Gli autori desiderano ringraziare l&#39;UC Davis Biology Program del mouse per l&#39;allevamento dei topi. Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione da Merck KGaA, Darmstadt, Germania.

Tutti gli studi e gli esperimenti sugli animali sono stati condotti nell&#39;ambito di un protocollo approvato dalla University of California, Davis Institutional Animal Care e Usa comitato consultivo amministrativo. 1. MUC1.Tg mouse Allevamento e propagazione <ol><li> L&#39;UC Davis mouse programma di biologia (MBP) razze di tipo selvatico C57BL / 6 topi maschi con eterozigote MUC1.Tg C57BL / 6 topi femmina di stabilire la nostra colonia riproduttiva. MUC1.Tg prole vengono consegnati per gli studi, se necessario. </li><li> Personale MBP tarpare le dita dei piedi della prole in un modello definito (0-99) per l&#39;identificazione del mouse, e quando fermaglio applicabile la coda. La punta o il tessuto di coda sono trattati per la genotipizzazione mediante estrazione del DNA standard Polymerase Chain Reaction (PCR). </li></ol> 2. Disegno dello studio <ol><li> Studiare assegnazioni di gruppo <ol><li> Pesare ciascun topo separatamente su una bilancia e registrare il peso in grammi per ogni mouse. </li><li> Questa parte della procedura di invOlvés la metodologia e la progettazione dello studio. Per la prima parte dello studio, assegnate pari età-topi di tipo MUC1.Tg e selvaggio per iniziare l&#39;induzione del cancro della vescica con OH-BBN. Euthanize topi 8 settimane dopo l&#39;ultima dose OH-BBN per confermare la presenza di tumori della vescica con l&#39;istologia. </li><li> Per la seconda parte dello studio, i topi maschi randomizzare MUC1.Tg nel numero appropriato di trattamento e di gruppi di controllo. Questi topi saranno monitorati per citochine sieriche e le risposte immunitarie delle cellule T durante l&#39;induzione e lo sviluppo del tumore, e quindi al termine dello studio 8 settimane dopo l&#39;ultima dose OH-BBN. </li></ol></li><li> Cancro alla vescica induzione <ol><li> OH-BBN è una sostanza cancerogena e altamente tossica. Si prega di leggere e seguire le linee guida della scheda di sicurezza durante la manipolazione e la conservazione questa sostanza chimica. </li><li> Calcolare la concentrazione della soluzione di dosaggio necessario per erogare la dose appropriata (3 mg), in un volume di 100 microlitri, ad ogni mouse sulla base dei pesi medi e number di topi in ogni studio e di gruppo. </li><li> Diluire il OH-BBN in 100% di etanolo. Portare la concentrazione finale di 30 mg / ml con acqua sterile. L&#39;etanolo finale: concentrazione di acqua dovrebbe essere 20:80, v / v </li><li> Amministrare l&#39;OH-BBN oralmente usando l&#39;acciaio inossidabile, 20 g di aghi di gavage giornaliere, 5 giorni / settimana per 12 settimane, in base al gruppo di assegnazione del trattamento a partire dall&#39;età di 8 settimane. </li></ol></li><li> Trattamenti di vaccinazione <ol><li> Ricostituire ogni flacone di vaccino peptidico liofilizzato in 600 ml di soluzione fisiologica 0,9% sterile e completamente risospendere disegnando la soluzione attraverso un 0,5 pollici 27 ago G 6x. Utilizzando soluzione, regolare la concentrazione in modo che la dose desiderata è trasportato in un volume di 100 microlitri. </li><li> A partire in settimana 20, dopo l&#39;ultima dose di OH-BBN, somministrare il vaccino su base settimanale per un ciclo di otto settimane per iniezione sottocutanea di 100 microlitri utilizzando un ago da 25 G (settimana numero corrisponde all&#39;età dei topi). </li></ol></li><li> Monitoraggio e la raccolta del campione <ol><li> Pesare tutti i mouse e palpare per la presenza di nuovi tumori una volta ogni settimana. Euthanize eventuali topi che hanno perso ≥ 20% del peso corporeo o se ci sono tumori palpabili, sangue nelle urine, e / o ritenzione urinaria. </li><li> Prima della prima dose OH-BBN e poi ad intervalli di 4 settimane dopo, raccogliere il sangue intero tramite sanguina sottomandibolari. Raccogliere il sangue in provette di coagulazione del siero (BD Microtainer), e consentire 30 minuti per la coagulazione del sangue. </li><li> Centrifugare i campioni di sangue in una microcentrifuga a 3.500 xg per 10 min. Trasferire con attenzione il siero per avvitare cryotubes cappuccio con una pipetta. </li><li> Flash congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C fino a quando ulteriori analisi da multiplex. </li><li> Otto settimane dopo l&#39;ultima dose di OH-BBN, eutanasia tutti i topi da CO 2 asfissia. </li><li> Collocare ogni mouse su una tavola di dissezione e di definire con precisione da tutti e quattro gli arti. </li><li> Con pinze e forbici, make una incisione orizzontale nella regione addominale superiore. Inserire le forbici nell&#39;incisione tra lo strato epidermico e la parete addominale e separare delicatamente la pelle dal tessuto sottostante con