Ringraziamo il Dr. Michael Wooten per il suo aiuto nella preparazione del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal NIH 2RO1NS033661 (MWW).

1. Set-up prima del raccolto <ol><li> Per generare cuccioli prenatali per la raccolta dei neuroni, pianificare allevamento topi adulti tra 19 giorni prima del giorno di isolamento dei neuroni. (C57BL / 6 topi età 2-8 mesi sono stati utilizzati accoppiamenti ai fini dello sviluppo di questo protocollo). Accoppiamento di successo può essere confermata dalla presenza di un tappo vaginale nella conferma femminile, palpitazioni o visiva di gravidanza. </li><li> Il giorno prima dell&#39;isolamento neurone: <ol class="ualpha"><li> Per le applicazioni di immunofluorescenza, vetro coprioggetti cappotto in piastra da 24 pozzetti con un leggero strato di 3:1 collagene 1, coda di topo: poly-D-lisina soluzione. </li><li> Per le applicazioni di colture cellulari, cappotto adeguato tessuto dimensioni ware cultura di plastica con un leggero strato di 3:1 collagene 1, coda di topo: poly-D-lisina soluzione. </li></ol></li><li> Appoggiare le piastre scoperti in una cappa di coltura tissutale sotto una luce UV durante la notte. </li><li> Lavare i piatti con la soluzione Balance Hank sterile di Salt (HBSS) primada utilizzare. Piastre rivestite possono essere riempiti con HBSS e conservato fino ad una settimana a 4 ° C al buio. </li></ol> 2. Tissue Harvest <ol><li> La sterilità è sempre un fattore quando cresce colture cellulari primarie e, come tale, la massima cautela dovrebbe essere esercitata per garantire l&#39;ambiente più sterile possibile. Con particolare attenzione alla tecnica sterile, la dissezione iniziale e la raccolta di tessuto nervoso per questo protocollo può essere completato al di fuori di una cappa a flusso laminare con il minimo rischio di contaminazione. Dopo la raccolta iniziale, tutti i passi successivi devono essere condotte in condizioni di massima sterilità all&#39;interno di una cappa di nominale per la coltura cellulare. </li><li> Eutanasia di un mouse incinta dopo circa 19 giorni dopo la fecondazione per decapitazione. L&#39;uso di anestesia per l&#39;eutanasia la femmina incinta non è raccomandato in quanto l&#39;anestesia è noto per provocare la morte delle cellule cerebrali (Stratmann, et al., 2010). Uso sterili forbici dissezione e pinze, creare un&#39;apertura nella metà ventrale latomouse per rivelare completamente cavità corporea. Gli strumenti possono essere sterilizzati con alcol e una fiamma libera. </li><li> Cuccioli prenatale sarà situato verso la parte posteriore della cavità corporea del topo e devono essere facilmente visibili nell&#39;utero. Con autoclave pinze sterili, aprire l&#39;utero e togliere cuccioli. Decapitare cuccioli con freschi forbici sterili e la testa luogo rimosso su garza sterile sotto un microscopio da dissezione. Gli strumenti sterili autoclave può essere fiamma pulita con alcol e fiamme libere prima e durante l&#39;uso. </li><li> Con forbici o bisturi sterili, cranio aperto di cucciolo dal retro del collo al naso. Questa procedura può normalmente essere completata con l&#39;inserimento di una punta delle forbici nel forame vertebrale e quindi procedere anteriormente. Rimuovere con attenzione l&#39;intero cervello con una pinza. Mettere il cervello su garza sterile. Usando un bisturi sterile, rimuovere il cervelletto e incidere lungo la linea mediana del cervello per separare in due emisferi (figura 1)<html> . </li><li> Afferrare una piccola sezione di meningi che circondano l&#39;ippocampo con una pinza sterile e tirare dolcemente. Sebbene non sia strettamente necessario rimuovere le meningi prima isolare l&#39;ippocampo, la presenza delle meningi può rendere la dissezione dell&#39;ippocampo più difficile a causa della durezza della membrana. In entrambi i casi, l&#39;ippocampo sarà più chiaramente visibile dopo le meningi sono stati rimossi. L&#39;ippocampo è una struttura curva che inizia nella parte distale del dell&#39;emisfero e piega ventrale (Figura 2). Come quella interna, concava, lato (caudale) sta affrontando un ventricolo, è già libero. Pertanto, per isolare l&#39;ippocampo, bisogna tagliare lungo il lato esterno convesso. Dopo la dissezione, sollevare delicatamente con le pinze ogni ippocampi tessuti sterili e il trasferimento in un piccolo piatto coltura tissutale con riscaldate (37 ° C) HBSS sotto una cappa di coltura cellulare. Tessuto cerebrale possono essere combinati da cuccioli multipli. </li></ol>&quot;&gt; 3. Tissue dissociazione <ol><li> Usando un bisturi sterile, tessuto cerebrale delicatamente tritare in 3 ml di HBSS sterili in un piatto 100 Tissue