Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Wellcome Trust (Rif.: 084277).

1. Cerebellare granuli Preparazione Neuron <ol><li> Autoclave di circa 100 25 coprioggetto mm di diametro (Tabella 1). </li><li> Coprioggetto posto in un tubo da 50 ml sterili contenenti sterile poli-D-lisina soluzione (Tabella 2). Posto su una piattaforma rotante per 2 ore per rivestire i coprioggetti. </li><li> Secco coprioggetto rivestito su carta velina sterile in una cappa a flusso laminare (Tabella 1). </li><li> Coprioggetto posto in sterili 6 pozzetti e Coprivetrini caldo in un 2 CO incubatore (Tabella 1). Può essere conservato per 1 mese a 4 ° C per prima dell&#39;uso. </li><li> Euthanize un 7 giorno di vita ratti Sprague Dawley cucciolo secondo le linee guida del comitato etico locale. Abbiamo cuccioli di eutanasia mediante dislocazione cervicale. </li><li> Sezionare il cervelletto e mettetelo in una piastra di Petri sterile contenente un tampone fosfato soluzione di sali (soluzione B, tabella 3). </li><li> Ripetere i passi 1.5 e 1.6 per 4-6 cuccioli di ratto. </li><li> Cervelletti vengono poi immessi sul palco sterile di un tessuto McIlwain Chopper (Tabella 1). Tessuto viene tagliato a 375 micron intervalli prima di ruotare la fase di 90 ° e ripetere il processo. </li><li> Il cervello dei pezzetti vengono trasferiti in una soluzione di tripsina (soluzione T, tabella 4) che erano stati precedentemente riscaldato a 37 ° C. </li><li> Cervello dei incubare a 37 ° C per 20 minuti con agitazione ogni circa 5 minuti. </li><li> Durante la digestione trittico, fiamma lucidare tre pipette di vetro sterile (Tabella 1) utilizzando una fiamma Bunsen. Utilizzare la fiamma per creare un foro fine, un foro di medie e di un foro largo alla imboccatura delle pipette. </li><li> Dopo 20 min di incubazione a T soluzione, aggiungere 20 ml di tripsina / DNasi soluzione inibitore (soluzione W, Tabella 5) alla sospensione del cervelletto e le cellule pellet a 1.000 g per 1 minuto in una centrifuga da banco (Tabella 1). </li><li> Decantare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1,5 ml di un concentrato tripsina / DNasi inibitore (soluzione C, tabella 6) con la più ampia pipetta foro. </li><li&gt; Triturare le cellule utilizzando prima la pipetta ampio foro, poi il mezzo foro e, infine, il foro stretto fino a quando la sospensione cellulare è omogenea. Questo è un passo fondamentale, la sospensione deve essere omogenea in questa fase. </li><li> Strato la sospensione cellulare in cima alla 10 ml di una preriscaldata (37 ° C), sieroalbumina bovina integrato Earles soluzione equilibrata Sali (Tabella 7) in un tubo sterile 15 ml. </li><li> Centrifugare la sospensione per 5 min a 1.500 g e risospendere il pellet di cellule in 2 ml di preriscaldata (37 ° C), terreno di coltura (Tabella 8). </li><li> Stimare il numero delle celle utilizzando un emocitometro (Tabella 1) e diluire la sospensione cellulare ad una densità finale di 3,3 x 10 6 cellule per ml. </li><li> Le cellule sono placcati con l&#39;aggiunta di 75 ml di sospensione cellulare al centro della poli-D-lisina rivestite coprioggetti (finale densità di 2,5 x 10 5). </li><li> Le piastre di coltura contenente i coprioggetti vengono inseriti nella CO 2 incubatore per 60 minuti per consentire alle cellule ad undhere. </li><li> Aggiungere 1,5 ml di terreno di coltura in ogni pozzetto facendo attenzione a non disturbare le cellule placcato e restituire i piatti della cultura alla CO 2 incubatore. </li><li> Il giorno seguente sostituire il terreno di coltura con il terreno di coltura fresco integrato con il arabinoside inibitore mitotico citosina (Tabella 8). Arresti Questa proliferazione di cellule gliali in coltura. </li></ol> 2. Setup sperimentale <ol><li> Base sperimentale dovrebbe consistere dei seguenti elementi (vedi tabelle 1 e 9 per attrezzature specifiche e software utilizzati): <ul><li> Invertita epi-microscopio a fluorescenza </li><li> Telecamera CCD raffreddato </li><li> Fonte di luce fluorescente (monocromatore o ruota filtro) </li><li> Gravity perfusione apparato </li><li> Camera di imaging con elettrodi di platino paralleli </li><li> Stimolatore elettrico </li><li> Computer </li><li> Acquisizione di immagini software </li></ul></li><li> Gli esperimenti devono essere eseguiti al buio o sotto cond luce rossaitions con un minimo di illuminazione fluorescente del campione per evitare di tingere FM sbiancamento. </li><li> Esperimenti siano condotti a temperatura ambiente. Se la temperatura fisiologica è richiesto, a temperatura controllata sistema di perfusione possono essere utilizzati. </li></ol> 3. Preparazione del campione <ol><li> Culture deve essere usato dopo 8-12 giorni in vitro. </li><li> Trasferire un coprioggetto singola soluzione salina (tabella 10) per 10 minuti a temperatura ambiente per permettere la stabilizzazione nel nuovo medium. </li><li> Rimuovere il vetrino, asciugare la sua parte inferiore e la zona che circonda le cellule allegato con un