l&#39;aiuto di pinze. </li><li> Praticare un&#39;incisione verticale dal incisione orizzontale seguendo l&#39;asse centrale verso l&#39;estremità anteriore del mouse. Separare la pelle dalla gabbia toracica, e utilizzando una siringa da 1 ml e un ago da 22 G, forare il cuore e raccogliere il sangue con un pareggio regolare e costante. </li><li> Fare riferimento al punto 2.4.3 e 2.4.4 per l&#39;isolamento e la conservazione del siero. </li><li> Con pinze e forbici, tagliare e staccare il resto dello strato epidermico. Tagliare attraverso la parete addominale e del peritoneo e rimuovere asetticamente tumore della vescica per Immunoistochimica (IHC) e Western blot. </li><li> Raccogliere la milza per l&#39;analisi della vitalità cellulare (Muse) e ELISpot. Per IHC, luogo esemplare tumore della vescica in cassetta tessuto e fissare in formalina refrigerata durante la notte a temperatura ambiente. </li&gt; <li> Il giorno seguente, sostituire la formalina con il 70% di etanolo. </li><li> Per l&#39;analisi Western blot di tumore, omogeneizzare il tumore, aggiungere tampone di estrazione di proteine, più inibitori della proteasi Halt e trasferimento in provette da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Vortex per 30-60 secondi e tenere in ghiaccio per 5 min. Flash congelare in azoto liquido e disgelo in acqua ambiente. Ripetere il processo di vortex, congelamento e scongelamento due volte. </li><li> Centrifugare i campioni a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C e trasferire gli estratti cellulari a nuove provette etichettate. </li><li> Quantificare la concentrazione effettuando un bicinconinico Acid Protein Assay (BCA) per misure di proteine. Conservare i campioni a -80 ° C fino al momento dell&#39;analisi Western Blot. </li></ol></li></ol> 3. Biologia Molecolare / Western Le seguenti procedure sono state eseguite per verificare l&#39;espressione di MUC1 in topo tessuto del tumore della vescica utilizzando il protocollo standard Western Blot (non dati mostranon). <ol><li> Separare gli estratti proteici mediante elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide (SDS-PAGE) e poi trasferire su membrana PVDF utilizzando apparato semisecco. </li><li> Bloccare la proteina di membrana trasferita con il 5% di latte scremato in 0,1% di Tween-20 in tampone fosfato (PBS-T) pH 7.4 per 1 ora su un agitatore orbitale a temperatura ambiente. </li><li> Incubare la membrana per 1 ora a temperatura ambiente su un agitatore con anticorpo anti-MUC1 o anti-β-actina in 0,1% PBS-T. </li><li> Lavare la membrana per decantazione e la soluzione aggiungendo 0,1% PBS-T. Swirl la membrana sulla agitatore per 5 minuti e decantare. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Incubare la membrana per 1 ora a temperatura ambiente con un ravanello cavallo perossidasi (HRP), anticorpo secondario coniugato. </li><li> Lavare 3x (fare riferimento al punto 3.4). </li><li> Seguire il protocollo per l&#39;(ECL) kit Chemiluminesence avanzato per attivare e leggere il fluorografia. </li></ol> 4. Multiplex fluorimetrica microperla immunoenzimatico &lt;ol&gt; <li> Setup e Calcoli <ol><li> Utilizzando una mappa piastra a 96 pozzetti, assegnare gli spazi, standard, controlli e campioni sconosciuti nei pozzi. Calcolare il numero e il volume di analiti, catturare anticorpi e streptavidina-ficoeritrina (SA-PE) necessarie per il dosaggio. </li><li> Consentire a tutti i tamponi e diluenti per portare a temperatura ambiente. Preparare gli standard e le diluizioni del campione utilizzando un vuoto piastra a 96 pozzetti. </li><li> Ricostituire la matrice sierica e standard di liofilizzato secondo il protocollo del produttore e fare diluizioni seriali 1:05 del campione con il diluente appropriato nella piastra a 96 pozzetti. Per i pozzetti del bianco, utilizzare il diluente appropriato. </li><li> Diluire tutti i controlli ed i campioni 1:2 diluente appropriato nel resto della piastra a 96 pozzetti. </li><li> Per la miscela di sferette, pipettare il volume richiesto di diluente appropriato in un tubo da 15 ml. Vortex ciascuna fiala branello per 20 sec e pipetta il volume di ciascun analita nel tubo 15 ml. </li&gt; <li> Proteggere sempre le perle dalla luce per evitare photobleaching. Non posizionare la piastra a 96 pozzetti su materiale assorbente per evitare la perdita di campione attraverso la traspirazione. </li></ol></li><li> Assay Protocol <ol><li> Prewet la piastra inferiore 96 pozzetti filtro con 200 microlitri di tampone del saggio e consentire all&#39;ammollo completa del filtro. Drenare delicatamente usando l&#39;apparecchio vuoto piastra a 96 pozzetti e asciugare il fondo del piatto con un tovagliolo di carta. </li><li> Usando una pipetta multicanale, pipetta 25 ml di matrice sierica nei pozzetti assegnati per i bianchi e gli standard e pipetta 25 ml di tampone del saggio nei pozzetti assegnati