotazione può essere fatta attraverso il computer, piuttosto che con il microscopio. Il software arraying tessuto fornisce un facile da usareInterfaccia con un elevato grado di flessibilità, layout dunque diversi e design ngTMA può essere raggiunto. Poiché TMA costruzione viene eseguita automaticamente da perforazione, c&#39;è poca necessità di hands-on manovra e la quantità di tempo per la costruzione è notevolmente ridotto. Il tempo per TMA costruzione in questo esempio è tra 24 ore. Utilizzando un approccio convenzionale TMA e la stima di 15 punzoni per ora, questo progetto avrebbe preso circa 304 ore. ngTMA può essere applicato per studiare l&#39;espressione della proteina, DNA o mRNA così come combinazioni di questi. Figura 9 illustra alcune di queste applicazioni potenziali biomarker. Immunoistochimica standard può essere applicato per determinare l&#39;indice di proliferazione dei tumori mediante Ki-67. Un approccio combinato di indagare l&#39;espressione proteica e l&#39;amplificazione del DNA per i geni, come HER2 può essere utilizzato. I tessuti possono essere riuniti in un unico ngTMA per ridurre i costi, l&#39;utilizzo dei tessuti e di altre risorses. Inoltre, mRNA ibridazione in situ per HER2 e altri geni può essere eseguita per identificare singoli mRNA trascritti in un gran numero di casi utilizzando un numero minimo di vetrini di tessuto. L&#39;immunoistochimica di marcatori immunitari quali CD8 possono essere visualizzati nel contesto del microambiente tumorale. Doppia immunoistochimica può essere utilizzato anche per evidenziare particolari regioni di interesse come le interazioni tra cellule immunitarie (marcata in rosso) e le cellule tumorali marcate (in marrone) nella parte anteriore all&#39;invasione dei tumori. Tale regione di interesse non avrebbe potuto essere catturato utilizzando microarraying tessuti convenzionali. Tuttavia, questo protocollo contiene alcune limitazioni. La sfida più importante è la sovrapposizione tra il blocco donatore e diapositiva digitale. Diversi fattori possono influenzare questo passo. In primo luogo, l&#39;ultima sezione dal blocco deve essere utilizzato per la scansione di diapositive. In molti casi, la H &amp; E non è l&#39;ultima sezione del blocco donatore, Rather è un immunoistochimica o altro macchia. In questo caso, anche un vetrino colorato può essere utilizzato fino a quando l&#39;ultima macchia viene sottoposto a scansione e annotato o un nuovo H &amp; E dovrebbe essere fatto. Si deve anche essere presa quando sezioni di tessuto sono stati fatti come i tessuti possono espandersi in bagno d&#39;acqua che conduce alla corrispondenza impegnativo di scorrimento e blocco. In secondo luogo, al momento i progetti sono limitati a 12 destinatari TMA blocchi elaborati in una sola volta. Progetti più grandi che superano 12 TMA devono essere assegnati a un secondo nome di progetto. In terzo luogo, i blocchi donatori devono essere realizzati con stampi standard e cassette come lo strumento non si può regolare di varie dimensioni. Infine, blocchi donatori devono superare l&#39;altezza minima (4 mm) per ottenere la foratura ottimale. In alcuni casi, questo richiede reembedding di tessuti. Centinaia di pubblicazioni nel corso degli ultimi anni evidenziano la TMA come uno strumento prezioso per la ricerca di biomarcatori. TMA sono stati utilizzati per lo studio del polmone 13, del colon-retto 7, breast 14, 15 della prostata, del pancreas 16, della vescica 17, e 18 tumori gastrici, per citarne alcuni. Un numero crescente di autori ha combinato l&#39;uso di TMA con analisi di immagine e significativi passi in avanti sono stati fatti in questa direzione 19-21. Tuttavia, accanto a una manciata di gruppi di ricerca che hanno pubblicato le idee innovative TMA 22-24, poca attenzione è stata data per ottimizzare la tecnica TMA stesso. Microarrayers tessuto automatizzati, come ad esempio l&#39;ATA-27 da Estigen / Beecher forniscono progettazione del layout e opportuno e automatizzato punzonatura dei tessuti. Questo rappresenta però solo 1 aspetto del concetto ngTMA. ngTMA è un sostanziale miglioramento rispetto alle tecniche microarraying tessuti convenzionali. Incorpora esperienza in istologia e design TMA con la flessibilità di patologia digitale e la precisione di annotazioni digitali con la velocità e l&#39;affidabilità di costruzione automatizzata TMA. La combinazione di ngTMA e analisi di immagine per la valutazione di proteine ​​e biomarcatori molecolari sarà un potente strumento per migliorare ulteriormente la qualità della ricerca clinica e traslazionale in futuro.

