Ringraziamo e riconoscere Dr. Peter Nelson e Sonya Anderson presso la banca del tessuto di cervello UK-ADC per la fornitura di cervello umano tutti i campioni di tessuto (NIH concedere numero: P30 AG028383 dal National Institute on Aging). Ringraziamo Matt Hazzard e Tom Dolan, servizi di Information Technology, tecnologia accademico e impegno di facoltà, Università del Kentucky per assistenza grafica. Questo progetto è stato sostenuto dalla concessione numero 1R01NS079507 dall'Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo (a B.B.) e dalla concessione numero 1R01AG039621 dall'Istituto nazionale su invecchiamento (per A.M.S.H.). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale dell'Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo o l'Istituto nazionale su invecchiamento. Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Le informazioni di seguito si basano su sicurezza attuale e gli standard normativi presso l'Università del Kentucky, Lexington, KY, Stati Uniti d'America. Come precauzione di sicurezza, consultare programma sicurezza biologica dell'istituzione e delle più attuali normative e raccomandazioni prima di lavorare con tessuti umani.
Attenzione: Il tessuto umano può essere una fonte di sangue agenti patogeni, tra cui il virus dell'immunodeficienza umana (HIV), virus dell'epatite B (HBV), virus dell'epatite C (HCV) e altri. Lavoro con tessuto umano comporta il rischio di infezione da patogeni presenti nel sangue. Di conseguenza, alcune considerazioni di sicurezza e normativi sono indispensabili quando si lavora con tessuti umani per proteggere il personale di laboratorio. Lavorare con tessuto umano negli Stati Uniti richiede un laboratorio di livello 2 di biosicurezza, nonché precauzioni di sicurezza e formazione secondo NIH sezione IV-B-7, OSHA Act del 1970 clausola 5(a)(1) e programma istituzionale sicurezza biologica dell'utente. In generale, approvazione Comitato istituzionale biosicurezza e/o Institutional Review Board deve essere ottenuto prima di svolgere qualsiasi ricerca che coinvolge umani materiali (tessuti, fluidi corporei). La formazione è necessaria per tutti coloro che lavorano con materiali umani e include training di sicurezza di laboratorio di base, ad es., chimica igiene e sicurezza del laboratorio, nonché formazione specifica sulla sicurezza biologica, rifiuti pericolosi e umani patogeni presenti nel sangue. Tutti coloro che lavorano con materiali umani è altamente raccomandati per ottenere le vaccinazioni di epatite B, prima di lavorare con materiali umani. Personale sono tenuto a indossare specifici dispositivi di protezione individuale durante il lavoro con materiali umani, ad es., un camice da laboratorio con risvolto e una faccia scudo e indossare i guanti in ogni momento. Tutto il lavoro viene eseguito in una cappa di biosicurezza (classe 2). Tutte le apparecchiature che viene in contatto con materiali di umani e ogni rifiuti da materiali umani viene gestita in modo appropriato per evitare contaminazione e/o infezione del personale. Tutte le attrezzature e le superfici vengono pulite con etanolo al 10% candeggina e il 75% dopo ogni procedura che coinvolga materiali umani. Una fuoriuscita con materiali umani dovrà essere immediatamente pulita. La cristalleria è sterilizzato nell'autoclave dopo ogni utilizzo. Rifiuti, compreso il tessuto umano non fissato, sono raccolti in un sacchetto di rifiuti con etichetta biohazard e sterilizzati in autoclave. Sharps sono raccolti in un contenitore di puntura e antiperdita etichettato come biologici pericoloso. Tutti i rifiuti da materiali umani sono stato eliminato secondo norme di sicurezza biologica dell'istituzione.
Nota: Il nostro laboratorio ottiene i campioni freschi corteccia frontale da individui deceduti attraverso il centro di Sanders-Brown su invecchiamento (IRB #B15-2602-M). Criteri di inclusione sono: registrazione in studio del gruppo di analisi longitudinale UK-ADC e un intervallo Post-Mortem (PMI) ≤ 4 h64. Autopsie seguono un protocollo standard e tutte le procedure sono conformi alle linee guida NIH Biospecimen Best Practice65. Un breve PMI di meno di 4 ore è di massima importanza per garantire redditività capillare dopo l'isolamento. Possono essere utilizzati tessuti sia freschi che congelati. Se il congelamento è necessario, tessuto cerebrale umano appena ottenuti dovrebbe essere scossa-congelati in azoto liquido e conservato a-80 ° C. Tessuto fresco o scongelato dovrebbe essere memorizzato nel buffer di isolamento (Vedi sotto) ed elaborato rapidamente. Troviamo che 10 g di tessuto umano fresco rendimenti circa 100 mg di capillari cerebrali (peso umido).
1. installazione
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Preparazione del tampone Nota: Il volume di tampone necessario dipende dalla quantità di tessuto. Tutti i volumi di buffer nel protocollo seguente sono basati su 10 g di tessuto di corteccia del cervello umano.<ol>
<li>L isolamento Buffer: Utilizzare 1,5 L di soluzione tampone fosfato e di Dulbecco (DPBS; 2.7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 0,9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) e completare con 5 mM D-glucosio (1,35 g ) e 1 mM sodio piruvato (0,165 g). Dopo l'aggiunta del glucosio e del piruvato, regolare a pH 7.4 con idrossido di sodio. Raffreddare e conservare il buffer a 4 ° C prima dell'uso.</li>
		<li>Albumina di siero bovino (BSA): Aggiungere 10 g di polvere di BSA a 1 L di tampone di isolamento a una concentrazione finale di BSA 1%. Mescolare lentamente per evitare bolle, regolare a pH 7.4 e conservare a 4 ° C durante la notte. Immediatamente prima dell'uso, mescolare delicatamente; evitare la formazione di bollicine per evitare la denaturazione di albumina.</li>
		<li>medio di gradienti di densità: pesare 18 g di medio gradiente di densità in una bottiglia di vetro e aggiungere un ancoretta magnetica. Aggiungere 60 mL di buffer di isolamento e agitare vigorosamente per 5 minuti fino a quando tutti i polvere viene sospesa. Archivio durante la notte a 4 ° C per consentire allo densità gradiente a sciogliere. Mescolare per 10 min destra prima dell'uso.</li>
		<li>Memorizzare tutti i buffer a 4 ° C; mantenere tutti gli strumenti e buffer sul ghiaccio durante la procedura di isolamento intero. Mescolare tutti i buffer prima dell'uso.</li>
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</li>
	<li>
Messa a punto sperimentale
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<li>Montare il pestello del macinino Potter-Chazen tessuto sull'agitatore elettronico. Posto il Potter-Chazen tessuto smerigliatrice e l'omogeneizzatore lisata con pestello su ghiaccio sotto il cofano. Preparare una maglia del filtro 300 µm (5 x 5 cm2), piegarlo ad un cono e inserire e allegarlo a un 50 mL tubo Falcon con nastro (Figura 1A).</li>
		<li>Inserire anelli di collegamento e filtri di ceppo di cella (dimensione dei pori: 30 µm) su provette Falcon da 50 mL. Preparare sacchetti di rifiuti a rischio biologico. Collocare tutte le necessarie attrezzature nella biosicurezza armadio (Vedi Tabella materiali).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione del campione cervello
Nota: La Figura 1A Mostra il diagramma di flusso di lavoro della procedura intero isolamento descritta di seguito. Tessuto di cervello umano può provenire da qualsiasi parte della corteccia e può essere utilizzato fresco o congelato. Tessuto cerebrale congelati possa essere scongelato a temperatura ambiente (nessun buffer; ~ 30 min per 10 g). Per ottenere risultati comparabili, il tessuto cerebrale dovrebbe essere ottenuto dalla stessa regione del cervello per ogni esperimento. Questo protocollo è ottimizzato per fresh (PMI < 4h) corteccia cerebrale umana che non è stato congelato.
<ol><li>Preparazione del tessuto di cervello umano: documentare il peso del tessuto cerebrale. Tutti i numeri nel seguente protocollo sono adatti per 10 g di tessuto cerebrale umano fresco. Posizionare il tessuto cerebrale in un 100mm di Petri. Rimuovere con cura tutte le meningi con il forcipe. Utilizzare un bisturi per tagliare la materia bianca.</li>
	<li>Macinazione del tessuto cerebrale umano: attentamente tagliare il tessuto cerebrale e usa mezzi con un bisturi. Tritare per circa 5 min (2 – 3 mm pezzi). Trasferire il tessuto cerebrale per la smerigliatrice di tessuto Potter-Chazen. Aggiungere 30 mL di buffer di isolamento. Nota: I pezzi di tessuto macinate sono difficili da vedere dato che il tessuto cerebrale si trasforma in poltiglia attraverso il processo di macinazione.</li>
</ol>3. omogeneizzazione