per i controlli e le incognite. </li><li> Pipettare 25 ml del bianco, standard, controlli e campioni sconosciuti nei rispettivi pozzetti. La miscela di sferette vortex per 20 sec e trasferire le perline ad un serbatoio. </li><li> Pipettare 25 microlitri della miscela di sferette in ciascun pozzetto. Coprire la piastra con un foglio di alluminio o un coperchio piatto opaco per proteggere dalla luce. </li><li&gt; agitare la piastra a 500 rpm per due ore a temperatura ambiente su un agitatore di piastre. Scolare e lavare la piastra con 200 microlitri di 0.1% di Tween 20 in tampone fosfato (PBS-T) due volte. Scolare e asciugare. </li><li> Preparare la soluzione di anticorpo di cattura. Pipettare la quantità richiesta di 0,1% PBS-T e catturare anticorpo in una provetta da 15 e vortex per 10 sec. Trasferire la miscela anticorpo di cattura di un flacone 25 microlitri in ciascun pozzetto. </li><li> Agitare la piastra a 500 rpm per un&#39;ora a temperatura ambiente su un agitatore di piastre. Scolare e lavare la piastra con 200 microlitri di 0.1% PBS-T due volte. Scolare e asciugare. </li><li> Preparare la soluzione di SA-PE. Pipettare il volume richiesto di 0,1% PBS-T e SA-PE in una provetta e vortex per 10 sec 15. Trasferire la soluzione in un flacone 25 microlitri in ciascun pozzetto. </li><li> Agitare la piastra a 500 rpm per 30 min a temperatura ambiente su un agitatore di piastre. Scolare e lavare la piastra con 200 microlitri di 0.1% PBS-T due volte. Scarico e Blotto asciutto. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di 0.1% PBS-T e agitare su un agitatore a 500 rpm per almeno due minuti per risospendere le sfere. Leggere e analizzare la piastra sulla macchina Luminex LX200. </li></ol></li></ol> 5. IFN-γ/IL-4 ELISpot preparazione e l&#39;analisi <ol><li> In una cappa di sicurezza biologica, elaborare la milza attraverso 100 tessuto di nylon micron setacci in 5 ml di fosfato sterile Soluzione salina tamponata (PBS) in piastre sterili. Strato le splenociti su 3 ml di linfociti mezzo di separazione in provette sterili da 15 ml. </li><li> Centrifugare le provette a 600 xg per 15 min a separare i linfociti dai globuli rossi. Trasferire i linfociti a strati sopra il gradiente di nuove provette sterili da 15 ml. </li><li> Regolare il volume a 10 ml con PBS sterile. Centrifugare la sospensione a 600 xg per 10 min per agglomerare le cellule. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di PBS per la vitalità cellulare e contare con la Musaanalizzatore. Seguire il conte Muse &amp; protocollo Kit Viabilità. </li><li> Effettuare diluizioni seriali dei linfociti in 1,5 ml provette con tappo a vite centrifugare a fattori di diluizione di 1:10, 01:20 e 01:40 (o secondo necessità) in Conte &amp; Viabilità Reattivo (totale minimo volume di 300 ml). Pipettare ogni diluizione su e giù diverse volte per miscelare ed analizzare sul Muse. </li><li> Preparare una mappa della piastra dei campioni e le condizioni per la piastra ELISpot. Preparare la piastra ELISpot secondo il protocollo del produttore e pipettare 100 pl di mezzo, peptide (10 mcg / ml), o peptide (10 pg / ml) in ciascun pozzetto scramble. </li><li> Pipettare 100 ul di sospensione cellulare, fornire 1.0 x 10 6 cellule in ciascun pozzetto ed incubare la piastra a 37 ° C per una notte. </li><li> Seguire il protocollo del produttore per il saggio ELISpot. Analizzare la piastra ELISpot sviluppato utilizzando un microscopio dissezione. </li><li> Quantificare i risultati contando il numero di macchie colorate corring per ciascun analita in ciascun pozzetto. Le macchie corrispondono al numero di cellule formanti-(SFC) in ciascun pozzetto. </li></ol> 6. Immunoistochimica (IHC) e ematossilina e eosina (H &amp; E) Colorazione <ol><li> Prendere vescica tessuto tumorale conservato come descritto in precedenza (sezione 2.4.11), incorporare in paraffina e step-sezione a 4 micron per l&#39;analisi immunoistochimica. </li><li> Eseguire IHC utilizzando un anticorpo MUC1 che riconosce la regione di ripetizione in tandem di MUC1. Utilizzare l&#39;Animal Research Kit perossidasi per minimizzare la reattività dell&#39;anticorpo secondario mouse con immunoglobulina endogena presente nel tessuto. </li><li> Eseguire la colorazione H &amp; E utilizzando protocolli standard. </li></ol> 7. Metodi statistici Per il Multiplex fluorimetrica microperla immunoenzimatico, utilizzare il test t di Student a due code per confrontare la media osservata concentrazioni sieriche di citochine tra i gruppi di trattamento e di controllo. Per ELISpot, utilizzare un one-way ANOVA per confrontare il punto formando colonie tra il controllo dei media, strapazzate peptide e gruppi peptidici. Utilizzare più Comparison Test di Dunnett per diminuire la probabilità di un risultato falso positivo. Un valore di p ≤ 0,05 è considerato significativamente diverso per tutte le analisi.

