Questo protocollo dimostrerà come le cellule staminali pluripotenti indotte differenziate possono essere sezionate su un organo su chip per generare una barriera e-encefalica del sangue completamente umana, personalizzata e microfluidico, che può essere utilizzata per prevedere la permeabilità dei farmaci del sistema nervoso centrale e per studiare i disturbi neurologici. Utilizzando un organ-on-chip disponibile in commercio, dimostreremo come qualsiasi laboratorio biologicamente orientato può utilizzare questa tecnologia per generare una barriera e-encefalica microfluidico personalizzata su chip. L'accumulo di prove suggerisce che la BBB gioca un ruolo nella malattia neurologica generando chip BBB personalizzati derivati da iPSC di individui con una malattia neurologica genetica.
Sarà possibile studiare il ruolo della BBB nella salute e nelle malattie. Questo metodo può essere utile anche per le aziende farmaceutiche, che possono utilizzare questa piattaforma BBB umana per esaminare la penetrabilità dei farmaci neurologici candidati nel cervello umano. L'applicazione di tecnologie organ-on-chip di solito richiede competenze ingegneristiche specializzate.
L'utilizzo di piattaforme disponibili in commercio consente l'applicazione di questa tecnologia in qualsiasi laboratorio biologicamente orientato. Per iniziare, portare il piatto contenente i trucioli preparati nell'armadietto della biosicurezza. Utilizzando una pipetta P200, lavare delicatamente entrambi i canali aggiungendo 200 microlitri di mezzo di differenziazione neurale nell'ingresso e estraendo il liquido dall'uscita.
Evitando il contatto con le porte, aspirare accuratamente le goccioline di supporto in eccesso dalla superficie del chip. Agitare delicatamente la sospensione cellulare per garantire una sospensione cellulare omogenea. Per seminare le cellule progenitrici neurali derivate da iPSC nel canale superiore per generare il lato cerebrale, aggiungere una punta P200 contenente da 30 a 100 microlitri di sospensione cellulare alla concentrazione di uno per 10 alle sei cellule per millilitro all'ingresso del canale superiore e rilasciare delicatamente la punta dalla pipetta.
Prendere una pipetta P200 vuota, deprimere lo stantuffo, inserire nella presa del canale superiore e tirare con cura la sospensione a cella singola attraverso la punta. Trasferire il chip al microscopio per controllare la densità di semina e la distribuzione omogenea delle cellule all'interno del canale superiore. Dopo aver confermato la densità cellulare al 20% di copertura, posizionare immediatamente i trucioli nell'incubatrice per due ore a 37 gradi Celsius.
Successivamente, lavare via le cellule che non si attaccano aggiungendo un nuovo mezzo di differenziazione neurale nell'ingresso e tirando il liquido tramite pipetta dall'uscita. Mantenere le cellule in condizioni statiche a 37 gradi Celsius con una sostituzione giornaliera del mezzo di differenziazione neurale. Dopo che gli INPC si sono attaccati o in un giorno successivo alla semina, portare il piatto contenente i trucioli preparati nell'armadietto della biosicurezza.
Lavare delicatamente il canale inferiore con 200 microlitri di mezzo cellulare endoteliale. Evitando il contatto con le porte, aspirare con cura goccioline di mezzo cellulare endoteliale in eccesso dalla superficie del chip, assicurandosi di lasciare il mezzo in entrambi i canali. Agitare delicatamente la sospensione cellulare per garantire una sospensione cellulare omogenea.
Utilizzando una pipetta P200, disegnare da 30 a 100 microlitri della sospensione cellulare endoteliale microvascolare cerebrale derivata dall'iPSC alla concentrazione da 14 a 20 volte 10 alle sei cellule per millilitro e posizionare la punta nell'ingresso del canale inferiore. Il passo più critico per ottenere proprietà barriera funzionale è la semina di cellule endoteliali microvascolari cerebrali. È fondamentale seminare le cellule a densità corretta per evitare la formazione di bolle per verificare la distribuzione omogenea all'interno del chip dell'organo.
Premere lo stantuffo su una pipetta P200 con una punta vuota, inserire nella presa del canale inferiore e rilasciare lentamente lo stantuffo della pipetta per tirare con cura la sospensione a cella singola attraverso il canale inferiore. Aspirare la sospensione cellulare in eccesso dalla superficie del truciolo. Evitare il contatto diretto con le porte di ingresso e di uscita per garantire che nessuna sospensione cellulare sia aspirata fuori dai canali.
Trasferire il chip al microscopio per controllare la densità di semina. Il canale inferiore è riempito con celle senza spazi osservabili nel mezzo. Dopo aver confermato la corretta densità cellulare, seminare le cellule nei trucioli rimanenti.
Per attaccare le cellule alla membrana porosa, che si trova sopra il canale inferiore, invertire ogni chip e lasciarle riposare in una culla di chip. Posizionare un piccolo serbatoio contenente DPBS sterile all'interno del piatto da 150 millimetri per fornire umidità alle cellule. Incubare i trucioli a 37 gradi Celsius per circa tre ore o fino a quando le cellule nel canale inferiore non si sono attaccate.