Negli ultimi due decenni, microarrays tissutali (TMA) hanno avuto un impatto notevole sugli studi di indagine biomarker. TMA sono essenzialmente di tessuto &quot;archivi&quot; prodotti dalla cessione ripetuta di piccoli nuclei di tessuto, di solito variano nel formato 0,6-2,0 mm di diametro, dalla paraffina blocchi &#39;donatori&#39; in un unico blocco TMA &#39;destinatario&#39; (Figura 1) 1. Utilizzando una piccola dimensione nucleo, circa 500 punti diversi di tessuto da pochi o molti pazienti diversi possono essere disposte in una TMA 2. L&#39;uso di TMA per gli studi di biomarcatori prognostici o predittivi ha molti vantaggi. Si consideri l&#39;esempio in cui l&#39;espressione di un biomarcatore della proteina mediante immunoistochimica deve essere valutata in 450 pazienti. Invece di eseguire 450 colorazioni immunoistochimiche su 450 diapositive paziente sezionati dallo stesso numero di blocchi, piccoli nuclei di ciascun campione possono essere disposte su un unico TBlocco MA. Anche se più core sono presi da ogni singolo paziente, un numero minimo di blocchi sono prodotti. Questo ha l&#39;effetto considerevole di diminuire drasticamente i costi e le altre risorse oltre a ridurre spreco di tessuto. Studi Inoltre questo permette opportunamente alimentato utilizzando un gran numero di tessuti da valutare nelle stesse condizioni sperimentali. TMA ha molte applicazioni diverse. Ad esempio, possono essere utilizzati per studiare la morfologia, l&#39;espressione della proteina, l&#39;espressione di RNA e DNA aberrazioni seguenti colorazione con diversi coloranti o dopo immunoistochimica o cromogenico e addirittura ibridazione in situ fluorescente 3-7. Recenti studi hanno utilizzato anche TMA per testare variazione intra e interlaboratorio in protocolli di colorazione, stabilire la specificità o la sensibilità degli anticorpi per mutazioni genetiche specifiche, e per determinare la riproducibilità inter di espressione della proteina in collaborazioni internazionali <sup&gt; 8-11. La costruzione del tradizionale TMA utilizzando tessuti di derivazione paziente è una lunga procedura in più fasi (Figura 2). Si inizia con la ricerca di possibili casi opportuni e selezione di diapositive diagnostici provenienti dagli archivi presso un istituto di patologia, o di altro istituto, da dove vengono recuperati. Il patologo valuta ogni diapositiva per caso e seleziona la diapositiva più rappresentativo ai fini dello studio. Successivamente, la regione di interesse è contrassegnato con una penna direttamente sotto il microscopio. Questo è spesso difficile e imprecisa e si traduce solo in una &quot;stima&quot; di cui punzoni di tessuto devono essere prelevati da. Successivamente, i blocchi di paraffina corrispondenti a queste diapositive contrassegnate vengono recuperati dall&#39;archivio. Un rapido confronto tra il blocco e la slitta è fatta. Utilizzando un Arrayer tessuto semi-automatico o fatti in casa, il blocco donatore è perforato nella regione stimata di interesse e trasferito in un blocco TMA destinatario. Costruzione di TMA utilizzando questa tecnica arraying è alta intensità di lavoro, che richiede tempo, impreciso, e inflessibile. Preparazione di una TMA di 475 punti in 3 copie è stimato a prendere circa 84 ore di lavoro. Un nuovo approccio alla costruzione di TMA è stato recentemente introdotto dall&#39;Istituto di Patologia, Università di Berna, che si basa su tre componenti: la pianificazione e la progettazione (o di consulenza), patologia digitale combinata con competenze in istologia e automatizzato TMA arraying 12. Insieme, questo concetto è chiamato prossima generazione di Tissue Microarray (ngTMA). Qui di seguito, un protocollo per ngTMA è descritto sulla base di un esempio di 134 pazienti con carcinoma colorettale metastatico. Qui, i tumori primari e metastasi linfonodali e metastasi epatiche devono essere schierati in ngTMAs per la successiva analisi dei biomarcatori. Inoltre, i piccoli nuclei di tessuto da ogni paziente si desiderano per il futuro estrazione degli acidi nucleici.