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin+expression+by+transitional+cell+carcinomas+of+the+bladder.">Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder.</a> Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).</li><li>Murray, A., Simms, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+rhenium-188-C595+antibody+for+radioimmunotherapy+of+transitional+cell+bladder+cancer.">Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer.</a> J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).</li><li>Hughes, O., Bishop, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+superficial+bladder+cancer+by+the+intravesical+administration+of+67copper-labelled+anti-MUC1+mucin+monoclonal+antibody+C595.">Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595.</a> J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).</li><li>Conn, I. G., Crocker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMFG-2+as+a+prognostic+indicator+in+superficial+bladder+cancer.">HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer.</a> J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).</li><li>Hughes, O., Denley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC1+mucin+expression+in+transitional+cell+carcinoma+of+the+bladder:+a+target+for+diagnosis+and+therapy+with+monoclonal+antibody+C595.">MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595.</a> J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).</li><li>Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+immunity+to+MUC1+in+a+human+MUC1+transgenic+murine+model.">Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model.</a> Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).</li><li>Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin-1+specific+immunotherapy+in+a+mouse+model+of+spontaneous+breast+cancer.">Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer.</a> J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).</li><li>McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+total+dose+and+dose+schedule+on+induction+of+urinary+bladder+cancer+in+the+mouse+by+N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine.">Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine.</a> Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).</li><li>Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+effects+of+L-BLP25+antigen-specific+tumor+immunotherapy+in+a+novel+human+MUC1+transgenic+lung+cancer+mouse+model.">Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model.</a> J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).</li><li>Kunze, E., Schauer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+transformation+in+the+development+of+N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced+transitional+cell+carcinomas+in+the+urinary+bladder+of+rats.">Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats.</a> Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).</li><li>Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+human+bladder+carcinogenesis.">Experimental models of human bladder carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).</li><li>Samma, S., Uemura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+of+carcinoma+in+situ+in+dog+urinary+bladder+by+sequential+treatment+with+N-methyl-N'-nitrosourea+and+N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine.">Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N'-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine.</a> Gann. 75 (5), 385-387 (1984).</li><li>Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+urinary+bladder+urothelial+cancers+in+the+rabbit+by+dibutylnitrosamine+with+an+artificial+bladder+calculus+as+cocarcinogen.">Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen.</a> Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).</li><li>Irving, C. C., Tice, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced+urinary+bladder+cancer+in+rats+by+administration+of+disulfiram+in+the+diet.">Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet.</a> Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).</li><li>Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-BLP25+vaccine+plus+letrozole+induces+a+TH1+immune+response+and+has+additive+antitumor+activity+in+MUC1-expresssing+mammary+tumors+in+mice.">L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice.</a> Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).</li></ol>