Culture mm. </li><li> Trasferire il tessuto tritato e HBSS ad un tubo da 15 ml. Aggiungere 1,5 ml di HBSS e 0,5 ml di soluzione di tripsina 0,25% a un volume totale di 5 ml. </li><li> Cap e capovolgere delicatamente il tubo 4-5 volte per mescolare. Prova per evitare di produrre bolle come DNA liberato dal tessuto digerito aderiranno le bolle e causare il tessuto macinate a galleggiare invece di regolare al fondo della provetta (Figura 3). </li><li> Incubare tessuto dell&#39;ippocampo a 37 ° C per 15 minuti, invertendo tubo come sopra ogni 5 minuti. </li><li> Lasciare il tessuto di depositarsi sul fondo della provetta. </li><li> Accuratamente rimuovere la soluzione in eccesso con una pipetta sterile, lasciando tessuto indisturbato sul fondo del tubo. </li><li> Lavare tessuto pellet con 5 ml di HBSS a 37 ° C per 5 minuti. Ripetere per un totale di 3 volte. Lasciare tessuto si depositino completamenteal fondo della provetta ogni volta prima di procedere alla fase di lavaggio successivo. </li><li> Rimuovere il lavaggio finale dal tessuto pellet e sostituirlo con 2 ml di HBSS freschi. </li></ol> 4. Neuron Triturazione <ol><li> Prima di iniziare passi triturazione, è necessario preparare fuoco lucido pipette Pasteur. Utilizzando un bruciatore Bunson, tenere una sterile 9 pollici punta di pipetta Pasteur (figura 4a) nella fiamma fino diametro dell&#39;apertura pipetta è circa 0,5 mm di dimensioni e bordi dell&#39;apertura pipetta sono state leggermente arrotondati (figura 4b). Lasciare raffreddare completamente pipetta prima di iniziare il processo di triturazione. </li><li> Utilizzando una normale sterile da 9 pollici pipetta Pasteur, delicatamente triturare il tessuto per un totale di 7 volte. Pezzi di tessuto più grandi sono normali a questo punto e dovrebbe essere consentito di depositarsi sul fondo del tubo prima di passare alla fase successiva. </li><li> Trasferire il supernatante in una nuova sterile tubo da 50 ml. </li><li&gt; Per il tessuto rimanente, aggiungere 2 ml di HBSS sterili e triturare un totale di 5 volte utilizzando il lucido fuoco pipetta Pasteur. </li><li> Consentire tutti i pezzi rimanenti tessuto grandi di depositarsi sul fondo della provetta e combinare surnatante con il supernatante precedente per un totale di 4 ml di cellule dissociate neuronali. </li></ol> 5. Cella Placcatura <ol><li> Contare le cellule dissociate utilizzando un emocitometro. </li><li> Come regola generale, una volta che il numero delle cellule sono stati determinati, sottrarre il 20% da quel numero finale per tenere conto di morte cellulare che può verificarsi dopo placcatura. </li><li> Le celle possono essere placcati con le seguenti raccomandazioni: Per coprioggetti in una ben piastra da 24 - 6 x 10 4 cellule / pozzetto in 0,5 ml Per piastre 60 mm coltura dei tessuti - 4 x 10 5 cellule / piastra in 3 ml Per 100 piastre tessuto Cultura - 6 mm x 10 6 cellule / piastra in 6 ml </li><li> Mescolare il numero di cellule appropriate con il volume indicato di terreni in piastra Neurobasal (NeurobasalSupporti contenenti B27 Supplement [1 ml / 50 ml], 0,5 mM glutammina Solution, 25 pM glutammato (Mr 147,13 g / mol), penicillina (10.000 unità / ml) / streptomicina (10.000 pg / ml) [250 microlitri / ml 50] , 1mM HEPES (Mr 238,3 g / mol), il 10% dei donatori Horse inattivato al calore, Siero) e aggiungere celle a piastre. Piastre Agitare delicatamente per distribuire le cellule in modo uniforme. HI-Horse di siero viene aggiunto ai terreni in piastra per arricchire le cellule durante le prime 24 ore di crescita. Le cellule sono poi svezzati dal siero e restituiti ad un ambiente privo di siero per riduzione di serie del siero ad ogni sostituzione dei supporti. Va inoltre notato che mentre a concentrazioni più elevate glutammato è tossico per le colture di cellule neuronali, alle concentrazioni più basse aggiunte qui, si inibisce l&#39;attacco di cellule non neuronali 11. Tuttavia, dovrebbe essere aggiunto ai terreni in piastra per le prime 24 ore di coltura e successivamente lasciato su eventuali mezzi di alimentazione per impedire neurotossicità delle cellule. </li><li> Ppizzo neuroni a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore notte. </li><li> Rimuovere metà del volume dei mezzi dalle cellule e sostituirlo con un volume uguale di alimentazione dei supporti Neurobasal (Media Neurobasal contenente B27 Supplement [1 ml / 50 ml], 0,5 mM glutammina Solution, penicillina (10.000 unità / ml) / streptomicina (10.000 pg / ml) [250 microlitri / ml 50], 1 mM HEPES (Mr 238,3 g / mol). </li><li> I neuroni devono essere alimentati ogni 4 giorni rimuovendo metà dei vecchi media e la sua