piccolo pezzo di tovagliolo di carta o carta assorbente. </li><li> Con grasso al silicone (Tabella 2), incollare il coprioggetto alla parte inferiore della camera di imaging. Le cellule dovrebbero essere tra i due fili paralleli. Grasso al silicone sufficiente dovrebbe essere utilizzato per sigillare completamente la stanza, ma senza alcun grasso entrare nel centro della camera da bagno. </li><li> Delicatamente riempire la camera da bagno con ~ 260 microlitri salinea di soluzione e quindi riempire il tubo di ingresso con la stessa soluzione. </li><li> Colla un coprioggetto pulito con grasso al silicone nella parte superiore della camera di sigillarla. Il tubo di ingresso e uscita può essere usato per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria intrappolate nella camera. E &#39;importante che il circuito elettrico non è interrotta da bolle d&#39;aria. </li><li> Immobilizzare la camera di imaging in una piattaforma in acciaio inox e controllare eventuali perdite con delicatezza perfusione soluzione salina attraverso il tubo di ingresso. </li><li> Montare la camera montata sul palcoscenico di un microscopio invertito, e collegare la camera ad un sistema di perfusione gravità, dopo aver innescato l&#39;ingresso con una soluzione salina. </li><li> Collegare i fili di collegamento della camera allo stimolatore elettrico. </li><li> Aggiungere una goccia di olio di immersione con l&#39;obiettivo, se una lente olio viene utilizzato. Concentrarsi sulle cellule in mezzo la camera con illuminazione brillante campo. </li></ol> 4. S1 fase <ol><li> Neuroni profumato con 1,5 mldi FM colorante (Tabella 2) diluito in soluzione salina. </li><li> Stimolare i neuroni per evocare l&#39;assorbimento colorante utilizzando lo stimolatore allegato. </li><li> Dopo la stimolazione, i neuroni profumato con fresco soluzione salina per 2 minuti per lavare via l&#39;eccesso FM colorante (portata 7 ml / min). Contaminazione gliali nel sistema cultura CGN è inferiore al 5% 14, quindi questo lasso di tempo è sufficiente a rimuovere la tintura . </li><li> Lasciare i neuroni a riposo per 8 min. </li><li> Durante questo intervallo, individuare reti assonale in cui i singoli FM dye-caricato terminazioni nervose sono visibili usando lunghezze d&#39;onda fluoresceina (eccitazione, 480 nm di emissione,&gt; 550 nm). Evitare le zone con i cluster di cellule. Tenere illuminazione al minimo a questo punto, dato eccitazione intensa può causare fototossicità tintura. Segni evidenti di questo sono blebbing degli assoni e la mancanza di colorante scarico (a causa di tintura di fissaggio). </li><li> Ri-messa a fuoco dell&#39;immagine immediatamente prima acquisizione delle immagini in quanto una deriva leggera potrebbe essersi verificato durante il periodo di riposo. </li&gt; <li> Iniziare time-lapse di acquisizione di immagini al ritmo di 1 fotogramma ogni 4 s. </li><li> Dopo aver acquisito 5-10 immagini al basale, evocano esocitosi del PRR fornendo una stimolazione 30 Hz per 2 s (60 potenziali d&#39;azione) 8 Iniziare la stimolazione manuale subito dopo la cattura del telaio.. </li><li> Dopo l&#39;acquisizione di altre 10 immagini, evocano esocitosi SV del RP utilizzando tre stimoli di 40 Hz per 10 s (400 potenziali d&#39;azione), a parte ogni 30 s 8. </li><li> Acquisire un altro 5-10 immagini e poi l&#39;acquisizione di immagini pausa. </li></ol> 5. Fase di recupero (vedi Figura 2) <ol><li> Permettono ai neuroni di recuperare nell&#39;arco di almeno 20 min. </li><li> Opzionale - Se l&#39;effetto di un farmaco su endocitosi è da testare, i neuroni perfusione con una soluzione di farmaci in questo periodo (Figura 2b) 3,8. </li></ol> 6. Fase S2 <ol><li> Ripetere il protocollo di fase S1 (sezione 4) per un esperimento di controllo utilizzando lo stesso campo di vistain S1. </li><li> Opzionale - Se l&#39;effetto di un farmaco su endocitosi è da provare, profumato neuroni con la soluzione di droga FM integrata con colorante (Figura 2b) 3,8. </li><li> Opzionale - In alternativa, se gli effetti dei farmaci sul esocitosi sono di interesse, i neuroni profumato con la soluzione della droga sia prima che durante il PRR e RP stimoli scarico (Figura 2c) 3. </li></ol> 7. Analisi dei dati <ol><li> Usa ImageJ e Microsoft Excel o un software simile per l&#39;analisi dei dati. </li><li> Per l&#39;analisi, una sequenza di immagini in formato pila è richiesto. Alcuni software di imaging può esportare sequenze di immagini singole. Se questo è il caso, convertire le immagini in uno stack con un ImageJ built-in funzione Immagine&gt; Stack&gt; Immagini di stack. </li><li> Regolare la luminosità e il contrasto dello stack per massimizzare la gamma dinamica. Immagine&gt; Regolazioni&gt; Luminosità / Contrasto (Figura 3a). </li><li> Se significativo deriva orizzontale si è verificato durante tlui esperimento, eseguire StackReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</a> ) e TurboReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</a> ) plugin per