DPV, GTW, SMG, CJK, AMG, e GKH dichiarano alcun conflitto di interessi. MWD è il Principal Investigator di una borsa di studio ricevuta da Merck KGaA, e MW è un dipendente di Merck KGaA.

L&#39;induzione di successo di carcinoma invasivo della vescica a cellule transizionali e squamose nei topi MUC1.Tg umani offre un modello preclinico per lo sviluppo di immunoterapia. Studi immunotherapeutic richiedono l&#39;uso di un modello intatto immunitario spontaneo per valutare la risposta infiammatoria alla progressione tumorale nel tempo, così come la risposta immunitaria a immunoterapia. In un modello di sviluppo del tumore spontaneo, il microambiente tumorale rimane intatto e tumori sviluppano ad un tasso di...

Il carcinoma della vescica è la quarta forma più comune di cancro e l&#39;ottava causa di decessi per cancro negli uomini americani. Negli Stati Uniti, circa 72.500 nuovi casi e 15.000 decessi per cancro della vescica sono attesi tra gli uomini e le donne unite nel 2013 1. L&#39;incidenza del cancro della vescica è di circa tre volte superiore negli uomini rispetto alle donne. Negli Stati Uniti, carcinomi a cellule transizionali (TCC) rappresentano oltre il 90% dei casi, mentre carcinomi a cellule squamose (SCC) hanno una incidenza di meno del 2% 2. Il tasso di sopravvivenza a 5 anni relativo complessivo per papillare TCC è del 91,5% rispetto a solo il 30,9% per SCC 2. Sebbene non invasive TCC papillari rappresentano circa il 75% dei casi al momento della diagnosi, anche con il trattamento di oltre il 50% dei pazienti va incontro a recidiva entro 5 anni, con un massimo di 30% di questi pazienti in progressione di malattia invasiva muscolare 3,4 . Regimi di trattamento tipici per inv non muscolomalattia Asive comprendono la resezione transuretrale (TUR) seguita da chemioterapia endovescicale. Nei pazienti con Ta alto grado o tumori T1, un TUR ripetizione può essere effettuato prima della chemioterapia 3,4. Per quei pazienti con recidive Ta basso grado o Ta alto grado o lesioni T1, TUR seguita da chemioterapia adiuvante o immunoterapia in forma di Bacillus Calmette-Guerin (BCG) può essere utilizzato 3,4. BCG intravescicale ha dimostrato di essere superiore a endovescicale mitomicina C rispetto al tempo alla recidiva 5. Per la malattia invasiva muscolare T2, cistectomia radicale con o senza chemioterapia neoadiuvante è il corso del trattamento raccomandata 3. In pazienti con SCC, cistectomia radicale sembra essere il trattamento più efficace 6. Dati gli alti tassi di recidiva nonostante i migliori trattamenti disponibili, è evidente la necessità di nuove e più efficaci terapie per il cancro della vescica. Espansione nuove immunoterapie per bladdcancro ER è un possibile approccio che possono tenere la promessa di estendere la sopravvivenza libera da malattia. Storicamente, BCG è stata l&#39;unica immunoterapia efficace per il cancro della vescica. Il suo meccanismo di azione è pensato per coinvolgere l&#39;induzione non specifico di una T-helper 1 (Th1) tipo di risposta immunitaria tramite l&#39;aumento dei livelli di interleuchina-2 (IL-2) e l&#39;interferone gamma (IFN-γ) 4. Cellulare, o immunità Th1, è critica in immunoterapia del cancro come umorale o Th2, immunità è mai stato dimostrato di essere efficace contro i tumori solidi, con l&#39;eccezione di anticorpi diretti contro recettori di fattori di crescita 7. Nel tentativo di migliorare i benefici di BCG in monoterapia, IFN-α 2B/BCG combinazione di immunoterapia è stata valutata in uno studio clinico di fase II con risultati inconcludenti 8. Un approccio alternativo per immunoterapia per il cancro della vescica può essere di indirizzare antigeni tumore-associati (TAA), la cui identificazione ha reso immunoterapia del cancro più specifico 7 </sup&gt;. Uno di questi è TAA mucina 1 (MUC1), che è una glicoproteina di superficie cellulare sovraespresso in molti cancri delle cellule epiteliali quali vescica, della mammella, del polmone, cancro del pancreas e 9,10. L&#39;espressione e la modifica di MUC1 è anche sostanzialmente modificate durante la carcinogenesi, tali che espone underglycosylation sequenze antigeniche di amminoacidi conosciuti come numero variabile di ripetizioni in tandem (VNTR) sul nucleo peptide. Mentre MUC1 è un self-molecola, queste regioni VNTR immunodominant normalmente non sono esposti a causa della vasta glicosilazione, e così si sono visti dal sistema immunitario come estraneo 11,12. T-linfociti citotossici (CTL) che riconoscono specificamente MUC1 epitopi sono stati isolati dal tumore-drenanti linfonodi di pazienti con carcinoma mammario 13, così come il sangue e midollo osseo di pazienti affetti da mieloma 14,15, rendendo MUC1 un potenziale bersaglio per un risposta immunitaria cellulare. Le VNTRs immunodominanti della underglycosylated forma di MUC1 sono riconosciuti da CTL, causando la distruzione delle cellule tumorali 16-19. Native risposte immunitarie cellulari e / o umorali verso MUC1 cancerose sono, tuttavia, non abbastanza forte per eliminare i tumori. Per aumentare la risposta immunitaria debole già esistente per MUC1, peptidi immunodominanti sintetici possono essere introdotte attraverso la vaccinazione per generare una risposta CTL abbastanza forte per essere di beneficio clinico 18,20. Un MUC1 vaccino liposomiale ha già dimostrato di aumentare la sopravvivenza nei pazienti con tumore del polmone 21,22, generare CTL in grado di uccidere le cellule tumorali MUC1-positivi, e produrre una risposta di citochine Th1-polarizzato 23,24. Con un alto livello di espressione di MUC1 9,11,25, cancro della vescica è un candidato logico per testare MUC1-diretta immunoterapia 26,27. Inoltre, MUC1 ha potenziale come fattore prognostico nel carcinoma della vescica 28, MUC1 espressione in TCC è significativamente associato con la fase e grado, e TCC metastaticoha dimostrato di continuare ad esprimere MUC1 29. Per valutare l&#39;utilità potenziale di immunoterapia MUC1-diretto nel cancro della vescica, abbiamo sviluppato un MUC1 umana intatta immunitario (hMUC1)-esprimenti transgenico (MUC1.Tg) modello murino di cancro della vescica congenic sul C57BL / 6 di fondo 30. MUC1 umano viene espresso come proteina self sotto il controllo del proprio promotore, risultando in un pattern di espressione tissutale coerente con quella osservata nell&#39;uomo 30,31. I topi sono stati indotti con la vescica cancerogeno noto N-butil-N-(4-idrossibutil) nitrosamine (OH-BBN) 32, e poi i tumori risultanti sono stati valutati per hMUC1 espressione e tipo di tumore e grado. Per valutare l&#39;effetto della sostanza cancerogena sulla Th1/Th2 livelli di citochine durante lo sviluppo del tumore, i campioni di siero sono stati raccolti periodicamente per l&#39;analisi multiplex. I topi sono stati poi trattati con un vaccino peptidico MUC1-mirata, e la citochina siero e risposte immunitarie sono valuta da multiplex fluorometrica immunologico microbead e ELISpot.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN)</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>B0938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G Gavage Needles</td>
			<td>Popper &#38; Sons, Inc.</td>
			<td>7921</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide Vaccine</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>investigational agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microtainers</td>
			<td>BD</td>
			<td>365957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cassettes</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M490-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>87787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokine 20plex Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LMC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Microsphere Beads</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>MC100xx-01</td>
			<td>xx is the bead region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TNF- Capture Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>551225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TNF- Detection Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>554415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IFN- Capture Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IFN- Detection Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab83136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Buffer</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>L-MAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokine Standard</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MXM8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-screen HTS 96well filter plates</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSBVN1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-PE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SA10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 m Nylon Tissue Sieves</td>
			<td>BD</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splenocyte Separation Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-829E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF- /IL-4 ELISpot plates</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ELD5217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody</td>
			<td>Epitomics</td>
			<td>2900-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-actin monoclonal antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP antibody</td>
			<td>Promega</td>
			<td>W401B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse HRP antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>SC-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>162-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean TGX Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>456-1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Count &#38; Viability Kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MCH100104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC1 Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550486</td>
			<td>IHC antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Research Peroxidase Kit</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K3954</td>
			<td>IHC staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore plate vaccum apparatus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Lx200</td>
			<td>Millipore / Luminex</td>
			<td>40-013</td>
			<td>Manufactured by Luminex, distributed by Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Xponent Software</td>
			<td>Millipore / Luminex</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 3.1; included with Luminex Lx200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milliple Analyst Software</td>
			<td>Milliplex / VigeneTech</td>
			<td>40-086</td>
			<td>Version 5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Software</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 1.1.0.0; included with Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Unitron</td>
			<td>Z730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism Software</td>
			<td>Graphpad Software Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans Blot SD Cell and PowerPac</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-3849</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of invasive transitional cell bladder carcinoma in immune intact human muc1 transgenic mice:  a model for immunotherapy development