<ol><li>Smerigliatrice di tessuto Potter-Chazen (clearance: 150 – 230 µm): omogeneizzare ogni campione con 100 colpi ad una velocità di omogeneizzatore di 50 giri/min. Documentare il tempo ogni 25 colpi e il tempo totale necessario per 100 colpi. Vedere la tabella 1 per un protocollo di omogeneizzazione proposto; il tempo totale per l'omogeneizzazione di 10 g di corteccia frontale umana è circa 22 min. Non si mescoli in aria per evitare bolle.</li>
	<li>Lisata omogeneizzatore (clearance: 80 – 130 µm): trasferire l'omogeneizzato in un omogeneizzatore lisata sul ghiaccio. Omogeneizzare la sospensione con 20 colpi (~ 6 s/corsa, totale di ~ 2 min). Evitare le bolle.</li>
</ol>4. centrifugazione
<ol><li>Distribuire equamente omogeneato del cervello in quattro provette da 50 mL centrifugazione e il volume totale dell'omogeneato del documento. Distribuire 50 mL di tampone di gradienti di densità nelle provette centrifugazione (12,5 mL per tubo). Utilizzare 10 mL di buffer di isolamento per sciacquare il pestello e omogeneizzatore e dividere i quattro tubi di centrifugazione (~2.5 mL per tubo).</li>
	<li>Chiudere bene le provette per centrifuga con tappi. Mescolare l'omogeneato, densità gradiente medio e buffer agitando vigorosamente i tubi. Centrifugare a 5.800 x g per 15 min a 4 ° C (rotore ad angolo fisso); Selezionare una velocità di decelerazione media di mantenere il pellet fissato al tubo. Scartare il surnatante e risospendere in 2 mL di BSA 1% ciascuna.</li>
</ol>5. filtrazione
Nota: Per separare i capillari da globuli rossi e altri detriti cellulari, sono necessari diversi passaggi di filtrazione.
<ol><li>maglia di 300 µm: dopo la ri-sospensione il pellet, filtrare la sospensione attraverso la maglia di 300 µm. Capillari vengono filtrati attraverso la rete, considerando che le navi più grandi e più grande cervello detriti rimangono sulla mesh. Lavare accuratamente la mesh con fino a 50 mL di BSA 1%. Scartare la mesh. Nota: Questo passaggio di filtrazione Cancella la sospensione capillare da qualsiasi più grandi vasi o porzioni di detriti di cervello.</li>
	<li>
Filtro di ceppo di celle 30 µM Nota: Questo passaggio di filtrazione separa capillari da globuli rossi e altri detriti di cervello.<ol>
<li>Distribuire il capillare filtrato da 6.1 scavalcare i filtri di ceppo di cella cinque 30 µm (circa 10 mL di filtrato capillare al filtro di ceppo di celle). I capillari sono ostacolati da questo filtro, considerando che globuli rossi, altre singole cellule e detriti piccolo cervello passano attraverso il filtro e vengono raccolti nel filtrato.</li>
		<li>Lavare ogni filtro con 25 mL di BSA 1%. In seguito, versare filtrati tutti sopra il sesto filtro per aumentare il rendimento. Lavare ogni filtro con 50 mL di BSA 1%; mantenere la cella ceppo filtri con contenente i capillari e scartare il filtrato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. prelievo
<ol><li>Capovolgere i filtri e lavare i capillari di BSA 1% per ogni filtro 50 ml in provette da 50 mL. Applicare pressione con la punta della pipetta un pipettatore 5ml delicatamente e spostarlo attraverso il filtro per lavare via i capillari del cervello.</li>
	<li>Assicurarsi di lavare tutti i capillari cerebrali, soprattutto dal bordo del filtro. Evitare le bolle poiché questo rende più difficile il processo di filtrazione e aumenta la probabilità di perdita capillare.</li>
</ol>7. lavaggio
<ol><li>Dopo aver raccolto i capillari, centrifugare tutti i campioni a 1.500 x g per 3 min a 4 ° C (rotore oscillante). Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in circa 3 mL di buffer di isolamento. Combinare tutti i pellet sedimento da un campione in una provetta conica da 15 mL e riempirlo con buffer di isolamento. Centrifugare nuovamente a 1.500 x g per 3 min a 4 ° C e lavare due volte.</li>
	<li>Documentare la purezza capillare con un microscopio (ingrandimento 100 X) e la macchina fotografica (Figura 1B). Nota: La resa capillare del cervello da 10 g di tessuto cerebrale umano è in genere circa 100 mg. I capillari del cervello isolato possono ora essere utilizzati per esperimenti, elaborati (ad es., lisato, isolamento di membrana), o essere flash-congelati e conservati a-80 ° C in provette per criogenia per un minimo di 6 – 12 mesi (evitare più cicli di gelo-disgelo).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il presente protocollo descrive l'isolamento dei capillari del cervello umano intatta e vitale dal tessuto fresco. In questa sezione discutiamo dettagliatamente quanto segue: 1) modifiche al protocollo, 2) risoluzione dei problemi di errori comuni, 3) le limitazioni della tecnica, 4) il significato del modello rispetto alle esistenti e modelli alternativi barriera emato - encefalica, e 5). potenziali applicazioni per i capillari del cervello umano isolato.
Il protocollo descritto qui è ottimizzato per 10 g di tessuto fresco di corteccia frontale umana. Tuttavia, è relativamente semplice modificare questa procedura per: 1) più o meno a 10 g di tessuto, tessuto cerebrale 2) congelato o tessuto cerebrale 3) da una regione del cervello diverso da quello della corteccia frontale. In primo luogo, con più o meno di 10 g di tessuto cerebrale, il volume necessario dei buffer può semplicemente essere scalato verso l'alto o verso il basso per la quantità disponibile di tessuto. Così, se solo 5 g di tessuto cerebrale è disponibile, il volume dei buffer dovrebbe essere ridotto di metà. In secondo luogo, descriviamo un isolamento capillare che utilizzato il tessuto cerebrale fresco, ma tessuto congelato può essere utilizzato se il tessuto fresco è disponibile38. In terzo luogo, abbiamo usato il tessuto cerebrale fresco prelevato dalla corteccia frontale, ma capillari possono essere isolati da altre regioni corticali del cervello se c'è abbastanza tessuto disponibile. È anche possibile isolare capillari da regioni non-corticali del cervello (ad es., materia bianca), ma queste regioni hanno una cella diversa composizione e capillare densità 66,67,68. Quindi, usando il tessuto da una regione diversa del cervello probabilmente richiederebbe il protocollo per essere regolato (ad es., volume tampone, gradiente di densità media, velocità di centrifugazione, e/o numero di passi di filtrazione).
La procedura di isolamento capillare, mentre non complesse per sé, è sensibile a piccole perturbazioni o alterazioni nel protocollo. Modifica può comportare una diminuita resa capillare o ridotta redditività capillare. Tabella 2 delinea i più comuni errori e problemi che si verificano durante l'isolamento e vengono elencati suggerimenti per evitare questi errori e soluzioni per la risoluzione dei problemi se si verificano. Il problema più comune connesso con la procedura è una bassa resa capillare. La perdita di capillari è spesso la somma cumulativa di piccole perdite ad ogni passo ed è a causa di piccole deviazioni attraverso la procedura. Un passaggio fondamentale in cui una grande quantità di vasi capillari potrebbero perdersi è la centrifugazione di densità. Una concentrazione non corretta nel buffer si traduce in una densità non corretta per separare i capillari da detriti cellulari che riduce il volume del pellet capillare. La figura 3 Mostra le conseguenze di medio gradiente di densità troppo o troppo poco in fase di centrifugazione relativo omogeneato del cervello. Regolazione per la corretta concentrazione potrebbe risolvere il problema. Si noti che la velocità di accelerazione e decelerazione della centrifuga può colpire anche la formazione del precipitato capillare del cervello. Capillari possono anche essere persi durante i passaggi 6 – 7 se parte del materiale capillare bastoni per le punte di pipetta. Questo problema può essere risolto sciacquando accuratamente ogni punta della pipetta prima di modificarla. Durante il passaggio 7, lavando i capillari del filtro di ceppo cellulare potrebbe essere incompleto e/o capillari possono aderire al bordo del filtro. Questo può essere evitato controllando il filtro al microscopio, seguita da ulteriori lavaggi. Perdere i capillari durante ogni passaggio della procedura di isolamento può provocare un pellet capillare trascurabile o non abbastanza capillare materiale per un'ulteriore elaborazione e sperimentazione.