ImageJ per allineare serie di immagini (Figura 3b) . </li><li> Run Time Series Analyzer plugin ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</a> ) (Figura 3c). </li><li> Definire le aree di interesse (ROI) su almeno il 90 terminazioni nervose. Questi dovrebbero essere identici (ROI circolare con diametro di 1,5 micron) E &#39;utile per passare tra le immagini prima e dopo la tintura di scarico per rivelare terminazioni nervose attivo (in alternativa, un pre-stimolazione immagine può essere sottratto da un post-stimolazione immagine). Un ideale dimensioni ROI è uno che è leggermente più grande di una terminazione nervosa tipica (Figura 3c). </li><li> Ottenere la totale / integrato intensità di fluorescenza di ogni ROI oltre time ed esportare in Microsoft Excel (Figura 3d e 4a). </li><li> Normalise tracce ROI allo stesso valore arbitrario allineando le tracce nel piano l&#39;asse Y per il primo stimolo scarico nelle fasi sia S1 che S2 (Figura 4b-c). Questo è il controllo per piccole variazioni di intensità di fluorescenza di fondo. </li><li> Misurare la diminuzione assoluta della fluorescenza evocati da ogni stimolo scarico in unità arbitrarie di fluorescenza per S1 e S2 nel modo seguente (Figura 4d): <ul><li> RRP = Variazione fluorescenza (ΔF) attivate da 30 Hz 2 s </li><li> RP = somma dei ΔF innescato da 3 x 40 Hz 10 s </li><li> Il riciclo del pool totale = RRP + RP </li></ul></li><li> Per ogni parametro rilevante in 7,9, calcolare il valore medio su tutte le terminazioni nervose di un singolo esperimento. </li><li> Per l&#39;analisi statistica, i valori medi ottenuti da molteplici esperimenti indipendenti, possono essere calcolati come medie. Il numero di lamelle piuttosto che il numero di terminazioni nervose devono essere utilizzati come statistical n. </li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: Un esperimento di controllo dove CGN ha subito due turni di identiche fasi di carico e scarico è rappresentato nella Figura 5. Quando si inizia una serie di esperimenti, è essenziale che un esperimento di controllo come questo viene eseguito ogni giorno per confermare che S1 e S2 sono paragonabili prima di diverse condizioni sperimentali durante la S2. In questo esempio, CGN sono stati caricati con 10 mM FM1-43 con un 80 10 Hz stimolazione s (figura 5a). Figura 5b mostra FM1-43-caricato terminazioni nervose fluorescenti rappresentato da puncta. ROI sono state definite oltre 90 terminali nervosi come mostrato in Figura 5c. Lo stesso insieme di ROI è stato utilizzato sia per S1 e S2. Durante entrambe le scarica, il PRR è stato scaricato con un Hz 30 (2 s) stimolazione seguita da RP scarico con 3 40Hz sequenziale (10 s) stimoli (figura 5a). La caduta di fluorescenza durante ogni stimolo può essere chiaramente osservato e quantificato (Figura 5d-e).<html> Se esaminato, la fluorescenza gocce corrispondente al PRR, RP e il riciclo del pool totale sono stati paragonabili nei due S1 e S2. Inoltre, il 20% di riciclato SV risiedeva nel PRR mentre l&#39;80% risiedeva nelle RP, sia S1 e S2. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig1.jpg" /> Figura 1 Schema di un tipico esperimento FM. A) endocitosi SV viene attivato in presenza di FM colorante (rappresentato in verde). Il colorante è occupato da una membrana invaginating (SV singolo o alla rinfusa endosomi). B) Non interiorizzato colorante sulla membrana plasmatica viene lavato via dalla perfusione. C) Su richiesta di uno stimolo scarico, etichettati SV che si sono resi disponibili per fusibile rilascio con la membrana plasmatica con conseguente perdita di fluorescenza. D) La variazione di fluorescenza (ΔF) che è proporzionale alla quantità di rilascio etichettati SV possono essere quantificati. _upload/3143/3143fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2 Diagrammi di possibili protocolli sperimentali. A) Diagramma di flusso di un esperimento di controllo in cui le cellule subiscono due giri di FM tintura di carico e scarico (S1 e S2). Le celle possono essere caricati utilizzando una gamma di stimoli diversi. Fasi di scarico sono identici in quanto il PRR viene scaricato con 30 Hz per 2 s seguita da RP scarico utilizzando 3 volte 40 Hz per 10 s. RRP e prenotare piscina stimoli scarico sono separati da 40 secondi, tutti gli altri stimoli da 30 sec. Le cellule vengono lasciate a recuperare per 20 minuti tra S1 e S2. Diagrammi di flusso di eventuali modifiche di testare l&#39;effetto di una sostanza su entrambi B) endocitosi o C) esocitosi sono mostrati. Farmaco di prova corrispondenti possono essere irrorate nella camera durante i periodi indicati. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig3.jpg" /> Figura 3 Screenshot di analisi dei dati in J immagini. Screenshot sono mostratiper A) regolazione di luminosità e contrasto, B) l&#39;allineamento del telaio, C) selezione ROI e D) l&#39;estrazione di intensità valori utilizzando immagini J. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig4.jpg" /> Figura 4 Screenshot di analisi dei dati in Microsoft Excel. Gli screenshot sono indicati per A) di importare i dati grezzi da immagine J (1 ° colonna = numero di frame, colonne = dati dai terminali nervosi individuali) B) adeguamento dei valori di base S1 (telaio 10) per un valore arbitrario (200) alla partenza del primo stimolo, C) adeguamento dei valori di base S2 a 55 fotogrammi utilizzando un protocollo identico a S1, e D) la misura di gocce di fluorescenza utilizzando Microsoft Excel. Si noti che la traccia media mostrato in D viene utilizzato per definire i punti prima e dopo ogni goccia. La dimensione delle gocce fluorescenza per ogni ROI deve essere determinato dai valori sul foglio mostrato in C. <img alt="Figura 5" src = &quot;/ files/ftp_upload/3143/3143fig5.jpg&quot; /&gt; Figura 5. Rappresentante di controllo esperimento. A) Diagramma di flusso di un esperimento di controllo in cui sono stati caricati CGN con 10μM FM1-43 con 80 Hz (10 s) la stimolazione. Le fasi di S1 ​​e S2 sono identici. RRP e prenotare piscina stimoli scarico sono separati da 40 secondi, tutti gli altri stimoli da 30 sec. B) Un&#39;immagine che mostra terminazioni nervose caricato con FM1-43. C) La stessa immagine che mostra come B 90 ROI numerati selezionati per l&#39;analisi. D) Immagini di un territorio rappresentato da un riquadro rosso in B nei punti di tempo selezionato. = Basale, prima della stimolazione; 30 Hz = dopo stimolazione 30 Hz 2 s, 40 Hz = 1,2,3 dopo ogni stimolo 40 Hz. 10 s. Queste immagini sono presentate in pseudocolori per illustrare i cambiamenti in fluorescenza (barra dello spettro visualizzato a destra). E) Media ± SEM traccia ottenuto da 90 terminali nervosi rappresentato in C. stimoli individuali sono rappresentate da barre orizzontali. Barre di scala = 10 micron.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Coloranti FM sono ampiamente utilizzati per studiare la funzione del nervo terminale in molte preparazioni neuronali. Sono stati impiegati principalmente per monitorare l&#39;estensione di entrambi endocitosi SV, il fatturato SV o la cinetica di esocitosi 6. Il protocollo descritto estende questi studi per esaminare il differenziale scarico di specifiche piscine SV. Questo fornisce ulteriori informazioni riguardanti il ​​rifornimento di piscine SV e anche il loro grado di mobilitazione. Coloranti FM può essere utilizzato per etichettare vari cicli di riciclaggio all&#39;interno della SV terminazioni nervose stesse. Abbiamo sfruttato questa proprietà e progettato protocolli in cui fatturato SV in ogni terminale può essere monitorato due volte nella stessa terminazioni nervose. Questo fornisce un accurato controllo interno, che è essenziale per la natura eterogenea del riciclaggio SV nei terminali nervosi paralleli 11. Attraverso l&#39;uso della fase S1 come controllo interno, la ricarica del PRR, RP e il totalePiscina SV in presenza di farmaci può essere affidabile e confrontate direttamente. Oltre a fornire informazioni la dimensione assoluta del riciclo, piscine RRP e RP in condizioni di stimolazione diversi, questo protocollo può anche fornire i dati per i seguenti - 1) Il partizionamento di SV tra il PRR e RP in funzione della piscina riciclaggio per S1 e S2, 2) la dimensione relativa delle piscine S2 (RRP e RP) in funzione del totale riciclo del pool di S1 ​​e 3) la dimensione relativa di ogni piscina SV definite in S2 in funzione della piscina stessa in S1. Questo protocollo particolare, non forniscono informazioni sulla cinetica di scarico tuttavia, poiché il tempo di acquisizione è troppo lento (per misurazioni cinetiche tempi di acquisizione deve essere il più rapido possibile e scarico automaticamente sincronizzati per la cattura delle immagini). I nostri 30 Hz 2 stimoli s evoca una misura identica di RRP scarico di saccarosio ipertonico 8. Dal momento che la dimensione del PRRè definita da saccarosio ipertonico scarico 15, possiamo affermare che questo protocollo scarica tutte SV RRP, in accordo con studi in neuroni dell&#39;ippocampo 16. Il pool di riserva è quasi completamente esaurita da tre treni di 400 stimoli (40 Hz 10 s ciascuno) in quanto questa stimolazione scarica una quantità identica di colorante ad un paradigma (2 stimoli con mM KCl 50) che consuma il 95% di tutti i coloranti etichettati SVs 8,17. Quantificazione precisa delle dimensioni sia del PRR e prenotare piscina dipende anche dalla acquisizione di informazioni all&#39;interno del range dinamico lineare della camera CCD. Questo semplice protocollo può anche essere ulteriormente modificata. La forza di stimoli di carico può essere variato per determinare come l&#39;attività neuronale e le modalità di endocitosi diverse influenzano la ricarica piscina SV. Inoltre, maggiore di due cicli di carico e scarico può anche essere eseguita, se necessario. Questo protocollo può essere utilizzata anche in cellule trasfettate sia con iperespressione oshRNA vettori. A causa della bassa efficienza di trasfezione di colture primarie