Un modello preclinico di carcinoma invasivo della vescica è stata sviluppata in mucina umano 1 (MUC1) transgenici (MUC1.Tg) topi per lo scopo di valutare l&#39;immunoterapia e / o chemioterapia citotossica. Per indurre il cancro della vescica, topi C57BL / 6 (tipo MUC1.Tg e selvatici) sono stati trattati per via orale con il cancerogeno N-butil-N-(4-idrossibutil) nitrosamine (OH-BBN) di 3,0 mg / giorno, 5 giorni / settimana per 12 settimane. Per valutare gli effetti di OH-BBN sul profilo delle citochine nel siero durante lo sviluppo del tumore, il sangue intero è stato raccolto tramite sanguina sottomandibolari prima del trattamento e ogni quattro settimane. Inoltre, un vaccino peptidico MUC1-targeting e placebo sono stati somministrati a gruppi di topi settimanali per otto settimane. Sono state eseguite Multiplex fluorimetrici immunoanalyses microsfere di citochine sieriche durante lo sviluppo del tumore e dopo la vaccinazione. Alla cessazione, interferone gamma (IFN-γ) / interleuchina-4 (IL-4) ELISpot analisi per MUC1 risposta immunitaria delle cellule T specifiche e valutazioni istopatologiche di tipo tumoralee grado sono stati eseguiti. I risultati hanno mostrato che: (1) l&#39;incidenza di cancro alla vescica nei topi di tipo sia MUC1.Tg e selvaggia è stata del 67%, (2) carcinomi a cellule transizionali (TCC), sviluppati in un rapporto di 2:1 rispetto ai carcinomi a cellule squamose (SCC) , (3) citochine infiammatorie aumentate con il tempo durante lo sviluppo del tumore, e (4) la somministrazione del vaccino peptidico induce un profilo di citochina Th1 siero-polarizzata e una specifica risposta di cellule T MUC1. Tutti i tumori nei topi MUC1.Tg sono stati positivi per MUC1 espressione, e la metà di tutti i tumori nei topi di tipo MUC1.Tg e selvatici erano invasive. In conclusione, utilizzando un approccio di squadra attraverso il coordinamento degli sforzi di farmacologi, immunologi, patologi e biologi molecolari, abbiamo sviluppato un modello di topo transgenico intatto immunitario del cancro della vescica che esprime hMUC1.