<table><tbody><tr><td>Pannoramic 250 Flash II</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Slide scanner</td></tr><tr><td>TMA Grandmaster</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Tissue Microarrayer</td></tr><tr><td>Pannoramic Viewer</td><td>3DHistech</td><td>free</td><td>Slide viewing software</td></tr><tr><td>Case Center</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Digital slide platform</td></tr></tbody></table>

a next-generation tissue microarray (ngtma) protocol for biomarker studies

La ricerca di biomarker si basa su microarray tissutali (TMA). TMA sono prodotte da ripetute trasferimento di piccoli nuclei di tessuto da un blocco &#39;donatore&#39; in un blocco &#39;destinatario&#39; e poi utilizzato per una varietà di applicazioni biomarker. La costruzione di TMA convenzionale è alta intensità di manodopera, impreciso, e che richiede tempo. Qui, un protocollo utilizzando microarray di tessuti di nuova generazione (ngTMA) è delineato. ngTMA si basa su TMA pianificazione e progettazione, patologia digitale, e microarraying tessuti automatizzato. Il protocollo è illustrato con un esempio di 134 pazienti affetti da cancro colorettale metastatico. Aspetti istologici, statistici e logistiche sono considerati, ad esempio il tipo di tessuto, specifiche regioni istologiche, e tipi di cellule per l&#39;inclusione nella TMA, il numero di macchie di tessuto, dimensione del campione, analisi statistica, e il numero di copie TMA. Vetrini istologici per ogni paziente vengono scansionati e caricati su una piattaforma digitale basata sul web. Lì, vengono visualizzati e annotated (marcato) utilizzando uno strumento di diametro 0,6-2,0 mm, più volte utilizzando diversi colori per distinguere le zone di tessuto. Blocchi donatori e 12 blocchi &#39;beneficiarie vengono caricati nello strumento. Diapositive digitali sono recuperati e abbinati alle immagini di blocco donatore. Arraying ripetuta delle regioni annotati viene automaticamente eseguita traduce in un ngTMA. In questo esempio, sei ngTMAs sono previsti contenente sei differenti tipi di tessuto / zone istologici. Due copie dei ngTMAs sono desiderati. Da tre a quattro diapositive per ogni paziente vengono controllati; 3 piste di scansione sono necessari ed eseguito durante la notte. Tutti i vetrini sono annotati; diversi colori sono utilizzati per rappresentare i diversi tessuti / zone, vale a dire il centro del tumore, invasione anteriore, tumore / stroma, metastasi linfonodali, metastasi epatiche, e tessuto normale. 17 annotazioni / caso sono fatti; tempo per l&#39;annotazione è di 2-3 min / caso. 12 ngTMAs sono prodotti contenente 4556 punti. Tempo arraying è di 15-20 ore. Grazie alla sua precisione, flessibilità e velocità, ngTMA è un potentestrumento per migliorare ulteriormente la qualità del TMA utilizzato nella ricerca clinica e traslazionale.