Isolando i capillari del cervello dal tessuto umano fresco rappresenta un modello unico barriera emato - encefalica che ricorda da vicino la situazione in vivo . Tuttavia, esistono diverse limitazioni della tecnica. Una sfida è la disponibilità di tessuto umano fresco. Come le PMI ottimale è ≤ 4 h, raccolto in una PMI significativamente più lungo del tessuto di cervello non sarà abbastanza fresco per alcune applicazioni a valle. In alcuni casi, può essere difficile ottenere la quantità di tessuto che sono abbastanza grandi per più gruppi sperimentali, creando una strozzatura applicazioni a valle. Quindi, isolando freschi capillari da roditore19, canini69, bovino42o porcina70 tessuto cerebrale può essere più adatto per modellare la barriera emato - encefalica. Fattori che determinano la variabilità del tessuto di cervello umano quali età, sesso, etnia, stato di malattia, storia di farmaco, regione del cervello del campione e PMI dovrebbe essere preso in considerazione nell'interpretazione e la pubblicazione di dati. A livello sperimentale è importante notare che i capillari isolati includono ancora periciti, ma astrocytic endfeet vengono rimossi tramite la procedura44. Ha bisogno di essere preso in considerazione che il modello presentato qui serve come un modello ex vivo della barriera sangue - cervello (cioè, cellule endoteliali dei capillari), ma non come modello dell'unità neurovascolare.
Lavorare con qualsiasi tessuto umano presenta sempre un rischio di sicurezza inerente e i ricercatori devono prendere le opportune precauzioni durante la procedura di isolamento per evitare il contagio. In particolare, negli Stati Uniti, lavoro con tessuti umani richiede spazio di laboratorio designato che è certificata BSL 2 e comprende un armadio di sicurezza biologica (classe A2). Inoltre, il personale deve utilizzare dispositivi di protezione individuale (cioè., camice, guanti e protezione per il viso) e designate per attrezzature per il lavoro con tessuto umano e implementare gestione dei rifiuti a rischio biologico. Attuazione di queste misure di sicurezza è che richiede tempo, costosa e aumenta la difficoltà della procedura, soprattutto per il personale di laboratorio inesperto.
La barriera emato - encefalica è altamente conservata tra gli organismi con un ben definito di CNS71. La barriera emato - encefalica umana di modellazione è difficile perché c'è complesso neurovascolare accoppiamento fra le cellule dell'unità neurovascolare. Un cervello umano adulto è stato stimato avere in media circa 86 miliardi di neuroni e si pensa che quasi ogni neurone ha una propria capillare nelle vicinanze per garantire un'adeguata alimentazione con ossigeno e sostanze nutritive72,73. Cellule endoteliali dei capillari costituiscono la più grande area di superficie dell'interfaccia sangue-cervello (12 – 18 m2 per un uomo adulto sano). Giunzioni strette rappresentano un impedimento per una vasta gamma di pharmacotherapeutics bloccando paracellulare diffusione di soluti. Inoltre, numerosi studi descrivono la disfunzione della barriera nei disordini neurodegenerative, ad es., malattia di Alzheimer74, corsa75, epilessia38,76, sclerosi multipla77, e cerebrali traumatiche lesioni28,78. Così, è assolutamente necessario stabilire modelli strettamente rappresentano la barriera emato - encefalica umana e consentono una migliore comprensione della funzione della barriera nella salute e nella malattia.
Esistono numerosi in vitro delle cellule cultura modelli della barriera sangue - cervello; per le recensioni degli esperti su questo argomento vedere 41,49,51,69,79,80. Brevemente, entrambi appena isolato cellule endoteliali dei capillari del cervello per colture primarie e linee cellulari endoteliali capillare cervello immortalata sono disponibili. Colture primarie di cellule endoteliali del microvessel cerebrale sono utilizzati principalmente da mouse, ratto, maiale e mucca. Tuttavia, colture cellulari primarie sono laboriosi poiché le cellule devono essere appena isolate. Linee di capillare delle cellule endoteliali immortalizzate cervello sono disponibili da topo, ratto e umani e sono meno laborioso perché essi possono essere attraversate per uso a lungo termine. Tuttavia, le linee cellulari immortalizzate anche hanno un limite su quanto spesso possono essere attraversate prima di perdere le loro caratteristiche endoteliali. Sia le cellule primarie, nonché linee di cellule immortalizzate sono spesso coltivate su piastre di modellare l'endotelio capillare del cervello e misurare il trasporto della barriera di permeabilità e droga attraverso il monostrato cellulare, quindi imitante trasporto sangue-cervello41 ,81,82. Terreni di coltura in questi modelli possono anche essere modificati o completati con gli astrociti, periciti o altri fattori fisiologicamente rilevanti come accampamento41,83,84.
Il vantaggio delle linee cellulari immortalizzate è loro relativamente facile accesso e la disponibilità. Mentre le cellule endoteliali in coltura possono raggiungere confluenza, perde la proprietà delle cellule endoteliali come crescono by-side in un monostrato. Ad esempio, colta hCMECs visualizzare ridotta espressione dei trasportatori come la P-gp, proteine di giunzione stretta e permeabilità variabile display a xenobiotici41. La figura 4 Mostra un Western blot per l'espressione della proteina P-gp in cellule hCMEC/D3 rispetto al recente isolati umani capillari. Nonostante una quantità 10 volte inferiore di proteine totali, il segnale per la P-gp è più forte nei capillari umani isolati rispetto alle cellule di hCMEC/D3. Questo indica che le cellule hCMEC/D3 perso una quantità significativa di espressione della proteina P-gp nella cultura. Inoltre, le differenze di cultura media, ambiente e attrezzature pregiudica le misure chiave di integrità della barriera, cioè, misure TEER in saggi di Transwell piastra. Alcuni di questi problemi possono essere superati utilizzando il modello di cervello isolato capillare che maggiormente rappresenta la barriera emato - encefalica di umano in vivo.
Capillari cerebrali isolato sono stati utilizzati per una vasta gamma di studi, tra cui la genomica, proteomica, proteomica funzionale e cellomics studi (Figura 5). Inoltre, molte tecniche e metodi esistono per analizzare i capillari cerebrali isolato all'interno di ciascuno di questi campi. In particolare, le tecniche sperimentali, illustrate nella Figura 5 possono essere utilizzate su capillari cerebrali isolati da un certo numero di fonti, compreso il tessuto umano, bovino, roditore e suino, che può facilitare la ricerca traslazionale. Per esempio, Li et al. 85 ha studiato la genomica della barriera sangue - cervello usando l'ibridazione sottrattiva di soppressione purificando mRNA isolato dai vasi capillari del cervello del ratto. Inoltre, Ott et al. 86 usato qRT-PCR e RT-PCR per studiare il regolamento della P-gp di PXR. Molti studi di proteomica utilizzano Western blotting3, Dot Blot analisi87, Western semplice analisi3,38, ELISA88,89, immunoprecipitazione3, e immunostaining3,90,91. A discernere trasportatore tratta l'endotelio cerebrale, McCaffrey et al. 92 usato frazionamento subcellulare dei capillari cerebrali isolato. Sánchez del Pino et al. 93utilizzato vescicole della membrana endoteliale bovina isolato per discernere la direzione posizione e trasporto trasportatore attraverso la barriera emato - encefalica. In altri studi di proteomica, i ricercatori hanno usato cromatografia liquida e spettrometria di massa per quantificare transporter proteine94,95,96. Studi di proteomica funzionale hanno utilizzato transporter e perdite saggi2,38. Hartz et al. 2 utilizzato zymography per determinare l'attività enzimatica nei capillari del cervello isolato. Inoltre, cellomic vasta ricerca mediante coltura cellulare ha generato numerose linee cellulari endoteliali e modelli della barriera emato - encefalica82,83,84. Con questi modelli, analisi comuni utilizzate includono migrazione saggi97,98, vitalità e tossicità saggi99e angiogenesi saggi98.
Capillari cerebrali isolato consentono accurata caratterizzazione dell'espressione della proteina e l'attività e la descrizione della segnalazione percorsi presso la barriera emato - encefalica. Ciò è dovuto, in parte, al contenuto capillare del cervello, che è solo circa l'1% (v/v). Così, usando cervello intero omogeneato o fettine di cervello come un sostituto per le cellule endoteliali capillari purificate porterà probabilmente a un povero rapporto segnale-rumore24. Inoltre, dopo l'isolamento, capillari cerebrali sono vitali per almeno 6 ore (dati non pubblicati da topo e di ratto), che consente studi di discernere specifiche vie di segnalazione. Si consiglia di includere un gruppo di controllo dalla stessa preparazione.
Modelli rappresentativi e traslazionale della barriera sangue - cervello, ad esempio il modello capillare isolato discusso in questo rapporto, sono necessari per studiare la funzione di barriera nella salute e nella malattia. Qui presentiamo un protocollo per ottenere i capillari del cervello umano isolato a una buona resa e alta qualità che può servire come un modello ex vivo della barriera sangue - cervello. Capillari isolati mantengono la loro originale struttura e funzione, che permette di utilizzarli per un certo numero di post-isolamento molecolare, biochimica e dosaggi fisiologici. Deve prestare attenzione quando Gestione tessuto umano campioni, preferibilmente in un BSL 2 o impostazione superiore.