di neuroni, proteine ​​espresse devono essere contrassegnati con proteine ​​fluorescenti. È essenziale che queste etichette fluorescenti non interferiscono con il segnale FM colorante (uso ciano o proteine ​​rosso, per esempio). In questo caso, terminazioni nervose dalle cellule trasfettate e non transfettate nello stesso campo di vista può anche essere paragonato come un ulteriore controllo 8. In tali esperimenti un confronto tra la portata di carico tra i carichi S1 e S2 è di poco valore, dal momento che la perturbazione è presente durante entrambi i carichi. Partizionamento di colorante tra piscine SV può ancora essere visualizzati comunque 8. Giornalisti genetica chiamata pHluorins può anche essere impiegato per monitorare SV esocitosi e endocitosi nella scuola primaria la cultura neuronale. Queste sonde utilizzano un pH-sensibile proteina fluorescente verde per l&#39;ambiente pH luminale di domini di proteine ​​tag SV come VAMP, sinaptofisina e VGLUT1 18 </sup&gt;. Se utilizzato in combinazione con inibitori della vescicolare ATPasi, pHluorins possibile segnalare sia la cinetica e la portata della mobilitazione piscina SV 19. L&#39;FM-dye approccio qui descritto ha alcuni vantaggi rispetto alla tecnica pHluorin, In primo luogo, coloranti FM fornire informazioni sulle modalità di endocitosi SV che riempie il PRR e piscine riserva 8. In secondo luogo specifico piscine SV possono essere etichettati con coloranti FM che hanno differenti proprietà spettrali 20 e infine vi è alcun obbligo per la trasfezione. Coloranti FM non può fornire informazioni sul traffico SV tra il riposo e il riciclaggio piscine SV tuttavia (a differenza di pHluorins 19), dal momento che, per definizione, SV devono essere caricati con colorante durante endocitosi per essere visibili. Così entrambi i coloranti FM e pHluorins hanno punti di forza e di debolezza e sono più potenti quando viene utilizzata in esperimenti indipendenti, per affrontare la stessa domanda. Immagini di alta qualità sono essenziali per l&#39;analisi valide e reproducibLe risultati. Mentre deriva orizzontale può essere facilmente corretto, esperimenti in cui vi è una deriva nella Z-asse non può essere recuperato. Per questo motivo, è importante ri-fuoco le immagini prima di iniziare la scarica S1 e S2. Nei casi in cui un decadimento significativo fluorescente si è verificato, correzioni decadimento può essere applicato (di solito sottraendo una traccia precedentemente registrato da FM-caricato le cellule in assenza di stimolazione). Tuttavia, si suggerisce che la correzione di decadimento viene eseguita solo per la rappresentazione grafica e di non essere utilizzato per qualsiasi analisi quantitativa.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Catalogo no. </th></tr><tr><td> AxioCam MRM Rev. 3 Fotocamera Digitale </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4265099901000 </td></tr><tr><td> Axio Observer.A1 Microscopio </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4310040000000 </td></tr><tr><td> Piastre di coltura cellulare (6 pozzi) </td><td> Greiner bio-one </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Centrifuga (Universal 32R) </td><td> Hettich Zentrifugen </td><td> 1610 </td></tr><tr><td> CO 2 incubatore </td><td> Heraeus Instruments </td><td> 51014042 </td></tr><tr><td> Provette Falcon (15/50 ml) </td><td> Greiner bio-one </td><td> 188271/210261 </td></tr><tr><td> Fluar 20X / 0,75 ∞ / 0,17 Obiettivo </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4401459901000 </td></tr><tr><td> Vetro coprioggetti (Ø25mm) </td><td> VWR International </td><td> 631-1584 </td></tr><tr><td> Pipetta Pasteur in vetro (230 nm) </td><td> Greiner bio-one </td><td> 612-1799 </td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td> VWR </td><td> 15170-170 </td></tr><tr><td> Imaging Camera </td><td> Ammonitore </td><td> RC-21 BRFS </td></tr><tr><td> Cappa a flusso laminare </td><td> Biohit </td><td> VLF BHS 1200 </td></tr><tr><td> McIlwain Tissue Chopper </td><td> Mickle Laboratorio Engineering Co. Ltd. </td><td> MTC / 2 </td></tr><tr><td> Lampada al mercurio </td><td> Carl Zeiss </td><td> HBO 103 </td></tr><tr><td> MultiStim Impianto elettrico stimolatore (100 mV, 1 ms larghezza pluse) </td><td> Digitimer Ltd. </td><td> D330 </td></tr><tr><td> Perfusione pompa </td><td> Watson-Marlow </td><td> 313S </td></tr><tr><td> Pipette sierologiche (5/10/25 ml) </td><td> Greiner bio-one </td><td> 606180/607180/760180 </td></tr><tr><td> Shutter Controller </td><td> Carl Zeiss </td><td> MAC5000 </td></tr><tr><td> Siringa (20 ml) </td><td> BD Plastipak </td><td> ST01-B002 </td></tr><tr><td> Filtri per siringa (Minisart - 0,20 micron) </td><td> Sartorius Stedim </td><td> 16532 </td></tr><tr><td> VC-6 a sei canali per valvole </td><td> Ammonitore </td><td> 64-0135 </td></tr><tr><td> YFP Filter set (Set 46) </td><td> Carl Zeiss </td><td> 1196-681 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Attrezzature specifiche e le apparecchiature utilizzate <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Catalogo no. </th><th> Concentrazione </th></tr><tr><td> FM1-43 </td><td> BioScience Cambridge </td><td> BT70021 </td><td> 10 micron </td></tr><tr><td> FM2-10 </td><td> BioScience Cambridge </td><td> BT70044 </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> Poly-D-lisina </td><td> Sigma </td><td> P7886 </td><td> 15 mcg / ml </td></tr><tr><td> Grasso al silicone </td><td> Sigma </td><td> 85403 </td><td align="center"> - </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Reagenti specifici utilizzati <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Catalogo no. </th><th> Concentrazione </th></tr><tr><td> Sieroalbumina bovina (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td> 0,3% </td></tr><tr><td> D-glucosio </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td><td> 0,25% </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2773 </td><td> 1,5 mM </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300 </td><td> 960 mg/100 ml </td></tr></tbody></table> -Make 100ml fresca per ogni preparazione -Filtro sterile prima dell&#39;uso Tabella 3. Soluzione B per la preparazione CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Catalogo no. </th><th> Concentrazione </th></tr><tr><td> Soluzione B </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 19 ml </td></tr><tr><td> Tripsina (5 mg / ml di brodo, -20 ° C) </td><td> Sigma </td><td> T9201 </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 4. T soluzione per la preparazione CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Catalogo no. </th><th> Concentrazione </th></tr><tr><td> Soluzione C </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 3,2 ml </td></tr><tr><td> Soluzione B </td><td align= &quot;Center&quot;&gt; - </td><td align="center"> - </td><td> 16,8 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 5. Soluzione W per CGN preparazione <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Catalogo no. </th><th> Concentrazione </th></tr><tr><td> Deossiribonucleasi (DNasi, 500 U per 0,5 ml di magazzino, -20 ° C) </td><td> Sigma </td><td> D5025 </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2773 </td><td> 1,5 mM </td></tr><tr><td> Soluzione B </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Inibitore della tripsina di soia (SBTI, 0,5 mg per 0,5 ml di magazzino, -20 ° C) </td><td> Sigma </td><td> T9003 </td><td> 0,5 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 6. Soluzione C per la preparazione CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Catalogo no. </th><th> Concentrazione </th></tr><tr><td> Sieroalbumina bovina (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Salt Earle soluzione equilibrata (EBSS) </td><td> Gibco </td><td> 24010 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2773 </td><td> 3 mM </td></tr></tbody></table> Tabella 7. Soluzione EBSS per la preparazione CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Catalogo no. </th><th> Concentrazione </th></tr><tr><td> Citosina β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * </td><td> Sigma </td><td> C1768 </td><td> 10 micron </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Gibco </td><td> 10106 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> D-glucosio </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> Sigma </td><td> G3126 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> Minimal Medium (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 21090 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Penicillina (P) / Streptomicina (S) </td&gt; <td> Gibco </td><td> 15140 </td><td> 100 U / ml (P), 100 mg / ml (S) </td></tr></tbody></table> * Ara-C deve essere aggiunto alla media decorrere dal 1 ° DIV Tabella 8. Terreni di coltura per la preparazione CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Versione </th><th> Azienda </th></tr><tr><td> AxioVision Rel.. </td><td> 4,8 </td><td> Carl Zeiss </td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> 1.42q </td><td> National Institutes of Health </td></tr><tr><td> Microsoft Excel </td><td> 2003 </td><td> Microsoft </td></tr></tbody></table> Tabella 9. Software specifici utilizzati <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Catalogo no. </th><th> Concentrazione </th></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C7902 </td><td> 1,3 mm </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> 3,5 mm </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td> 0,4 mm </td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> 1,2 mm </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fluka </td><td> 71378 </td><td> 170 mm </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71627 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Na 2 SO 4 </td><td> BDH da Laboratorio </td><td> 10264 </td><td> 1,2 mm </td></tr><tr><td> TES </td><td> Sigma </td><td> T1375 </td><td> 20 mM </td></tr></tbody></table> Tabella 10. Soluzione salina (pH 7,4)

quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using fm dyes

Dopo il rilascio del neurotrasmettitore nei terminali nervosi centrali, SV sono rapidamente recuperati da endocitosi. Estratto SV sono poi riempiti con i neurotrasmettitori e raggiungere la piscina di riciclaggio, definito come SV che sono disponibili per 1,2 esocitosi. Il pool di riciclo possono essere generalmente suddivisi in due gruppi distinti - la piscina facilmente scaricabile (RRP) e il pool di riserva (RP). Come i loro nomi, il PRR è costituito da SV che sono immediatamente disponibili per la fusione, mentre RP SV vengono rilasciati solo durante 1,2 intensa stimolazione. E &#39;importante avere un test affidabile che riporta la ricostituzione differenziale di queste piscine SV al fine di capire 1) come il traffico SV dopo diverse modalità di endocitosi (come endocitosi clatrina-dipendenti e di attività-dipendente endocitosi bulk) e 2) i meccanismi controllare la mobilitazione sia del PRR e RP in risposta a stimoli diversi. Coloranti FM sono sistematicamente impieganoed a segnalare quantitativamente fatturato SV nei terminali nervosi centrali 3-8. Hanno una coda idrofoba di idrocarburi che permette il partizionamento reversibile nel doppio strato lipidico, e un gruppo di testa idrofila che blocca il passaggio attraverso le membrane. I coloranti hanno poco a fluorescenza in soluzione acquosa, ma la loro resa quantica aumenta notevolmente quando partizionato in membrana 9. Così coloranti FM sono ideali sonde fluorescenti per il monitoraggio attivo riciclaggio SV. Il protocollo standard per l&#39;utilizzo di FM tintura è il seguente. In primo luogo esse sono applicate ai neuroni e sono assorbite durante endocitosi (Figura 1). Dopo non interiorizzato colorante viene lavato via dalla membrana plasmatica, riciclati ridistribuire SV all&#39;interno del pool di riciclaggio. Queste SV sono poi esauriti utilizzando stimoli scarico (Figura 1). Dal FM etichettatura tintura di SV è quantali 10, il calo di fluorescenza risultante è proporzionale alla quantità di vescicole rilasciato. Così, il riciclaggio e la fusione di SV generati dalla prtondo evious di endocitosi può essere attendibilmente quantificati. Qui, presentiamo un protocollo che è stato modificato per ottenere due ulteriori elementi di informazione. In primo luogo, gli stimoli sequenziali di scarico vengono utilizzati per scaricare in modo differenziato il PRR e RP, per consentire la quantificazione del rifornimento di specifiche piscine SV. In secondo luogo, ogni terminale del nervo subisce il protocollo due volte. Quindi, la risposta del terminale stesso nervo a S1 può essere confrontata con la presenza di una sostanza in esame nella fase S2 (Figura 2), fornendo un controllo interno. Questo è importante, dal momento che l&#39;entità del riciclaggio SV attraverso i terminali nervosi diversi è molto variabile 11. Ogni aderente colture primarie neuronali possono essere utilizzati per questo protocollo, ma la densità di placcatura, le soluzioni e le condizioni di stimolazione sono ottimizzati per i neuroni granulari del cervelletto (CGN) 12,13.