Pianificazione e progettazione Qui è stato utilizzato l&#39;esempio di 134 pazienti con carcinoma colorettale metastatico che vengono indagati per una particolare serie di biomarcatori. Non solo è un ngTMA previsto per questi pazienti, ma l&#39;estrazione del DNA seguita da analisi mutazionale per qualche gene specificato. Durante la fase di pianificazione e progettazione delle ngTMA, i seguenti aspetti sono stati decisi. Da ogni paziente, saranno studiati 6 diverse regioni istologiche: centro tumore, invasione tumorale anteriore, le aree di più densa tumore in erba (tumore / interazione stroma), tessuto normale, metastasi linfonodali e metastasi epatiche. Tre punti tumorali per area di tessuto tumorale e due macchie di tessuto normali devono essere inclusi nel progetto (n = 17 punti per paziente). Dal momento che si prevede che più di 50 biomarcatori essere studiati su questo materiale paziente, due copie del ngTMA finale sono desiderati. A causa delle piccole dimensioni possibili di linfonodi e distant metastasi, viene scelto un piccolo diametro di 0,6 mm per TMA di costruzione per tutti i tessuti. Inoltre, è previsto che ogni regione sia schierato separatamente, in modo che saranno prodotti 6 ngTMAs contenenti diverse aree istologiche: un ngTMA contenente tessuti dal centro tumore a), b) davanti all&#39;invasione, zone c) del tumore in erba, d) tessuto normale , e) metastasi linfonodali, e f), metastasi epatiche. Per la progettazione TMA utilizzando uno strumento di 0,6 millimetri, sarà selezionato una comoda distanza di 0,4 mm tra i pugni. Poiché la valutazione delle macchie di tessuto in lunghe righe e colonne è spesso noiosa, vengono selezionati due disegni differenti. Per le sezioni tumorali con 3 punzoni per area di tessuto, viene creato un disegno che contiene sei parti. Questo porta ad un numero totale di 402 punzoni tessuto. Per i pugni tessuti normali, 2 colpi al caso devono essere inclusi. È scelto un layout di montaggio 432 pugni in totale. Inoltre, per ogni caso, fino a 4core a 0,6 millimetri verranno inoltre essere perforato e collocati in provette da 0,2 ml. Saranno inoltre annotati Questi nuclei di tessuto. Per riassumere, saranno prodotti 6 ngTMAs di diversi tessuti (5 array tumorali x 3 punzoni x 134 pazienti; 1 dell&#39;array tessuto normale x 2 punzoni x 134 pazienti), oltre a 4 core per paziente per tubi. Nel loro insieme, saranno effettuati 2.814 annotazioni. Successivamente, i corrispondenti diapositive H &amp; E di pazienti selezionati vengono recuperati dall&#39;archivio diapositiva. Ogni caso è brevemente esaminato da un patologo e sono selezionati maggior diapositive rappresentative di ogni tipo di tessuto. Scansione Diapositive digitali di ogni sezione istologica sono fatte per il futuro annotazione. Per questo studio, 3-4 vetrini di tessuto da sottoporre a scansione ogni caso, vale a dire, cancro colorettale primario, con o senza i tessuti adiacenti normali, metastasi linfonodali e metastasi epatiche e possibilmente una truffa scivolo supplementarecontenenti mucosa normale. Fino a 10 riviste diverse possono essere completamente caricati nel scanner per diapositive; quindi 250 diapositive possono essere acquisiti in un unico passaggio. Il tempo per la scansione e la dimensione diapositiva digitale varia con le dimensioni del tessuto e il fattore di qualità desiderata. Le gamme di fattore di qualità da 0 a 100 Qui, viene selezionato un fattore di qualità di 60, in quanto produce un file di dimensioni più piccole di scansione senza alcuna perdita percepibile di qualità di scansione. Le piccole biopsie possono essere acquisiti in meno di 30 sec mentre sezioni di tessuto insieme, come quelli utilizzati in questo esempio può prendere fra 2 e 10 min. Formato diapositiva digitale può anche variare da 2 MB a 2 GB. Utilizzando un fattore di qualità di 60, esegue la scansione tra 600 MB e 1 GB sono prodotti. Tra 402 e 536 vetrini sono necessari per questo progetto per un totale di 3 piste di scansione. Ogni corsa viene eseguita durante la notte. Circa 500 GB di spazio di archiviazione è necessaria. I vetrini vengono sottoposti a scansione direttamente su una piattaforma digitale denominata Caso Center (ngtma.unibe.pathcasecenter). Caso Center è accessibile da qualsiasi luogo con accesso web immettendo il nome utente e la password designato. Annotazione Per le annotazioni, due aspetti devono essere considerati: 1) aree di tessuto differenti devono essere somministrati diversi colori di annotazione e 2) il numero di annotazioni dovrebbero riflettere il numero di copie desiderate del finale ngTMA. In questo caso, sono state selezionate 3 punti per zona tumorale per una singola copia. Per 2 copie, ciascuna regione deve essere annotata con 6 punti. Utile sono di colore verde per il tessuto normale, blu per il centro tumori, giallo per il fronte invasione tumorale, rosso per le aree di tumore in erba (tumore / stroma) interazione, nero per le metastasi linfonodali, turchese di metastasi a distanza e, infine, bianco per le regioni siano utilizzato per i tubi. Annotazione di ciascun caso richiede 2-3 minuti. ngTMA Costruzione Questo studio richiede 6 ngTMA blocchi to essere costruito in 2 copie, con conseguente 12 blocchi finali. Il numero massimo di blocchi di destinatari che possono essere supportato dal Arrayer è 12 Ogni blocco tumore conterrà 402 posti tessuti e ogni blocco tessuto normale conterrà 268 punti, per un totale di 4.556 punti in tutto l&#39;intero progetto. Un layout TMA viene creato per ogni blocco destinatario e il progetto viene salvato (Figure 6A, 6B). 