sostituzione con lo stesso volume di alimentazione dei supporti Neurobasal freschi. Processi neuronali dovrebbe iniziare a essere visibile il giorno 1 (figura 5a) e diventare prevalente by Day 10 (figura 5b). </li></ol> 6. Risultati rappresentativi La capacità di crescere e cultura primarie cellule neuronali è diventato una parte indispensabile della neuroscienza. Colture primarie consentono al ricercatore di analizzare le specifiche vie cellulari, modificazione chimica e del trattamento, target loczazione e modelli di crescita in un ambiente controllato. Molte di queste procedure utilizzano una sofisticata metodologia di visualizzare le modifiche specifiche risposte cellulari. In questo caso, neuroni dell&#39;ippocampo sono utilizzati per studiare specifici percorsi neuronali che risulterebbe difficile, se non impossibile analizzare nel cervello intatto. Preparazione del vicino popolazioni omogenee di neuroni dalle aree specifiche del cervello è critico per studiare la funzione cerebrale. Effetti molecolari in singoli neuroni possono essere determinanti per delineare percorsi di ordine superiore come la memoria o l&#39;apprendimento. Poiché questo protocollo produce colture relativamente puri di neuroni dell&#39;ippocampo, senza la necessità di uno strato alimentatore di cellule gliali, questi neuroni sono facilmente utilizzati per studi di immunofluorescenza. Tuttavia, come con tutta la cultura primaria da organi che contengono più tipi di cellule, certo livello di contaminazione da cellule meno desiderati possono verificarsi. In isolamento di cellule neuronali, cellule gliali di contaminazione può essere un problema comune. Le cellule gliali cuno essere facilmente individuati sulla visualizzazione microscopica della coltura come loro morfologia differenze significative rispetto ai neuroni bersaglio (Figura 6). L&#39;impatto di contaminazione cellule gliali dipenderà previsto impiego delle culture. Se le cellule vengono utilizzate per l&#39;esame immuno-fluorescenza, la contaminazione gliale può essere niente più che un inconveniente quando si cerca di fotografare i singoli neuroni. Tuttavia, se le colture neuronali sono da utilizzare per l&#39;analisi biochimica, eccessiva contaminazione da parte delle cellule gliali potrebbe causare cambiamenti rilevanti nei risultati. Modi per affrontare la contaminazione delle cellule gliali sono illustrate ulteriormente la discussione. Una volta che i neuroni sono state isolate con successo e crescere in coltura, una tipica applicazione è quello di esaminare i processi cellulari immuno-fluorescenza tecniche. Come illustrato nella figura 7, organelli, come i mitocondri, possono essere colorate usando coloranti vitali aggiunto ai terreni di coltura prima di fissarezione. Endogeni proteine ​​cellulari può essere visualizzato da cellule fisse utilizzando le normali tecniche di immuno-fluorescenza (Figura 8). Una volta che le cellule neuronali sono fissate, anticorpi specifici per proteine ​​di interesse possono essere introdotti nelle cellule e queste proteine ​​possono essere visualizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza. Colture di neuroni anche fornire al ricercatore i mezzi per esaminare gli effetti delle proteine ​​individuali sulle funzioni neuronali. Utilizzando una varietà di tecniche comprendenti transfezione del DNA, elettroporazione o trasduzione virale, proteine ​​possono essere sovraespressa in cellule neuronali (Figura 9). Come neurale cellule rispondono agli effetti di un eccesso di proteine ​​espresse da può avere conseguenze dirette su come il cervello può rispondere e offre la possibilità di individuare bersagli cellulari per trattamenti farmacologici. I dettagli di questi tipi di esperimenti vanno oltre lo scopo di questo lavoro, ma non dimostrano che le culture preparate da questa tecnica sono adatti per una vasta gamma di down-stream applicazioni. Tuttavia, la semplicità generale di questo protocollo, così come il breve periodo di tempo necessario per preparare queste culture neuronali fanno di questo un metodo ideale per l&#39;impiego in laboratorio di neuroscienze di oggi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig1.jpg" /> Figura 1. Dissezione del cervello di topo prenatale. La prima incisione è lungo la linea mediana del cervello che lo separa in due emisferi. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig2.jpg" /> Figura 2. Posizione dell&#39;ippocampo del cervello di topo prenatale. Il corpo striato viene spostato da parte per visualizzare l&#39;ippocampo e si nota dalla curva struttura &quot;fagiolo&quot; tipo nella regione distale di ciascun emisfero. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig3.jpg" /> Figura 3. Dissociazione del tessuto dell&#39;ippocampo in soluzione di tripsina. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig4.jpg" /> Figura 4. Pasteur puntali utilizzato in triturazione del tessuto ippocampale. (A) normale punta di pipetta Pasteur. (B) Fire-lucida punta di pipetta Pasteur. Prendere nota dei bordi arrotondati e la diminuzione di circa il 50% nelle dimensioni di apertura pipette. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig5.jpg" /> Figura 5. Neuroni dell&#39;ippocampo isolato utilizzando questa procedura e placcato in NB Media. (A) La crescita cellulare 1 giorno post-placcatura. Processi neuronali cominciano ad essere visibili nel corso del Giorno 1. (B) La crescita cellulare 10 giorni post-placcatura, neuriti sono ramificate e sovrapposizioni. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig6.jpg" /> Figura 6. Neuroni dell&#39;ippocampo contaminate da cellule gliali coltivate per 7 giorni e colorati con il pennarello organello MitoTracker Red CM-H2XRos (Invitrogen # M7515) e transfected con GFP-LC3 con Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). I mitocondri sono visibili in tutte le cellule però solo un singolo neurone è successo trasfettate con il costrutto fluorescente. La contaminazione con cellule gliali fa l&#39;analisi di GFP-LC3 espressione nei processi neuronali difficili da visualizzare. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig7.jpg" /> Figura 7. Neuroni dell&#39;ippocampo cresciuta per 7 giorni e colorati con il pennarello organello MitoTracker Red CM-H 2 Xros (Invitrogen # M7513). Questo colorante vitale viene utilizzato per colorare mitocondri attivi in ​​cellule di coltura dei tessuti. Le cellule sono state fissate in paraformaldeide al 4% / PBS e visualizzati mediante microscopia a fluorescenza. Lo stesso colorante è non fluorescente fino ossidato nei mitocondri. Mitocondri attivi può essere visto in tutti i processi neuronali. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig8.jpg" /> Figura 8. </strong&gt; neuroni dell&#39;ippocampo destinati alla produzione di 7 giorni, fissate con paraformaldeide al 4% / PBS e immuno-colorati con anticorpo monoclonale anti-anticorpo β tubulina (Sigma # T0198). A seguito di anticorpo primario, Oregon verde marcato di capra anti-topo secondario (Invitrogen # O11033) sono stati aggiunti e visualizzati mediante microscopia a fluorescenza. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig9.jpg" /> Figura 9. Colture ippocampali neuronali sono stati coltivati ​​per 5 giorni e transfettate con GFP-LC3β costrutto di DNA usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11.668.019). Al 7 ° giorno, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% / PBS e aggresomes con LC3β GFP tag incorporati nel loro membrana esterna sono stati visualizzati usando la microscopia a fluorescenza. Aggresomes si trovano in tutto il corpo cellulare e neuriti e sono indicati con le frecce.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Colture di ippocampo sono stati utilizzati in biologia molecolare per oltre 20 anni. In linea di principio, colture neuronali può essere fatto da qualsiasi parte del cervello, culture dell&#39;ippocampo hanno dimostrato di essere più popolari a causa dell&#39;architettura relativamente semplice della popolazione di cellule nervose nell&#39;ippocampo 7. Culture ippocampali sono tipicamente realizzati in fase avanzata di tessuto embrionale. Questo tessuto è più facile da dissociare e contiene un minor numer...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Venditore </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Rat Tail collagene 1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Poly-D-lisina Soluzione </td><td> Chemicon </td><td> A-003-E </td></tr><tr><td> Hanks soluzione salina bilanciata </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-095 </td></tr><tr><td> Tripsina Solution (1X) 0,25%, liquido </td><td> Invitrogen </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> NeuroBasal Medium (1X) di liquido </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B27 Supplement (50X) di liquido </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> L-Glutammina 200 mm (100X) di liquido </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-149 </td></tr><tr><td> Penicillina (10.000 unità / ml) / streptomicina (10.000 pg / ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-148 </td></tr><tr><td> HI-Donor siero di cavallo </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S12150H </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice

Culture primarie di ratto e murina neuroni ippocampali sono ampiamente utilizzati per rivelare meccanismi cellulari in neurobiologia. Isolando e crescente singoli neuroni, i ricercatori sono in grado di analizzare le proprietà relative al traffico cellulare, la struttura cellulare e localizzazione singola proteina utilizzando una varietà di tecniche biochimiche. I risultati di tali esperimenti sono fondamentali per testare le teorie riguardanti la base neurale della memoria e dell&#39;apprendimento. Tuttavia, risultati inequivocabili di queste forme di esperimenti si basano sulla capacità di crescere colture neuronali con minima contaminazione da altri tipi di cellule cerebrali. In questo protocollo, si usa mezzi specifici per la crescita dei neuroni e dissezione attenta di tessuto embrionale ippocampale per ottimizzare la crescita dei neuroni sani minimizzando tipi cellulari contaminanti astrociti (cioè). Tessuti embrionali del mouse ippocampale può essere più difficile da isolare rispetto al tessuto roditori simili a causa delle dimensioni del campione per dissection. Mostriamo tecniche di dissezione dettagliata dei dell&#39;ippocampo dal embrionali cuccioli di topo al giorno 19 (E19). Una volta che il tessuto dell&#39;ippocampo è isolato, dissociazione dolce delle cellule neuronali si ottiene con una concentrazione diluita di tripsina e distruzione meccanica progettati per separare le cellule dal tessuto connettivo, fornendo minimo danneggiamento singole celle. Una descrizione dettagliata di come preparare pipette da utilizzare nella interruzione è inclusa. Placcatura densità ottimali sono previste per immuno-fluorescenza protocolli per massimizzare la cultura di successo cellulare. Il protocollo prevede una tecnica veloce (circa 2 ore) ed efficiente per la coltura di cellule neuronali di topo tessuto dell&#39;ippocampo.