La barriera emato - encefalica è un'interfaccia strettamente controllata tra il sangue e il cervello che determina ciò che entra ed esce dal cervello. Anatomicamente, cellule endoteliali compongono la barriera emato - encefalica e forma una complessa, continua rete capillare. Fisiologicamente, questa rete capillare fornisce il cervello con l'ossigeno e le sostanze nutrienti mentre contemporaneamente smaltimento dell'anidride carbonica e le scorie metaboliche. Cosa importante, la prova sostiene che le modifiche alla barriera contribuiscano a numerose patologie, tra cui il morbo di Alzheimer, epilessia e ictus1,2,3,4,5 , 6 , 7. cervello cellule endoteliali anche servono come una barriera al trattamento bloccando l'assorbimento del farmaco nel cervello, ad es., chemioterapia del multiforme di glioblastoma seguito tumore resezione8,9, 10. A questo proposito, i capillari del cervello umano isolato rappresentano un unico ex vivo barriera emato - encefalica modello che ricorda da vicino barriera proprietà in vivo, che consente lo studio della funzione della barriera e della disfunzione in salute e la malattia. In questo articolo, forniamo un protocollo per isolare i capillari del cervello dal cervello umano a una qualità costantemente elevata capillare e resa per studiare la barriera emato - encefalica.
Nel 1969, Siakotos et al. 11 sono stati i primi a segnalare l'isolamento dei capillari del cervello dal tessuto di cervello bovino e umano usando densità gradiente centrifugazione e vetro perlina colonna di separazione. Più tardi, Goldstein et al. 12 migliorato questo metodo aggiungendo più passaggi di filtrazione per diminuire la quantità di tessuto necessaria per studiare i capillari cerebrali isolati dai ratti, pur mantenendo l'attività metabolica di trasporto del glucosio. Da allora, i ricercatori hanno ottimizzato la procedura di isolamento capillare numerose volte, miglioramento del metodo e cervello modello capillare con ciascuna iterazione13,14,15. Ad esempio, atomo et al. 16 isolato bovina capillari tramite digestione enzimatica piuttosto che omogeneizzazione meccanica e quindi successivamente passata una sospensione capillare attraverso un filtro a rete 210 µm e una colonna di perlina di vetro. Queste modifiche migliorato la macchia di esclusione del trypan blu dei capillari cerebrali isolato e quindi, aumentato di attuabilità delle cellule endoteliali. Nel 1990, Dallaire et al. 17 isolato capillari bovini e ratto che erano chiare di un neurone contaminazione e mantenuto l'attività metabolica di γ-glutamil transpeptidasi (γ-GTase) e della fosfatasi alcalina. Nel 2000, Miller et al. 18, usato isolati del ratto e capillari cerebrali suina in combinazione con microscopia confocale per mostrare l'accumulo dei substrati di trasporto nel lumen dei vasi capillari. Successivamente, il nostro laboratorio ha continuato ad ottimizzare la procedura di isolamento capillare del cervello e abbiamo stabilito i saggi di trasporto per determinare la P-glicoproteina (P-gp)19,20,21, cancro al seno resistenza della proteina (BCRP)22,23e multi-farmaco resistenza proteina 2 (Mrp2) attività di trasporto di24 . Nel 2004, abbiamo pubblicato due relazioni dove abbiamo usato capillari cerebrali isolati del ratto per studiare varie vie di segnalazione. A Hartz et al. 21, abbiamo trovato che il peptide endotelina-1 rapidamente e reversibilmente ridotta funzione di trasporto P-gp in capillari cerebrali agendo attraverso del recettore dell'endotelina recettori B (ETB), l'ossido nitrico sintasi (NOS) e protein chinasi C (PKC). In Bauer et al. 19, abbiamo dimostrato l'espressione del recettore recettore nucleare pregnane X (PXR) e ha mostrato PXR-modulazione della funzione di espressione e di trasporto P-gp nei capillari del cervello. Negli esperimenti con i topi transgenici di PXR umanizzati, abbiamo ampliato questa linea di ricerca e ha dimostrato in vivo di serraggio della barriera di upregulating P-gp attraverso l'attivazione di hPXR25. Nel 2010, Hartz et al. 26 utilizzato questo approccio per ripristinare l'espressione della proteina P-gp e attività nei topi di proteina (hAPP) precursore dell'amiloide umana transgenici che sovraesprimono hAPP di trasporto. Inoltre, ripristino di P-gp in hAPP topi significativamente riducono di beta amiloide (Aβ)40e livelli del cervello Aβ42.
Oltre a studiare le vie di segnalazione, capillari cerebrali isolato possono essere utilizzati per determinare cambiamenti nella permeabilità capillare che ci riferiamo come perdita capillare. In particolare, l'analisi di perdita Texas Red è usata per valutare la perdita della tintura fluorescente Texas Red dal lume capillare nel tempo e questi dati vengono quindi utilizzati per analizzare i tassi di perdita. Tassi di perdita capillare aumentato rispetto a quelli da capillari di controllo indicano cambiamenti nell'integrità fisica della barriera emato - encefalica2. Questo è prezioso perché ci sono numerosi Stati di malattia connessi con rottura della barriera, ad es., epilessia, sclerosi multipla, morbo di Alzheimer e cerebrali traumatiche lesioni27,28,29, 30. Altri gruppi hanno anche utilizzato isolati capillari per discernere le vie di segnalazione che regolano l'espressione della proteina e l'attività di trasporto delle proteine31,32,33,34, 35,36,37. Infine, abbiamo continuato ad ottimizzare questo metodo per l'isolamento dei capillari del cervello umano e, recentemente, abbiamo mostrato l'espressione aumentata di P-gp umana barriera emato - encefalica nei pazienti con epilessia rispetto a individui di controllo di grippaggio-libero38 . Presi insieme, questi sviluppi dimostrano che i capillari cerebrali isolato possono servire come un modello versatile per studiare la funzione della barriera.
Vari in vivo, ex vivoe in vitro di barriera emato - encefalica modelli sono stati utilizzati nella ricerca di base e lo screening di stupefacenti industriali, principalmente con l'obiettivo della prova di consegna della droga per il cervello39,40,41 ,42,43,44. Oltre alle isolato ex vivo capillari cerebrali, attuale barriera emato - encefalica modelli includono modelli in silico , in vitro di colture cellulari di cellule endoteliali dei capillari del cervello isolato o linee cellulari immortalizzate da vari specie, coltura in vitro di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) che si differenziano in cellule endoteliali dei capillari del cervello e modelli di microfluidica su un chip.
In silico modelli sono più comunemente utilizzati nello sviluppo di farmaci per la selezione di candidati farmaci basati sul predetto assorbimento, distribuzione, metabolismo e l'escrezione (ADME) proprietà. Metodi quali modelli di relazione (QSPR) quantitative struttura-proprietà e modelli di relazione (QSAR) quantitativa struttura-attività sono metodi comuni utilizzati in high throughput screening di librerie prevedere cervello penetrazione di candidati farmaci 45 , 46. questi modelli sono utili per molecole di schermo per le proprietà di penetrazione della barriera.
Betz et al. 47 monostrati di cellule endoteliali dei capillari cerebrali coltivate, ricavandone un sistema modello in vitro della barriera emato - encefalica. In vitro modelli della coltura cellulare utilizzando tessuto fresco o linee cellulari endoteliali immortalizzate come le cellule endoteliali del microvessel cerebrale umana (hCMECs) possono essere un altro strumento di screening ad alta resa per la penetrazione di cervello o studi meccanicistici. Tuttavia, modelli di cultura delle cellule endoteliali capillari del cervello mancano la sollecitazione di taglio fisiologica del flusso sanguigno all'interno del lume capillare, sono limitate nella complessità nel complesso biologico e subiscono cambiamenti nell'espressione e localizzazione dei componenti importante barriera come le proteine di giunzione stretta, ioni, trasportatori, enzimi e recettori di superficie canali48,49,50. Al contrario, monostrati endoteliali derivati da hPSCs, hanno saccarosio bassa permeabilità rispetto alle culture hCMEC/D3 e contengono espressione polarizzata di alcuni trasportatori di barriera emato - encefalica, molecole di adesione e giunzioni strette51, 52. Tuttavia, queste cellule sono anche soggetti a modifica proprietà nella cultura, e il sistema deve essere validato per la ricapitolazione di in vivo proprietà barriera52.
Le tendenze più recenti nella barriera emato - encefalica ricerca includono utilizzando sistemi di coltura del tessuto 3D per creare capillari artificiali, utilizzando la tecnologia di organo-on-chip per generare dispositivi microfluidici, o che utilizzano la tecnologia a fibra cava53, 54 , 55. capillari artificiali, tuttavia, sono significativamente più grandi diametri (100 – 200 µm) di capillari cerebrali (3 – 7 µm). Quindi, il taglio forze in vitro non completamente simile la situazione in vivo . Questo viene affrontato in dispositivi microfluidici "blood-brain-barrier-on-a-chip", dove compartimenti di "sangue" e "cervello" di forma membrane artificiali e fluidi vengono pompati attraverso questi dispositivi che generano forze di taglio di microfluidica. Allo stesso modo, co-colture di cellule endoteliali in varie combinazioni con gli astrociti e cellule muscolari lisce vascolari sono stati anche utilizzate con la tecnologia a fibra cava per ricreare i parametri reologici presenti sotto nel vivo condizioni56 , 57 , 58. Tuttavia, non è chiaro quanto bene questo modello riflette altre proprietà della barriera sangue - cervello come trasporto, metabolismo, segnalazione e altri. Questi modelli artificiali capillare e chip sono adatti per high throughput screening di farmaci, ma le cellule utilizzate per generare questi modelli sono anche soggetti a modifiche durante la coltura.