60 blocchi di tessuto possono essere caricati nel microarrayer tessuti in parallelo; l&#39;immagine di ogni blocco donatore è presa. Partendo con il primo blocco donatore, il corrispondente diapositiva digitale annotato viene recuperato da Case Center. Viene eseguita Scivolo corrispondenza, che può richiedere tra 1-3 min. Le annotazioni sono confermate e il Arrayer viene richiesto di avviare la punzonatura (Figura 7). Punzonatura e il tempo di trasferimento Core è di circa 12 sec. Perdita di nuclei durante questa procedura è minimo. Il tempo totale per arraying questo progetto è di circa 24 ore, compreso il tempo per slide / blocco corrispondente e ricarico dello strumento. Alcuni esempi di ngTMA sono illustrati nella Figura 8A. Cores per l&#39;analisi molecolare successive possono anche essere perforati in questo momento (Figura 8B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 A Un blocco) &#39;donatore&#39;. Core del blocco donatore vengono perforati e trasferiti in B) un blocco destinatario, o microarray tissutale (TMA). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Il flusso di lavoro microarray tissutale convenzionale. A) vetrini istologici vengono recuperati dall&#39;archivio e B) dato al patologo F<html> o recensione. CD) annotazioni sono fatte sugli scivoli che indicano la regione &#39;stimato&#39; per il trasferimento. E) I blocchi di tessuto corrispondenti vengono recuperati. F) Blocco e scivolo sono confrontati per la corrispondenza, che possono G) a volte essere un compito impegnativo. HJ ) Tessuto microarraying poi prende posto. K) Cores vengono ripetutamente trasferiti e L) un TMA finale è costruito. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 A) Fino a 25 diapositive può essere posizionato in ogni rivista per la scansione. B) Rettifiche di fattore di qualità e formato può essere fatto. Avanzamento della scansione può essere monitorato. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figura 4 A) Scansione diapositive possono essere caricati sulla piattaforma web-based, causa Center. B) vetrini digitali possono essere visualizzati. Lo strumento di annotazione TMA consente all&#39;utente di selezionare la dimensione e il colore di base necessarie per l&#39;annotazione. C) Le annotazioni possono essere posizionati direttamente sul vetrino digitale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 A) Fino a 60 blocchi può caricare nel microarrayer tessuti, vale a dire 10 blocchi donatori per fila e 12 destinatari blocchi pure. B) Un&#39;immagine di ogni blocco donatore è preso, l&#39;digital diapositiva viene recuperato. Corrispondenza di blocco e scorrevole è fatto e le annotazioni sono utilizzate per il blocco punzonatura. C) Il progresso della arraying può essere monitorato mentre lo strumento è punzonatura. D) Dopo l&#39;esecuzione di punzonatura, un&#39;esportazione della posizione di ogni punto nel layout, ma anche l&#39;immagine di ogni blocco donatore con annotazioni corrispondenti è fatta. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Questi layout TMA sono stati utilizzati per le arraying A) sezioni tumorali e B) tessuti normali. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. Schermata del software microarrayer tessuto. Sulla sinistra, 12 riblocchi cipient possono essere posizionati nello strumento. Sul fondo, sono prese le immagini di ogni blocco donatore. Al centro, il layout TMA, si trova il progresso della punzonatura nonché immagini ingrandite di ogni blocco donatore con annotazioni. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8 A) Alcuni esempi di blocchi ngTMA appena creati. B) punzoni tessuti aggiuntivi possono essere prese per l&#39;analisi molecolare successive. Questi nuclei sono perforati e posti in provette da 0,2 ml. <img alt="Figura 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" width="600" /> Figura 9 Esempi di applicazioni biomarker ngTMA. A) immunoistochimica colorazione Ki67 nel carcinoma del colon-retto. Doppio HER2 immunoistochimica / ibridazione in situ dosaggio mostra B) bassa espressione di proteine ​​(marrone) e nessuna amplificazione del gene HER2 (nero) rispetto al centromero (rosso); C) elevata espressione della proteina (marrone) e amplificazione del gene HER2 ( nero) rispetto al centromero (rosso). D) ibridazione in situ di Her2 mostrando trascritti di mRNA singoli nel cancro al seno ngTMA. E) Immunoistochimica per CD8 nel cancro del colon-retto. F) macchia doppia immunoistochimica per marcatore pan-citocheratina AE1 / AE3 (marrone; cellule tumorali) e CD68 (rosso;. Macrofagi) evidenziando microambiente tumorale nel carcinoma del colon-retto <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