La valutazione preclinica degli effetti di nuove immunoterapie e combinazioni nel cancro della vescica richiede lo sviluppo di un modello animale appropriato. Nel nostro modello di topo transgenico, induzione con il cancerogeno chimico OH-BBN provocato un alto tasso di incidenza di cancro alla vescica prevalentemente TCC con qualche SCC, che è simile al cancro della vescica negli esseri umani. Per determinare istologia tumorale, MUC1 stato di espressione e la risposta immunitaria al trattamento vaccino peptidico, 21 e ...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development at JoVE.com

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Un N-butil-N-(4-idrossibutil) nitrosamine indotta modello di cancro alla vescica è stato sviluppato in mucina umano 1 (MUC1) topi transgenici per la fine del controllo MUC1-diretto immunoterapia. Dopo la somministrazione di un vaccino peptidico MUC1-mirata, una risposta di linfociti T citotossici per MUC1 è stata confermata misurando i livelli sierici di citochine e l&#39;attività delle cellule T specifiche.

Induzione di Invasive Transitional cellulare Bladder Carcinoma in immunitario intatto umani MUC1 topi transgenici: un modello di sviluppo Immunoterapia

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

induction-invasive-transitional-cell-bladder-carcinoma-immune-intact

Research

JoVE Journal

Medicine

21.1K Views.  University of California, Davis. Un N-butil-N-(4-idrossibutil) nitrosamine indotta modello di cancro alla vescica è stato sviluppato in mucina umano 1 (MUC1) topi transgenici per la fine del controllo MUC1-diretto immunoterapia. Dopo la somministrazione di un vaccino peptidico MUC1-mirata, una risposta di linfociti T citotossici per MUC1 è stata confermata misurando i livelli sierici di citochine e l'attività delle cellule T specifiche.

Video: Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Istituzione e Propagazione dei Tumori retinoblastoma umani in topi privi di sistema immunitario

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

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Medicina

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotone Imaging di invasione delle cellule tumorali in un modello di mouse ortotopico di carcinoma orale a cellule squamose

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body temperature that is observed during fever. The use of hyperthermia as an adjuvant has emerged as a promising procedure for tumor regression in the field of cancer biology. For this purpose, the most important requirement is to have reliable and uniform heating protocols. We have developed a protocol for hyperthermia (whole body) in mice. In this protocol, animals are exposed to cycles of hyperthermia for 90 min followed by a rest period of 15 min. During this period mice have easy access to food and water. High body temperature spikes in the mice during first few hyperthermia exposure cycles are prevented by immobilizing the animal. Additionally, normal saline is administered in first few cycles to minimize the effects of dehydration. This protocol can simulate fever like conditions in mice up to 12-24 hr. We have used 8-12 weeks old BALB/Cj female mice to demonstrate the protocol.

This paper describes a protocol for whole body hyperthermia in mice that can stimulate fever like conditions up to 12-24 hr.

Protocollo per lungo Ipertermia Corpo intera durata in Mouse

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

L&#39;uso di cistometria in piccoli roditori: A Study of Chemosensation vescica

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

Generazione di sottocutaneo e intraepatica umane carcinoma epatocellulare xenotrapianti in topi immunodeficienti

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized by increased urgency and frequency of urination, as well as nocturia and general pelvic pain, especially upon bladder filling or voiding. Despite years of research, the cause of IC/BPS remains elusive and treatment strategies are unable to provide complete relief to patients. In order to study nervous system contributions to the condition, many animal models have been developed to mimic the pain and symptoms associated with IC/BPS. One such murine model is urinary bladder distension (UBD). In this model, compressed air of a specific pressure is delivered to the bladder of a lightly anesthetized animal over a set period of time. Throughout the procedure, wires in the superior oblique abdominal muscles record electrical activity from the muscle. This activity is known as the visceromotor response (VMR) and is a reliable and reproducible measure of nociception. Here, we describe the steps necessary to perform this technique in mice including surgical manipulations, physiological recording, and data analysis. With the use of this model, the coordination between primary sensory neurons, spinal cord secondary afferents, and higher central nervous system areas involved in bladder pain can be unraveled. This basic science knowledge can then be clinically translated to treat patients suffering from IC/BPS.