Fette del cervello congelato e fisso o colture di cellule endoteliali capillari sono ulteriori modelli che possono essere utilizzato perlo studio del microcircolo umano5,59,60,61primario del cervello. Ad esempio, immunoistochimica del tessuto cerebrale fisso viene utilizzato per determinare la localizzazione della proteina, e l'espressione in sano rispetto al tessuto malato.
Oltre alle fettine di tessuto e i modelli in vitro capillari cerebrali di cui sopra, appena isolate possono essere utilizzati per studiare la funzione di barriera emato - encefalica. Limitazioni di questo modello capillare isolato includono la difficoltà per ottenere il tessuto cerebrale umano fresco, assenza di astrociti e neuroni e un processo relativamente lungo isolamento. Un vantaggio del modello capillare del cervello isolato è che questo modello ricorda da vicino la situazione in vivo e, pertanto, può essere utilizzato per caratterizzare la disfunzione e la funzione di barriera. Importante, può anche essere utilizzato per discernere i meccanismi di segnalazione utilizzando una moltitudine di saggi e tecniche molecolari3,19,62,63.
Il nostro laboratorio ha accesso a sia il tessuto fresco e congelato del cervello umano attraverso il centro di Sanders-Brown su invecchiamento (IRB #B15-2602-M)64. In questo contesto, le autopsie seguono un protocollo standard, cervelli sono ottenuti < 4h e tutte le procedure sono conformi alle linee guida NIH Biospecimen Best Practice65. Dato questo unico accesso al tessuto cerebrale umano, abbiamo stabilito e ottimizzato un protocollo per isolare i capillari del cervello dal tessuto di cervello umano che si traduce in un alto rendimento dei capillari del cervello umano intatto, praticabile. Due endpoint comune di interesse sono per determinare l'espressione della proteina e l'attività. A questo proposito, noi ed altri abbiamo stabilito vari saggi che possono essere utilizzati con capillari cerebrali isolato per studiare l'espressione della proteina e livelli di attività. Questi test includono Western blotting, analisi di Western semplice, analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA), reazione a catena della polimerasi d'inversione della trascrizione (RT-PCR), reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), zimografia, analisi di attività di trasporto, e saggi di perdita capillare. Queste analisi permettono ai ricercatori di studiare i cambiamenti nella funzione della barriera in condizioni patologiche umane, determinare le vie che regolano l'attività e l'espressione della proteina e identificare bersagli farmacologici per il trattamento della barriera emato - encefalica associata malattie.
Presi insieme, appena capillari cerebrali isolato possono servire come un modello affidabile e riproducibile della barriera sangue - cervello. In particolare, questo modello può essere abbinato molti diversi saggi per determinare una vasta gamma di endpoint per studiare la funzione di barriera.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Personal Protective Equipment (PPE)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>32916-636</td>
			<td>PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Protective Labcoats</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>470146-214</td>
			<td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield, disposable</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>19460102</td>
			<td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8X12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>01-815-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versi Dry Bench Paper 18&#34; x 20&#34;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>14-206-32</td>
			<td>to cover working areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Sharps Container Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>75800-272</td>
			<td>for used scalpels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz</td>
			<td>UK Supply Center, Lexington, KY, USA</td>
			<td>323775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C Refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>13-986-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accume BASIC AB15 pH Meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>AB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph RZR 2102 Control</td>
			<td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA</td>
			<td>501-21024-01-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall LEGEND XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica L2 Dissecting Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POLYTRON PT2500 Homogenizer</td>
			<td>Kinematica AG, Luzern, Switzerland</td>
			<td>9158168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale P-403</td>
			<td>Denver Instrument, Bohemia, NY, USA</td>
			<td>0191392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard mini Stir</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>1151050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA</td>
			<td>11-670-4C</td>
			<td>used to freeze the tissue?</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voyager Pro Analytical Balance</td>
			<td>OHAUS, Parsippany, NJ, USA</td>
			<td>VP214CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axiovert Microcope</td>
			<td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to check isolated capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and Glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette II Pipette 1-5mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21377823T1</td>
			<td>wash capillaries off filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette II Pipette 100-1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21377821T1</td>
			<td>resuspend pellet in BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Boy</td>
			<td>Integra, Hudson, NH, USA</td>
			<td>739658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EISCO Scalpel Blades</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>S95938C</td>
			<td>to mince brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>52858-000</td>
			<td>to cover beaker and volumetric flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21-377-304</td>
			<td>to wash capillaries off filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 ml syringe with Luer-Lok</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>BD309653</td>
			<td>used with connector ring to filter capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #4</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>10060-13</td>
			<td>used for mincing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder</td>
			<td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td>
			<td>3431E25</td>
			<td>50 ml volume, clearance: 150-230 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Homogenizer</td>
			<td>VWR, Radnor PA USA</td>
			<td>62400-642</td>
			<td>15 ml volume, clearance: 80-130 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Mesh Woven Filters (300 &#181;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA</td>
			<td>146424</td>
			<td>Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainers (pore size: 30 &#181;m)</td>
			<td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td>
			<td>43-50030-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector Ring</td>
			<td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td>
			<td>41-50000-03</td>
			<td>reuse multiple time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 l Volumetric Flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 l Beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of 1% BSA and Ficoll&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott Bottle (60 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of Ficoll&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to keep everything cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for mincing of brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Cell Scraper</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89260-222</td>
			<td>to remove supernatant after centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Fraction V, A-9647</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647-500g</td>
			<td>prepare in DPBS with Ca2+ &#38; Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Ca2+ &#38; Mg2+</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30264.FS</td>
			<td>DPBS - part of the Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll PM400</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F4375</td>
			<td>Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (D-(+) Dextrose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>71474</td>
			<td>to adjust pH of the DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Concentration: 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue

Comprendere la funzione di barriera emato - encefalica in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche è critica per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche che promettono di migliorare la fornitura di droga del cervello, migliorare la protezione del cervello e trattare il cervello disturbi. Tuttavia, studiare la funzione umana barriera emato - encefalica è impegnativo. Così, c'è un bisogno fondamentale per modelli appropriati. A questo proposito, capillari cerebrali isolati da tessuto cerebrale umano rappresentano uno strumento unico per studiare la funzione di barriera come vicino alla situazione umana in vivo come possibile. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per isolare i capillari dal tessuto di cervello umano a un alto rendimento e con purezza e qualità costante. I capillari sono isolati dal tessuto di cervello umano fresco mediante filtrazione, centrifugazione in gradiente di densità e omogeneizzazione meccanica. Dopo l'isolamento, i capillari del cervello umano possono essere utilizzati per varie applicazioni tra cui saggi di perdite, live cell imaging e le analisi basate su immunitario per studiare l'espressione della proteina e funzione, l'attività enzimatica o segnalazione intracellulare. Cervello umano isolato capillari sono un modello unico per delucidare il regolamento della funzione umana barriera emato - encefalica. Questo modello può fornire intuizioni nella patogenesi del sistema nervoso centrale (SNC), che aiuterà lo sviluppo di strategie terapeutiche per il trattamento di disordini dello SNC.