Il protocollo mira a ottimizzare la costruzione e la qualità del tissue microarrays per la ricerca biomarker. Esso comprende aspetti di pianificazione e progettazione, patologia digitale, l&#39;annotazione diapositiva virtuale, e arraying tessuti automatizzato.

Una nuova generazione Tissue Microarray (ngTMA) Protocollo per Biomarker Studi

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

23.9K Views.  University of Bern.  Il protocollo mira a ottimizzare la costruzione e la qualità del tissue microarrays per la ricerca biomarker. Esso comprende aspetti di pianificazione e progettazione, patologia digitale, l'annotazione diapositiva virtuale, e arraying tessuti automatizzato. 

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Manual Construction of a Tissue Microarray using the Tape Method and a Handheld Microarrayer

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single paraffin block. This is achieved by using tissue cores extracted from the region of interest of different donor FFPE blocks and arranging them into a single TMA paraffin block. Once constructed, sections from the completed TMA can be used to perform immunohistochemistry, chromogenic, fluorescence in situ hybridization (FISH) and RNA ISH studies to assess protein expression as well as genomic and transcriptional alterations in many samples simultaneously, thus minimizing tissue usage and reducing reagent costs. There are several different TMA construction techniques. One of the most common construction methods is the recipient method, which works best with cores of the same length for which a minimum length of 4 mm is recommended. Unfortunately, tissue blocks can be heavily resected during the diagnostic process, frequently resulting in "non-ideal" donor block thicknesses of less than 4 mm. The current article and video focus on the double-sided adhesive tape method; an alternative manual, low cost, easy to use, and rapid method to construct low density (&lt;50 cores) TMAs that is highly compatible with these non-ideal donor blocks. This protocol provides a step-by-step guide on how to construct a TMA using this method, with a focus on the critical importance of pathological review and post construction validation.