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized in part by pelvic pain. In order to study nervous system contributions to the condition, a physiological model of urinary bladder pain is used in mice and rats.

Vescica urinaria Distensione Evocati visceromotoria Risposte come un modello per il dolore della vescica nei topi

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition ...

Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and either cut or crush it to induce peripheral nerve injury. Advantages of this surgery are its simplicity, high reproducibility, and the lack of effect on vital functions or mobility from the subsequent facial paralysis, thus resulting in a relatively mild surgical outcome compared to other nerve injury models. A major advantage of using a cranial nerve injury model is that the motoneurons reside in a relatively homogenous population in the facial motor nucleus in the pons, simplifying the study of the motoneuron cell bodies. Because of the symmetrical nature of facial nerve innervation and the lack of crosstalk between the facial motor nuclei, the operation can be performed unilaterally with the unaxotomized side serving as a paired internal control. A variety of analyses can be performed postoperatively to assess the physiologic response, details of which are beyond the scope of this article. For example, recovery of muscle function can serve as a behavioral marker for reinnervation, or the motoneurons can be quantified to measure cell survival. Additionally, the motoneurons can be accurately captured using laser microdissection for molecular analysis. Because the facial nerve axotomy is minimally invasive and well tolerated, it can be utilized on a wide variety of genetically modified mice. Also, this surgery model can be used to analyze the effectiveness of peripheral nerve injury treatments. Facial nerve injury provides a means for investigating not only motoneurons, but also the responses of the central and peripheral glial microenvironment, immune system, and target musculature. The facial nerve injury model is a widely accepted peripheral nerve injury model that serves as a powerful tool for studying nerve injury and regeneration.

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

Facial assotomia Nerve in topi: un modello per studiare motoneuroni risposta al danno

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Induzione di aterosclerosi accelerata nei topi: il modello "Wire-Injury"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure overload-induced left ventricular hypertrophy (LVH) and its progression to heart failure. In the majority of the reported investigations, this procedure is performed with intubation and ventilation of the animal which renders it demanding and time-consuming and adds to the surgical burden to the animal. The aim of this protocol is to describe a simplified technique of minimally invasive TAC without intubation and ventilation of mice. Critical steps of the technique are emphasized in order to achieve low mortality and high efficiency in inducing LVH.
Male C57BL/6 mice (10-week-old, 25-30 g, n=60) were anesthetized with a single intraperitoneal injection of a mixture of ketamine and xylazine. In a spontaneously breathing animal following a 3-4 mm upper partial sternotomy, a segment of 6/0 silk suture threaded through the eye of a ligation aid was passed under the aortic arch and tied over a blunted 27-gauge needle. Sham-operated animals underwent the same surgical preparation but without aortic constriction. The efficacy of the procedure in inducing LVH is attested by a significant increase in the heart/body weight ratio. This ratio is obtained at days 3, 7, 14 and 28 after surgery (n = 6 - 10 in each group and each time point). Using our technique, LVH is observed in TAC compared to sham animals from day 7 through day 28. Operative and late (over 28 days) mortalities are both very low at 1.7%.
In conclusion, our cost-effective technique of minimally invasive TAC in mice carries very low operative and post-operative mortalities and is highly efficient in inducing LVH. It simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal. It can be easily performed by following the critical steps described in this protocol.

The aim of this protocol is to describe step-by-step the technique of minimally invasive transverse aortic constriction (TAC) in mice. By elimination of intubation and ventilation which are mandatory for the commonly used standard procedure, minimally invasive TAC simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal.

Tecnica di costrizione aortico trasversale mininvasiva in topi per induzione dell'ipertrofia ventricolare sinistra

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an increased use of mouse models in orthopedic research was noted, most probably because mouse models offer a large number of genetically-modified strains and special antibodies for the analysis of molecular mechanisms of fracture healing. To control the biomechanical conditions, well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory, also in mice. Here, we report on the design and use of a closed bone healing model to stabilize femur fractures in mice. The intramedullary screw, made of medical-grade stainless steel, provides through fracture compression an axial and rotational stability compared to the mostly used simple intramedullary pins, which show a complete lack of axial and rotational stability. The stability achieved by the intramedullary screw allows the analysis of endochondral healing. A large amount of callus tissue, received after stabilization with the screw, offers ideal conditions to harvest tissue for biochemical and molecular analyses. A further advantage of the use of the screw is the fact that the screw can be inserted into the femur with a minimally invasive technique without inducing damage to the soft tissue. In conclusion, the screw is a unique implant that can ideally be used in closed fracture healing models offering standardized biomechanical conditions.

This protocol describes a minimally invasive osteosynthesis technique using an intramedullary screw for standardized stabilization of femur fractures, which can be used to analyze endochondral bone healing in mice.

Un modello come minimo dilagante per analizzare Endochondral frattura la guarigione nei topi in condizioni standardizzate di biomeccaniche

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...