Una volta che le cellule endoteliali endoteliali cerebrali derivate da iPSC si sono attaccate, capovolgere i trucioli in posizione verticale per consentire l'attacco cellulare alla parte inferiore del canale inferiore. 48 ore dopo la semina delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali derivate dall'iPSC, equilibrano la temperatura del mezzo cellulare endoteliale riscaldandosi in un bagno d'acqua Celsius di 37 gradi per un'ora. Quindi, degasa il mezzo per incubazione sotto un sistema di filtrazione a vuoto per 15 minuti.
Successivamente, sanificare l'esterno dell'imballaggio e dei vassoi del modulo portatile con il 70% di etanolo, pulirli e trasferirli nell'armadio di biosicurezza. Aprire la confezione e posizionare i moduli nel vassoio Orientarli con i serbatoi verso la parte posteriore del vassoio. Pipetta tre millilitri del supporto pre-equilibrato e caldo ad ogni serbatoio di ingresso.
Aggiungere il mezzo di coltura cellulare endoteliale al serbatoio di ingresso del canale inferiore e il mezzo di differenziazione neurale al serbatoio di ingresso del canale superiore del canale superiore. Quindi, pipettare 300 microlitri dei supporti pre-equilibrati e caldi in ogni serbatoio di uscita, direttamente su ogni porta di uscita. Posizionare fino a sei moduli portatili su ogni vassoio.
Portare i vassoi nell'incubatore e scivolare completamente nel modulo di coltura con la maniglia del vassoio rivolta verso l'esterno. Selezionare ed eseguire il ciclo primario nel modulo impostazioni cultura. Chiudere la porta dell'incubatore e consentire al modulo di coltura di innescare i moduli portatili per circa un minuto.
Il ciclo di adescamento viene completato quando la barra di stato è pronta. Rimuovere il vassoio dal modulo di coltura e portarlo all'armadio per la biosicurezza. Ispezionare la parte inferiore di ogni modulo portatile nell'armadio di biosicurezza per verificare che i moduli portatili siano stati innescati con successo.
Cerca la presenza di piccole goccioline in tutte e quattro le porte. Se un modulo portatile non mostra goccioline, rieseguire il ciclo primario su tali moduli. Se un supporto gocciola sul vassoio, che si verifica più spesso dalle porte di uscita, pulire il vassoio con il 70% di etanolo.
Successivamente, lavare delicatamente entrambi i canali di ciascun chip con un mezzo di coltura caldo e equilibrato specifico della cella per rimuovere eventuali bolle nel canale e posizionare piccole goccioline di supporti sulla parte superiore di ogni porta di ingresso e uscita. Inserire i chip con i supporti nei moduli portatili e posizionare fino a sei su ciascun vassoio. Inserire i vassoi nel modulo delle impostazioni cultura.
Programmare le condizioni appropriate di coltura dei truciolo d'organo, come portata ed allungamento, sul modulo di coltura. Non appena il ciclo di regolamentazione è completo, che richiede circa due ore, iniziano le condizioni programmate. Successivamente, il modulo di coltura inizia il flusso in condizioni di coltura di chip d'organo preimpostate.
L'immunocitochimica sul chip barriera eo-encefalica basato su iPSC sette giorni dopo il seeding mostra le sfere EZ differenziate in una popolazione di cellule neurali miste nel canale lato cervello superiore, inclusi astrociti beta-positivi S100, cellule progenitrici neurali positive alla nestina, così come astrociti positivi alla GFAP e neuroni positivi alla tubulina beta III. Cellule endoteliali cerebrali microvascolari derivate dall'IPSC sementi nel canale inferiore del lato sanguigno espresse GLUT-1 e PECAM-1. La valutazione della permeabilità del chip della barriera eencefalica dimostra che il chip dell'organo seminato con cellule endoteliali endoteliali microvascolari cerebrali derivate da iPSC e sfere EZ aveva una barriera stretta rispetto ai chip d'organo sementi con cellule endoteliali cerebrali derivate da iPSC.
I trucioli d'organo seminati con sfere EZ da soli non mostravano proprietà barriera. Dal trattamento superficiale iniziale del canale alla commutazione media ogni giorno, evitare la formazione di bolle nel canale. Durante tutto il passaggio del protocollo in cui il reagente di attivazione della superficie, la matrice extracellulare o il supporto contenente celle devono essere inseriti attraverso i canali, è estremamente importante verificare attentamente che non si riscontri alcuna bolla.
Il saggio di permeabilità può essere eseguito per valutare la penetrabilità cerebrale umana dei farmaci candidati. Questo approccio può servire per testare potenziali terapie. L'applicazione del chip BBB basato su iPSC consente di studiare il ruolo della BBB in varie malattie neurologiche.
In futuro, tale piattaforma potrebbe essere utile per applicazioni mediche predittive e personalizzate.
