Il nostro protocollo riconosce la necessità di ricapitolare meglio la barriera emato-encefalica umana in vitro per lo studio dei complessi meccanismi cellulari che influenzano il recupero post-ictus. Il nostro modello triplo mostra una robusta integrità che è in parte correlata all'ampia compartimentazione degli inserti dei pozzi, permettendoci di ridurre la frequenza di cambio ed evitare interruzioni delle popolazioni. Il nostro modello è un ottimo strumento per studiare i cambiamenti molecolari e cellulari che si verificano alla barriera emato-encefalica durante e dopo l'ictus ischemico.
Il nostro protocollo consente la scoperta di nuovi bersagli e terapie per migliorare il recupero post-ictus. Gli attuali trattamenti per l'ictus ischemico sono sensibili al tempo e di conseguenza non sono sempre efficaci. Inizia coltivando HBVP in flaconi di coltura T75 con una superficie attivata per l'adesione cellulare all'interno di un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius fino a quando non è confluente.
Una volta raggiunta la confluenza, aspirare il vecchio mezzo pericitario e lavare le cellule con cinque millilitri di PBS caldo di Dulbecco. Aspirare il PBS di Dulbecco e staccare le cellule dal pallone usando una combinazione di quattro millilitri di soluzione calda di tripsina EDTA e un millilitro di PBS di Dulbecco. Incubare il pallone per cinque minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica.
Visualizza al microscopio per confermare se le cellule sono staccate dal pallone. Aggiungere cinque millilitri di mezzo pericitario caldo contenente il 2% di FBS al pallone e trasferire le cellule staccate in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare per tre minuti a 200 g permettendo alle cellule di formare un pellet sul fondo del tubo.
Aspirare il mezzo dal tubo assicurandosi che il pellet cellulare rimanga intatto. Risospendere il pellet cellulare nel mezzo pericitario. Calcolare la quantità di mezzo in base alla confluenza delle celle e al numero di inserti necessari.
Prendi 10 microlitri delle celle risospese, mettile in un vetrino per il conteggio delle cellule e conta il numero di celle. Determinare la densità cellulare e seminare 300.000 cellule per inserto in un millilitro di mezzo pericitario sul lato abluminale degli inserti del pozzetto. Coltivare astrociti umani primari utilizzando il mezzo astrocitario contenente il 2% FBS come descritto nel manoscritto testuale.
Determinare la densità cellulare e seminare 300.000 cellule per pozzetto sul fondo delle piastre a sei pozzetti della coltura tissutale. Coprire la piastra per evitare l'evaporazione e incubare durante la notte. Allo stesso modo, coltivare HBMEC in piatti di coltura tissutale utilizzando un mezzo classico completo contenente il 10% di FBS come descritto nel manoscritto testuale.
Estrarre le piastre a sei pozzetti contenenti astrociti per coltura tissutale e gli inserti del pozzetto contenenti periciti dall'incubatore. Aspirare il mezzo astrocitario dalle piastre a sei pozzetti della coltura tissutale e aggiungere un millilitro di terreno pericitario e un millilitro di mezzo astrocitario a ciascun pozzetto. Aspirare il mezzo pericitario dagli inserti del pozzetto e inserirli nelle piastre a sei pozzetti della coltura tissutale contenenti gli astrociti seminati.
Seminare HBMEC ad una densità di 300.000 cellule per pozzetto in due millilitri di mezzo classico completo sul lato apicale degli stessi inserti del pozzetto. Lavare le cellule tre volte con il PBS di Dulbecco. Per le colture a tripla cellula sottoposte a privazione di ossigeno-glucosio, aggiungere terreno privo di glucosio sia al compartimento apicale che basolaterale.
Sostituire il terreno di coltura con colture cellulari di controllo fresche e normossiche. Posizionare le colture triple di controllo nell'incubatore ad anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Posizionare una capsula di Petri contenente 20 millilitri di acqua sterile nella camera dell'incubatore dell'ipossia per fornire un'adeguata umidificazione delle colture.
Aprire la camera rilasciando il morsetto ad anello, quindi disporre le colture cellulari sugli scaffali. Sigillare la camera fissando il morsetto ad anello. Aprire le porte di ingresso e uscita della camera e collegare il tubo dalla parte superiore del flussometro della camera.
Collegare il tubo dal fondo del flussometro al serbatoio del gas tramite un filtro dell'aria. Aprire la valvola di controllo del flusso del serbatoio ruotandola in senso antiorario per consentire il flusso minimo di gas. Aprire lentamente la valvola del regolatore di pressione ruotando in senso orario.
Lavare la camera con la miscela di gas per cinque minuti ad una portata di 20 litri al minuto. Scollegare la camera dalla fonte di gas e chiudere saldamente entrambi i morsetti di plastica bianca. Spegnere la valvola di controllo del flusso del serbatoio ruotando in senso orario.
Chiudere la valvola del regolatore di pressione ruotando in senso antiorario. Posizionare la camera di ipossia in un'incubatrice convenzionale impostata a 37 gradi Celsius per quattro ore. Posizionare lo strumento TEER sterilizzato nell'armadio di biosicurezza e collegare gli elettrodi al volt ohmmetro epiteliale.