Gli isolamenti da tessuto cerebrale umano resa una sospensione arricchita nei capillari del cervello umano (Figura 1B) con piccole quantità di navi più grandi, cellule di anima rosse, altre cellule singole e alcuni detriti cellulari. Alcuni capillari sono ramificati, e, in alcuni, globuli rossi sono intrappolate in lumen capillare. Il capillare tipico ha un diametro di 3 – 7 µm ed è circa 100-200 µm lungo con lumen aperta; la maggior parte delle estremità capillare sono crollata. Usando la microscopia confocal, capillari del cervello umano isolato rivelano una struttura tubolare, intatta e morfologia. La Figura 2A Mostra che un rappresentante trasmesso luce l'immagine di un cervello umano capillare con un Pericita annesso e un globulo rosso in lumen. Tutti i risultati per quanto riguarda il diametro, dimensioni e morfologia sono in conformità con i rapporti precedenti sulla struttura del cervello isolato capillari12,17,18. Il cervello umano isolato capillare nella Figura 2B è stato immunostained per P-gp (verde) utilizzando C219 come l'anticorpo primario (1 µ g/mL); i nuclei erano controcolorati con DAPI (1 µ g/mL).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57346/57346fig1.jpg"> Figura 1: diagramma di flusso per isolamento capillare. (A), il pittogramma illustra i passaggi principali della procedura per isolare i capillari cerebrali dal tessuto umano fresco. (B), l'immagine mostra i capillari del cervello umano isolato sotto un microscopio chiaro direttamente dopo isolamento (ingrandimento 100 X). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57346/57346fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57346/57346fig2.jpg"> Figura 2: cervello umano isolato capillare. (A) A luce trasmessa immagine di un cervello umano isolato capillare. (B), il microscopio confocale immagine mostra un cervello umano isolato capillare immunostained per P-gp (verde; C219 1 µ g/mL); i nuclei erano controcolorati con DAPI (blu; 1 µ g/mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57346/57346fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57346/57346fig3.jpg"> Figura 3: risoluzione dei problemi di centrifugazione densità. Il pictogram mostra la preparazione dopo la centrifugazione in gradiente di densità. Mette in evidenza gli effetti di medio gradiente di densità troppo e troppo poco e come questo influenzi la separazione e il pellet capillare risultante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57346/57346fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57346/57346fig4.jpg"> Figura 4: espressione della proteina P-gp nei capillari del cervello umano isolato. Il Western blot mostra forti bande per P-gp (1 µ g/mL) in vasi capillari umani isolati rispetto alle cellule di hCMEC\D3. Β-actina è stato usato come un controllo di carico (1 µ g / µ l). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57346/57346fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57346/57346fig5.jpg"> Figura 5: applicazioni per i capillari del cervello umano isolato. Una panoramica delle applicazioni più comuni per capillari cerebrali isolato pubblicati nella letteratura. Capillari isolati sono stati utilizzati per: 1) genomica85,86, 2) proteomica3,38,87,88,89,90, 91,92,94,95,96, 3) proteomica funzionale2,38e 4) Cellomics82, 83,84,97,98,99. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57346/57346fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Strokes</td>
			<td>Tempo [min]</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 – 25</td>
			<td>7 – 7.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>26-50</td>
			<td>5 – 5.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>51-75</td>
			<td>5 – 5.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>76-100</td>
			<td>5 – 5.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo totale:</td>
			<td>22 – 24 min</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: protocollo di omogeneizzazione. Il protocollo di omogeneizzazione per la smerigliatrice di tessuto Potter-Chazen omogeneizzare 10 g di corteccia frontale umana ad una velocità di omogeneizzazione di 50 giri/min. Si noti che i primi tratti diversi richiedono ulteriore tempo per omogeneizzare il tessuto macinato. Dopo questo iniziale omogeneizzazione, ogni tratto è 12 s in durata (6 s per movimento verso il basso, 6 s per movimento verso l'alto). Così, dopo l'iniziale omogeneizzazione, 5 colpi possono essere realizzati in 1 min, o 25 colpi in 5 min.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problema</td>
			<td>Causa potenziale</td>
			<td>Soluzione</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Nessun Pellet capillare</td>
			<td>1) non corretta concentrazione di Ficoll</td>
			<td>1) regolare la concentrazione di Ficoll</td>
		</tr>
<tr>
<td>2) velocità di centrifugazione non corretto</td>
			<td>2) regolare la velocità di centrifugazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>3) ad un'errata velocità di accelerazione o decelerazione</td>
			<td>3) regolare la velocità di accelerazione o decelerazione</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Bassa resa capillare</td>
			<td>1) le meningi blocco passi di filtrazione</td>
			<td>1) rimuovere tutte le meningi prima della filtrazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>2) troppi capillari perditi durante la procedura di isolamento</td>
			<td>2) calcolare la concentrazione di buffer correttamente, sciacquare i puntali per pipette</td>
		</tr>
<tr>
<td>3) lavaggio capillari PluriStrainer filtri era insufficiente</td>
			<td>3) capovolgere filtri e ispezionare attentamente per capillari (uso microscopio)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4) in eccesso bolle durante resuspensions</td>
			<td>4) pipetta lentamente per evitare bolle</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Capillari non vitali</td>
			<td>1) esteso post mortem interval</td>
			<td>1) ridurre intervallo se possibile o usare il cervello congelato snap</td>
		</tr>
<tr>
<td>2) usando congelati del tessuto per l'isolamento</td>
			<td>2) utilizzare tessuto fresco</td>
		</tr>
<tr>
<td>3) tempo di procedura di isolamento troppo lungo</td>
			<td>3) ottimizzare il workflow</td>
		</tr>
<tr>
<td>4) attrezzature/buffer non sono state mantenute sul ghiaccio durante la procedura di isolamento</td>
			<td>4) mantenere attrezzature e buffer sul ghiaccio durante l'isolamento</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: risoluzione dei problemi comuni. Un elenco dei più comuni errori e problemi che si verificano durante la procedura di isolamento e di come possano essere risolti.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolamento dei capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco

Capillari cerebrali isolate da tessuto cerebrale umano possono essere utilizzati come un modello preclinico per studiare la funzione di barriera in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per isolare i capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco.

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

isolation-of-cerebral-capillaries-from-fresh-human-brain-tissue

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K Views.  University of Kentucky. Capillari cerebrali isolate da tessuto cerebrale umano possono essere utilizzati come un modello preclinico per studiare la funzione di barriera in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per isolare i capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco.

Video: Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Doppia fluorescenza In situ</emIbridazione> nelle sezioni cervello fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Ricerca

Neuroscienze

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Metodi per lo studio della morfogenesi neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elettroporazione RNAi in Embryonic Cerebral Cortex Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

Fibra ottica Impianto per la Stimolazione Optogenetic cronica del tessuto cerebrale

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF differentiates from the amniotic fluid upon closure of the anterior neural tube. CSF volume then increases over subsequent days as the neuroepithelial progenitor cells lining the ventricles and the choroid plexus generate CSF. The embryonic CSF contacts the apical, ventricular surface of the neural stem cells of the developing brain and spinal cord. CSF provides crucial fluid pressure for the expansion of the developing brain and distributes important growth promoting factors to neural progenitor cells in a temporally-specific manner. To investigate the function of the CSF, it is important to isolate pure samples of embryonic CSF without contamination from blood or the developing telencephalic tissue. Here, we describe a technique to isolate relatively pure samples of ventricular embryonic CSF that can be used for a wide range of experimental assays including mass spectrometry, protein electrophoresis, and cell and primary explant culture. We demonstrate how to dissect and culture cortical explants on porous polycarbonate membranes in order to grow developing cortical tissue with reduced volumes of media or CSF. With this method, experiments can be performed using CSF from varying ages or conditions to investigate the biological activity of the CSF proteome on target cells.

The ventricular cerebrospinal fluid (CSF) bathes the neuroepithelial and cerebral cortical progenitor cells during early brain development in the embryo. Here we describe the method developed to isolate ventricular CSF from rodent embryos of different ages in order to investigate its biological function. In addition, we demonstrate our cerebral cortical explant dissection and culture technique that allows for explant growth with minimal volumes of culture medium or CSF.

Isolamento del liquido cerebrospinale da embrioni roditori per l&#39;uso con sezionato espianti cerebrali corticali

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolamento e coltura di cellule endoteliali dal embrionali Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance blood vessels branching out from pial arteries and arterioles and diving into the brain parenchyma. Individual PA perfuse a discrete cylindrical territory of the parenchyma and the neurons contained within. These arterioles are a central player in the regulation of cerebral blood flow both globally (cerebrovascular autoregulation) and locally (functional hyperemia). PAs are part of the neurovascular unit, a structure that matches regional blood flow to metabolic activity within the brain and also includes neurons, interneurons, and astrocytes. Perfusion through PAs is directly linked to the activity of neurons in that particular territory and increases in neuronal metabolism lead to an augmentation in local perfusion caused by dilation of the feed PA. Regulation of PAs differs from that of better-characterized pial arteries. Pressure-induced vasoconstriction is greater in PAs and vasodilatory mechanisms vary. In addition, PAs do not receive extrinsic innervation from perivascular nerves &#8212; innervation is intrinsic and indirect in nature through contact with astrocytic endfeet. Thus, data regarding contractile regulation accumulated by studies using pial arteries does not directly translate to understanding PA function. Further, it remains undetermined how pathological states, such as hypertension and diabetes, affect PA structure and reactivity. This knowledge gap is in part a consequence of the technical difficulties pertaining to PA isolation and cannulation. In this manuscript we present a protocol for isolation and cannulation of rodent PAs. Further, we show examples of experiments that can be performed with these arterioles, including agonist-induced constriction and myogenic reactivity. Although the focus of this manuscript is on PA cannulation and pressure myography, isolated PAs can also be used for biochemical, biophysical, molecular, and imaging studies.

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Isolamento e Incannulazione di cerebrale parenchimale Arteriole

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific sets of sparsely distributed activated neurons called neuronal ensembles that mediate learned associations. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) has recently been optimized for adult rat brain tissue and allowed isolation of activated neurons using antibodies against the neuronal marker NeuN and Fos protein, a marker of strongly activated neurons. Until now, Fos-expressing neurons and other cell types were isolated from fresh tissue, which entailed long processing days and allowed very limited numbers of brain samples to be assessed after lengthy and complex behavioral procedures. Here we found that yields of Fos-expressing neurons and Fos mRNA from dorsal striatum were similar between freshly dissected tissue and tissue frozen at -80 &#186;C for 3 - 21 days. In addition, we confirmed the phenotype of the NeuN-positive and NeuN-negative sorted cells by assessing gene expression of neuronal (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) and microgial (Iba1) markers, which indicates that frozen tissue can also be used for FACS isolation of glial cell types. Overall, it is possible to collect, dissect and freeze brain tissue for multiple FACS sessions. This maximizes the amount of data obtained from valuable animal subjects that have often undergone long and complex behavioral procedures.

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Here we present a Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol to study molecular alterations in Fos-expressing neuronal ensembles from both fresh and frozen brain tissue. The use of frozen tissue allows FACS isolation of many brain areas over multiple sessions to maximize the use of valuable animal subjects.

Fluorescence Activated di separazione delle cellule (FACS) e Gene Expression Analisi di Fos-esprimono neuroni da freschi e congelati Rat tessuto cerebrale

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Un modello del ratto dell'ipoperfusione lieve intrauterina con stenosi Microcoil

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolamento e l'estrazione di RNA dei neuroni, macrofagi e Microglia da cervelli di Zebrafish larvale

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Ottimizzazione di Laser Capture Microdissection per l'isolamento dei gangli enterici dal tessuto umano fresco congelato

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...