This protocol outlines the tape method on how to manually construct a tissue microarray using FFPE donor blocks of differing depths.

Costruzione manuale di un microarray di tessuti utilizzando il metodo a nastro e un microarrayer portatile

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically complex tumors, with a high degree of proteomic variability across both the tumor itself and its heterogenous microenvironment. The malignant potential of these tumors is enhanced by the dysregulation of proteins involved in several key pathways, including processes that maintain cellular stability and preserve the structural integrity of the microenvironment. Although there have been numerous bulk and single-cell glioma analyses, there is a relative paucity of spatial stratification of these proteomic data. Understanding differences in spatial distribution of tumorigenic factors and immune cell populations between the intrinsic tumor, invasive edge, and microenvironment offers valuable insight into the mechanisms underlying tumor proliferation and propagation. Digital spatial profiling (DSP) represents a powerful technology that can form the foundation for these important multilayer analyses.
DSP is a method that efficiently quantifies protein expression within user-specified spatial regions in a tissue specimen. DSP is ideal for studying the differential expression of multiple proteins within and across regions of distinction, enabling multiple levels of quantitative and qualitative analysis. The DSP protocol is systematic and user-friendly, allowing for customized spatial analysis of proteomic data. In this experiment, tissue microarrays are constructed from archived glioblastoma core biopsies. Next, a panel of antibodies is selected, targeting proteins of interest within the sample. The antibodies, which are preconjugated to UV-photocleavable DNA oligonucleotides, are then incubated with the tissue sample overnight. Under fluorescence microscopy visualization of the antibodies, regions of interest (ROIs) within which to quantify protein expression are defined with the samples. UV light is then directed at each ROI, cleaving the DNA oligonucleotides. The oligonucleotides are microaspirated and counted within each ROI, quantifying the corresponding protein on a spatial basis.

Proteomic dysregulation plays an important role in the spread of diffusely infiltrating gliomas, but several relevant proteins remain unidentified. Digital spatial processing (DSP) offers an efficient, high-throughput approach for characterizing the differential expression of candidate proteins that may contribute to the invasion and migration of infiltrative gliomas.

Profilazione spaziale digitale per la caratterizzazione del microambiente in gliomi diffusamente infiltranti di tipo adulto

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues 3D per la terapia rigenerativa iniettabile e droga di High-throughput Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Bioingegneria

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. Gene amplification and expression diagnostic testing using archival material or material that requires transportation to servicing laboratories, needs a more robust and accurate test adapted to current clinical workflows. Our research team optimized the use of Invitrogen&#8482; QuantiGene&#8482; Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) to quantify RNA in archival material using branched-DNA (bDNA) technology on Luminex xMAP&#174; magnetic beads. The gene expression assay described in this manuscript is a novel, quick, and multiplex method that can accurately classify breast cancer into the different molecular subtypes, omitting the subjectivity of interpretation inherent in imaging techniques. In addition, due to the low input of material required, heterogeneous tumors can be laser microdissected using Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections. This method has a wide range of possible applications including tumor classification with diagnostic potential and measurement of biomarkers in liquid biopsies, which would allow better patient management and disease monitoring. In addition, the quantitative measurement of biomarkers in archival material is useful in oncology research with access to libraries of clinically-annotated material, in which retrospective studies can validate potential biomarkers and their clinical outcome correlation.

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. This manuscript describes the optimization of a panel of biomarkers using a multiplex magnetic bead assay to classify breast cancers.