Sterilizzare gli elettrodi in 30 millilitri di soluzione di alcol isopropilico al 70% per un minimo di 30 minuti. Accendere lo strumento TEER e impostare la funzione su ohm. Rimuovere gli elettrodi dalla soluzione di alcol isopropilico al 70% e posizionarli in 20 millilitri di PBS di Dulbecco per un minimo di 30 minuti fino a quando la lettura digitale sul dispositivo TEER legge zero ohm.
Inserire la punta lunga dell'elettrodo attraverso una delle tre aperture nell'hangar dell'inserto del pozzo bianco controllo dell'inserto abbassandolo fino a toccare il fondo del pozzetto. Assicurarsi che la punta corta sia appoggiata sopra la coltura apicale sul fondo dell'inserto del pozzo. Attendere che i valori di lettura digitale sullo strumento TEER si stabilizzino prima di registrare il valore.
Riposizionare gli elettrodi nel PBS di Dulbecco per lavarli tra una misurazione e l'altra. Continuare a raccogliere tutte le misurazioni TEER per altri due controlli di inserimento del pozzo vuoto. Raccogliere le misurazioni TEER delle piastre campione come illustrato in precedenza.
Una volta effettuate tutte le misurazioni, l'elettrodo torna nella soluzione di alcol isopropilico al 70% per 30 minuti. Quindi scollegare gli elettrodi dallo strumento TEER e lasciarli asciugare all'aria. Calcolare i valori TEER.
Aspirare il mezzo dal compartimento basolaterale e sostituirlo con due millilitri di terreno di crescita delle cellule endoteliali libere rosso fenolo nel modello di barriera emato-encefalica tripla coltura cellulare. Lavare le cellule nel compartimento apicale due volte con HBSS. Aggiungere un millilitro della soluzione di destrano FITC nel compartimento apicale e coprire la piastra con un foglio di alluminio, quindi posizionare la piastra nell'incubatore impostato a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per un'ora.
Prendi 100 microlitri di mezzo dai compartimenti basolaterali e trasferiscilo in una piastra nera da 96 pozzetti. Misurare la fluorescenza utilizzando un lettore di micropiastre con le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione impostate rispettivamente su 480 e 530 nanometri. Seme 200 microlitri di HBMEC, astrociti primari e HBVP al centro di piatti di vetro rivestiti di poli-D-lisina da 35 millimetri ad una densità di 150.000 cellule per piatto.
Prima di seminare HBMEC, rivestire il fondo dei piatti con il fattore di attacco. Lasciare che le celle si attacchino alla superficie del vetro lasciandole durante la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica. Una volta raggiunta la confluenza, scartare il terreno di coltura e aggiungere due millilitri di terreno privo di glucosio preriscaldato per la privazione di ossigeno-glucosio o mezzo normale per i controlli.
Dopo il trattamento di privazione di ossigeno-glucosio, sostituire il mezzo con il mezzo ottimizzato per l'imaging in tutti i piatti, quindi eseguire l'imaging a fluorescenza con cellule vive con il filtro GFP e l'incubatore per microscopio confocale dello stadio superiore come descritto nel manoscritto testuale. L'integrità della barriera del monostrato endoteliale nelle configurazioni indicate del modello di barriera emato-encefalica è stata valutata determinando TEER prima e dopo la privazione di ossigeno-glucosio, nonché dopo 24 ore di riossigenazione. Per quattro ore la privazione di ossigeno-glucosio ha causato una significativa diminuzione dei valori di TEER solo nella monocoltura HBMEC e nel modello di co-coltura con HBMEC e HBVP.
Questi livelli ridotti hanno raggiunto i livelli basali dopo 24 ore di riossigenazione. I valori TEER nel modello di tripla co-coltura erano significativamente più alti di quelli nei controlli di co-coltura doppia o nel controllo della monocoltura immediatamente dopo la privazione di ossigeno-glucosio. La permeabilità paracellulare dei monostrati endoteliali a 20 kilodalton di massa molecolare, FITC destrano, è risultata drasticamente aumentata nella monocoltura HBMEC e, in misura minore, nel modello di co-coltura con HBMEC e HBVP rispetto ai controlli normossici.
Inoltre, i livelli di permeabilità del destrano FITC di 20 kilodalton erano i più bassi nel modello di tripla barriera cerebrale-sangue tra tutti i modelli in condizioni di privazione normossica e ossigeno-glucosio. Non sono stati osservati cambiamenti nel flusso di destrano di 70 kilodalton, FITC attraverso i monostrati endoteliali in nessuno dei modelli. Tutti i tipi umani primari esposti alla privazione di ossigeno-glucosio hanno mostrato una forte fluorescenza verde, dimostrando che le cellule vive riprodotte erano ipossiche.
Dopo aver seminato i periciti vascolari del cervello umano sul lato abluminale degli inserti del pozzo, è molto importante coprirli con la piastra flip per prevenire l'evaporazione. Nel nostro modello utilizziamo un diametro relativamente piccolo, 0,4 micrometri, di inserti in pozzetti in poliestere che lo rendono adatto per lo screening di farmaci candidati a qualsiasi malattia che richieda l'attraversamento della barriera emato-encefalica per il trattamento. Questa tecnica offre un'eccellente opportunità per visualizzare la modifica delle proteine e dei trasportatori, se necessario.