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Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Forniamo un protocollo per la coltura di neuroni dell&#39;ippocampo altamente purificato da cervelli dei topi prenatale senza l&#39;uso di uno strato di cellule gliali alimentatore.

Isolamento e la coltura di neuroni ippocampali da topi prenatali

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

isolation-and-culture-of-hippocampal-neurons-from-prenatal-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

70.0K Views.  Auburn University. Forniamo un protocollo per la coltura di neuroni dell'ippocampo altamente purificato da cervelli dei topi prenatale senza l'uso di uno strato di cellule gliali alimentatore.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

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Neuroscienze

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Fosfato di calcio trasfezione di primaria neuroni dell&#39;ippocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Isolamento e Cultura della dissociato neuroni sensoriali da embrioni di gallina

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura dei neuroni del midollo spinale da topi neonatali

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) when compared to spinal motor neurons (SMNs). The ability to isolate and culture primary mouse CN3s, CN4s, and SMNs would provide an approach to study mechanisms underlying this selective vulnerability. To date, most protocols use heterogeneous cell cultures, which can confound the interpretation of experimental outcomes. To minimize the problems associated with mixed-cell populations, pure cultures are indispensable. Here, the first protocol describes in detail how to efficiently purify and cultivate CN3s/CN4s alongside SMNs counterparts from the same embryos using embryonic day 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenic mouse embryos. The protocol provides details on the tissue dissection and dissociation, FACS-based cell isolation, and in vitro cultivation of cells from CN3/CN4 and SMN nuclei. This protocol adds a novel in vitro CN3/CN4 culture system to existing protocols and simultaneously provides a pure species- and age-matched SMN culture for comparison. Analyses focusing on the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of motor neurons are feasible in this culture system. This protocol will enable research into the mechanisms that define motor neuron development, selective vulnerability, and disease.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

This work presents a protocol to yield homogeneous cell cultures of primary oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons. These cultures can be used for comparative analyses of the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of ocular and spinal motor neurons.

Isolamento e coltura di Oculomotor, Trochlear, e MotoNeuroni Spinali da Prenatal Islmn:GFP Topi Transgenici

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and peripheral neuroregulation. Although extensive research on the lower urinary tract nervous system has been conducted, most studies have focused on primary culture. This protocol introduces a method for the isolation and culture of bladder neurons and glia from Sprague&#8211;Dawley rats. In this method, the neurons and glia were incubated in a 37 &#176;C, 5% CO2 incubator for 5&#8211;7 days. As a result, they grew into mature shapes suitable for related subsequent immunofluorescence experiments. Cells were morphologically observed using an optical microscope. Neurons, synaptic vesicles, and glia were identified by &#946;-III-tubulin and MAP-2, Synapsin-1, and GFAP staining, respectively. Meanwhile, immunocytochemistry was performed on several neurotransmitter-related proteins, such as choline acetyltransferase, DYNLL2, and SLC17A9.

This protocol attempts to establish a repeatable protocol for primary neurons and glia isolation from rat bladder for further cellular experiments.

Isolamento e cultura dei neuroni primari e degli glia dalla vescica urinaria del ratto adulto

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

Ridurre al minimo l'ipossia nelle fette di ippocampale da topi adulti e anziani

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

Isolamento e cultura dei neuroni del Ganglione Ciliario

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...