Ottimizzazione di un'analisi di espressione di RNA-ha basato multisala usando materiale archivistico di cancro al seno

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast cancers. However, a minority of cases displays a heterogeneous distribution of HER2-positive cells, which generates major clinical challenges. To date, no reliable and standardized protocols for the characterization and quantification of HER2 heterogeneous gene amplification in large cohorts have been proposed. Here, we present a high-throughput methodology to simultaneously assess the HER2 status across different topographic areas of multiple breast cancers. In particular, we illustrate the laboratory procedure to construct enhanced tissue microarrays (TMAs) incorporating a targeted mapping of the tumors. All TMA parameters have been specifically optimized for the silver in situ hybridization (SISH) of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) breast tissues. Immunohistochemical analysis of the prognostic and predictive biomarkers (i.e., ER, PR, Ki67, and HER2) should be performed using automated procedures. A customized SISH protocol has been implemented to allow a high-quality molecular analysis across multiple tissues that underwent different fixation, processing, and storage procedures. In this study, we provide a proof-of-principle that specific DNA sequences could be localized simultaneously in distinct topographic areas of multiple and heterogeneously processed breast cancers using an efficient and cost-effective method.

Heterogeneous distribution of HER2-positive cells can be observed in a subset of breast cancers and generates clinical dilemmas. Here, we introduce a reliable and cost-effective protocol to define, quantify, and compare HER2 intra-tumor genetic heterogeneity in a large series of heterogeneously processed breast cancers.

Costruire una piattaforma di High-throughput Screening per valutare l'eterogeneità dell'amplificazione del Gene HER2 nei cancri al seno

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

Immunologia e infezioni

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

Produzione di Microarrays tessuto, colorazione immunoistochimica e digitalizzazione All&#39;interno della Atlas proteina umana

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Biologia

Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment response challenging. The ability to resolve the relative populations of immune cells present in and around the tumor tissue has been shown to be clinically-relevant to understanding response, but is limited by traditional techniques such as flow cytometry and immunohistochemistry (IHC), due the large amount of tissue required, lack of accurate cell type markers, and many technical and logistical hurdles. One assay (e.g., the ImmunoPrism Immune Profiling Assay) overcomes these challenges by accommodating both small amounts of RNA and highly degraded RNA, common features of RNA extracted from clinically archived solid tumor tissue. The assay is accessed via a reagent kit and cloud-based informatics that provides an end-to-end quantitative, high-throughput immuno-profiling solution for Illumina sequencing platforms. Researchers start with as few as two sections of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue or 20-40 ng of total RNA (depending on sample quality), and the protocol generates an immune profile report quantifying eight immune cell types and ten immune escape genes, capturing a complete view of the tumor microenvironment. No additional bioinformatic analysis is required to make use of the resulting data. With the appropriate sample cohorts, the protocol may also be used to identify statistically significant biomarkers within a patient population of interest.

The use of an RNA-based approach to determine quantitative immune profiles of solid tumor tissues and leverage clinical cohorts for immune-oncology biomarker discovery is described through a molecular and informatics protocols.

Modellazione immunitaria predittiva dei tumori solidi

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue microarrays make up the majority of multi-tissue paraffin blocks, but increasingly, researchers are using non-arrayed blocks containing larger tissues from multiple individuals which can provide many of the advantages of tissue microarrays without substantial investment in planning and equipment. A critical component of any multi-tissue analysis is the orientation method used to identify each individual tissue. Although methods exist to maintain proper orientation and identification of tissues in multi-tissue blocks, most are not well-suited to non-arrayed blocks, may consume valuable space within an array and/or are difficult to produce in the standard histology laboratory. The Specimen Orientation Tag (SpOT) is a simple, low cost orientation tool that is clearly visible in paraffin blocks and all tissue sections for reliable specimen identification in arrayed and non-arrayed layouts. The SpOT provides advantages over existing orientation methods for non-arrayed blocks as it does not require any direct modification to the tissue and allows for flexibility in the arrangement of tissue pieces.

The purpose of the Specimen Orientation Tag (SpOT) is to function as an orientation tool to aid in individual tissue identification in multi-tissue paraffin blocks. These protocols demonstrate how it is constructed easily from common, low-cost histology materials and serves as a reliable visual marker in paraffin blocks and sections.

SPOT Tissue corretto ogni volta in blocchi multi-tessuto

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

La quantificazione di espressione della proteina e co-localizzazione Usando multiplex immunoistochimica di colorazione e multispettrale Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Preparazione core tessuto inclusi in paraffina fissati in formalina per entrambi RNA e DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...