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Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Una tecnica dal vivo imaging di fluorescenza per quantificare la ricostituzione e la mobilitazione di specifiche vescicole sinaptiche (SV) piscine in terminazioni nervose centrale è descritto. Due tornate di SV riciclaggio sono monitorati nei terminali nervosi pur prevedendo un controllo interno.

Analisi quantitativa di Replenishment pool delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni granuli cerebellari utilizzando coloranti FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.0K Views.  University of Edinburgh. Una tecnica dal vivo imaging di fluorescenza per quantificare la ricostituzione e la mobilitazione di specifiche vescicole sinaptiche (SV) piscine in terminazioni nervose centrale è descritto. Due tornate di SV riciclaggio sono monitorati nei terminali nervosi pur prevedendo un controllo interno.

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Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The vesicles are then retrieved from the plasma membrane (endocytosis) and grouped together with the general pool of vesicles within the nerve terminal, until they undergo a new exo- and endocytosis cycle (vesicle recycling). These processes have been studied using a variety of techniques such as electron microscopy, electrophysiology recordings, amperometry and capacitance measurements. Importantly, during the last two decades a number of fluorescently labeled markers emerged, allowing optical techniques to track vesicles in their recycling dynamics. One of the most commonly used markers is the styryl or FM dye 1; structurally, all FM dyes contain a hydrophilic head and a lipophilic tail connected through an aromatic ring and one or more double bonds (Fig. 1B). A classical FM dye experiment to label a pool of vesicles consists in bathing the preparation (Fig. 1Ai) with the dye during the stimulation of the nerve (electrically or with high K+). This induces vesicle recycling and the subsequent loading of the dye into recently endocytosed vesicles (Fig. 1Ai-iii). After loading the vesicles with dye, a second round of stimulation in a dye-free bath would trigger the FM release through exocytosis (Fig. 1Aiv-v), process that can be followed by monitoring the fluorescence intensity decrease (destaining).

Although FM dyes have contributed greatly to the field of vesicle recycling, it is not possible to determine the exact localization or morphology of individual vesicles by using conventional fluorescence microscopy. For that reason, we explain here how FM dyes can also be used as endocytic markers using electron microscopy, through photoconversion. The photoconversion technique exploits the property of fluorescent dyes to generate reactive oxygen species under intense illumination. Fluorescently labeled preparations are submerged in a solution containing diaminobenzidine (DAB) and illuminated. Reactive species generated by the dye molecules oxidize the DAB, which forms a stable, insoluble precipitate that has a dark appearance and can be easily distinguished in electron microscopy 2,3. As DAB is only oxidized in the immediate vicinity of fluorescent molecules (as the reactive oxygen species are short-lived), the technique ensures that only fluorescently labeled structures are going to contain the electron-dense precipitate. The technique thus allows the study of the exact location and morphology of actively recycling organelles.

FM dyes have been of invaluable help in the understanding of synaptic dynamics. FMs are normally followed under the fluorescent microscope during different stimulation conditions. However, photoconversion of FM dyes combined with electron microscopy allows the visualization of distinct synaptic vesicle pools, among other ultrastructure components, in synaptic boutons.

Studiare Piscine vescicole sinaptiche con fotoconversione di coloranti Styryl

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Ricerca

Neuroscienze

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Diffusione laterale e esocitosi delle proteine ​​di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando Recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellulare Identificazione neuroni motori per un pool di motore muscolare in<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

Esame delle vescicole sinaptiche Riciclaggio Uso FM coloranti Durante evocati, spontaneo, e miniatura Attività Synaptic

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex Vivo Imaging di postnatale cerebellare granuli migrazione cellulare Utilizzando confocale macroscopia

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

L&#39;esaurimento selettiva di microglia da cerebellare granuli colture cellulari Utilizzando L-leucina estere metilico

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Risoluzione alta analisi quantitativa Immunogold di Recettori di membrana a retina nastro Sinapsi

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

Valutazione della vitalità neuronale utilizzando la fluoresceina diacetato-propidium ioduro a doppia colorazione nel granulo cerebrale Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...