Gli organoidi tumorali sono stati ampiamente utilizzati come modello di cancro in vitro per studiare la biologia tumorale. Il nostro protocollo fornisce una procedura dettagliata per isolare, coltura e manipolare geneticamente gli organoidi tumorali della vescica che fungono da strumento critico per studiare vari aspetti della biologia del cancro. Usando il nostro protocollo, possiamo manipolare geneticamente gli organoidi del tumore della vescica per esprimere o eliminare il gene di nostro interesse.
Inoltre, con il nostro metodo di trapianto ortotopico, possiamo creare un organoidi tumorali del microambiente tumorale intatto. A dimostrare la procedura sarà Yubin Kim, una studentessa laureata del nostro laboratorio. Inizia stabilendo organoidi del tumore della vescica dal tumore della vescica murina.
Aggiungere un millilitro di HEPES millimolare in DMEM ai frammenti tumorali e tritare il tessuto con una lama di rasoio sterilizzata. Per dissociare i frammenti in sospensione cellulare, aggiungere nove millilitri di DMEM con HEPES, collagenasi di tipo uno e due e termolisina ai pezzi tumorali e incubarli per 1,5-due ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica su uno shaker orbitale. Dopo l'incubazione, trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri.
Centrifugare il tubo a 400 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il supernatante. Rimescolare il pellet in cinque millilitri di tampone di liscivie ACK e incubare il tubo a temperatura ambiente per tre o cinque minuti per lisciviare eventuali globuli rossi. Nel frattempo, rivestire un pozzo in una piastra da 24 po 'con 150 microlitri di fattore di crescita freddo ghiacciato ridotto matrice di membrana seminterrata e posizionare la piastra in un'incubatrice per 30 minuti.
Aggiungere 20 millilitri di DMEM nel tubo con le cellule e ripetere la centrifugazione. Aspirare il supernatante e resospeso il pellet in un millilitro dello 0,25% di tripside EDTA e 10 micromolare Y-27632 diidrocloruro. Incubare il tubo per cinque minuti in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius.
Quindi neutralizzare la tripside aggiungendo 10 millilitri di DMEM con 10%FBS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri su un nuovo tubo da 50 millilitri per rimuovere i detriti non digeriti. Centrifugare il tubo a 400 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il supernatante.
Quindi rimescolare il pellet con un millilitro di DMEM e contare le cellule con un emocitometro. Trasferire da tre a quattro volte 10 alle quattro cellule tumorali su un microtubo da 1,5 millilitri sul ghiaccio e centrifugarlo a 400 volte g per tre minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere con cura il supernatante e rimescolare le cellule in 500 microlitri di mezzo organoide prebellico e 10 micromolare Y-27632.
Trasferire la sospensione cellulare nella matrice di membrana precedentemente preparata rivestita bene e riposizionare la piastra di 24 pozzi nell'incubatore. Sostituire il mezzo ogni due giorni con 500 microlitri di mezzo organoide prebellico. Dividere gli organoidi tumorali 12 ore prima della trasduzione mediata dal Lentivirus.
Il giorno successivo, scongelare rapidamente un virus contenente aliquota in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Aggiungere il virus scongelato a 250 microlitri di mezzo organoide con 10 micromolare Y-27632 e otto microgrammi per millilitro di bromuro di esadimetrina. Sostituire il mezzo organoide nella piastra a 24 pozzi con 500 microlitri del virus contenenti mezzo e incubare la piastra per 12-16 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Per preparare gli organoidi tumorali della vescica per il trapianto ortotopico, aggiungere 500 microlitri di collagenasi dispasi al mezzo organoide nella piastra di 24 po '. Pipettare la matrice della membrana basale e il mezzo su e giù, quindi incubare la piastra per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, raccogliere le cellule in un tubo da 15 millilitri e aggiungere cinque millilitri di DMEM prebellica.
Quindi centrifugare il tubo a 400 volte g per tre minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il supernatante. Risospendare il pellet con un millilitro di DMEM e trasferire la soluzione in una piastra di Petri da 90 millimetri. Al microscopio, raccogliere da 10 a 100 organoidi tumorali con una pipetta P200 e raccoglierli in un microtubo sul ghiaccio.
Centrifugare il microtubo e rimuovere con cura il supernatante. Quindi mantenere il pellet sul ghiaccio fino a quando i topi non sono pronti per l'intervento chirurgico. Prima del trapianto di parete della vescica submucosa, tenere le siringhe, le punte delle pipette e la matrice della membrana basale sul ghiaccio fino a quando non sono pronte per l'uso.
Dopo che il mouse è stato anestetizzato, posarlo in posizione supina e mantenere l'anestesia per inalazione maschera del 2% di isoflurane vaporizzato. Applicare lo iodio di povidone con una garza sterile e pulirlo con il 70% di etanolo. Fai una piccola incisione trasversale nella pelle e nella parete muscolare dell'addome medioline inferiore con forbici chirurgiche sterili.
Esporre la vescica dalla cavità addominale e sostenerla con un batuffolo di cotone imbevuto salino. Rimescolare i pellet organoidi in 80 microlitri di mezzo organoide contenente la matrice della membrana basale ad alta concentrazione del 50% e iniettare la sospensione nell'aspetto anteriore della cupola della vescica utilizzando la siringa per insulina. Chiudere l'incisione con una sutura di nylon 4-0 e disinfettare il sito chirurgico con iodio di povidone e 70% di etanolo.
Lasciare che il mouse si riprenda sotto un irradiatore a infrarossi per 10-15 minuti. Quindi monitorare di nuovo il mouse fino a quando non riprende conoscenza. Gli organoidi tumorali della vescica del topo sono stati stabiliti e coltivati per nove giorni.
Se le cellule tumorali non formano organoidi tumorali, sono state potenzialmente uccise durante la fase di dissociazione e potrebbe essere necessario regolare il tempo di digestione enzimatica. Gli organoidi tumorali della vescica mostravano forti segnali GFP con infezione lentivirale di successo. Dopo la concentrazione, un totale di 250 microlitri di virus contenenti media è stato sufficiente per infettare 30.000 singole cellule tumorali nella matrice della membrana basale e mantenere un'efficienza di infezione dal 90 al 100%.
Le allografie tumorali della vescica sono state raccolte tre settimane dopo il trapianto ortotopico e l'istologia del tumore è stata analizzata utilizzando la colorazione H&E. I trapianti ortotopici di organoidi tumorali possono crescere come tumori della vescica per due o tre settimane. Seguendo questa procedura, i ricercatori possono eseguire l'immunoistochimica degli organoidi tumorali risultanti o effettuare una RT-PCR quantitativa per i geni di interesse.
Questi esperimenti possono caratterizzare ulteriormente gli organoidi tumorali. Il nostro protocollo ci permette di manipolare facilmente i geni nelle cellule tumorali rispetto al modello del topo pur mantenendo le caratteristiche in vivo dei tumori al fine di studiare le funzioni specifiche di vari geni coinvolti nella tumorigenesi del cancro alla vescica.
