NEPTUNE consente il targeting e la manipolazione genetica del sistema nervoso embrionale del topo dal giorno embrionale 7.5 e consente la generazione di modelli di knockdown o lineage tracing in giorni. Questo protocollo è adattabile, flessibile e veloce. Siamo in grado di fornire librerie virali shRNA, cdRNA o codici a barre per rispondere a diverse domande in giorni anziché mesi o anni.
Ci aspettiamo che NEPTUNE fornirà approfondimenti nelle neuroscienze, ma può anche essere adattato ad altri sistemi di organi. Identificare la cavità amniotica può essere piuttosto impegnativo, quindi prenditi il tuo tempo per guardare l'immagine ecografica e magari avere un libro di testo o un'altra risorsa di anatomia a portata di mano. Per iniziare a caricare l'ago, far scorrere l'ago di vetro sullo stantuffo metallico, mantenendo la pinza attaccata ma leggermente allentata.
Quindi, spingere l'ago capillare insieme allo stantuffo metallico attraverso la guarnizione anteriore fino a raggiungere il distanziatore. Premere Svuota per spingere lo stantuffo nell'ago ed espellere l'olio dalla punta dell'ago. Quindi premere Fill per creare una bolla d'aria, dividendo l'olio e la soluzione.
Infine, abbassare l'ago, immergere la punta nella soluzione e premere nuovamente Fill per caricare l'ago. Dopo aver fissato un topo femmina anestetizzato con cavità amniotiche di dimensioni ideali sul tavolo riscaldante, applicare il gel per gli occhi su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione corneale e iniettare un antidolorifico per via sottocutanea. Quindi, sterilizzare l'addome inferiore strofinando con un panno imbevuto di 0,5 milligrammi per millilitro di soluzione di clorexidina e asciugare la pelle.
Successivamente, usando le forbici chirurgiche, eseguire un'incisione cutanea verticale mediana da 1,5 a 2 centimetri nell'addome inferiore. Quindi sollevare delicatamente la pelle e liberarla dallo strato muscolare sottostante di circa un centimetro attorno al punto di incisione per facilitare la sutura dopo l'intervento chirurgico. Quindi, fai un'incisione verticale della linea mediana di un centimetro nello strato muscolare.
Usando un paio di pinze, solleva un lato della pelle e dello strato muscolare e, con un altro paio, cerca le corna uterine. Quindi, usando una pinza, tenere il tessuto tra gli embrioni e estrarre con cura entrambe le corna uterine dall'addome. Contare e numerare gli embrioni, dall'ovaio alla cervice o dalla cervice all'ovaio, su entrambi i lati.
Successivamente, con un batuffolo di cotone umido, spingere delicatamente tutti gli embrioni nella cavità addominale, tranne i primi tre da iniettare. Quindi, posizionare una goccia di PBS su una membrana elastica incollata all'apertura centrale rotonda di una capsula di Petri modificata disponibile in commercio e tenerla immediatamente sopra gli embrioni. Inserire una pinza chiusa nell'incisione dell'elastico, quindi rilasciare la pinza per aprire l'incisione elastica, facendo cadere il liquido sugli embrioni.
Usando una pinza, tirare la sezione dell'utero corrispondente ai tre embrioni attraverso l'elastico e appollaiare delicatamente la piastra di Petri sull'addome del topo. Utilizzando quattro piedi di argilla, fissare e fissare la capsula di Petri sopra l'addome per ridurre la pressione sul topo e ridurre anche la sensibilità dell'imaging alla respirazione e al battito cardiaco del topo. Successivamente, utilizzando una pinza e un batuffolo di cotone umido, regolare l'utero e l'elastico per garantire che l'elastico sia sigillato intorno alla pelle del topo, evitando perdite di PBS.
Successivamente, per fissare l'utero, premere il cilindro di argilla modellante verso il basso a destra degli embrioni o dell'utero e aggiungere PBS alla piastra di Petri fino a quando gli embrioni e l'utero sono interamente coperti con il PBS. Per facilitare la registrazione delle iniezioni, immergere la sonda ecografica nel PBS e regolare il mouse o il tavolo chirurgico in modo che il primo embrione sia allineato con la sonda ad ultrasuoni. Scansiona tutti e tre gli embrioni e ispeziona le cavità amniotiche.
Quindi, utilizzando la macchina ad ultrasuoni, misurare il diametro della cavità amniotica per determinare il volume di iniezione appropriato. Utilizzando il controller di iniezione, impostare i volumi di iniezione determinati e la velocità di iniezione su slow, con una velocità di iniezione di 23 nanolitri al secondo. Dopo aver abbassato l'ago nel PBS, utilizzando le ruote principali sul sistema di binari, premere Svuota sul controller del nanoiniettore fino a quando il liquido raggiunge la punta dell'ago.
Quindi, sollevare l'ago dal PBS e premere Inject per verificare che venga scaricata una goccia del volume approssimativo desiderato. Abbassare nuovamente l'ago nel PBS e spostare il nanoiniettore con la ruota Y-plane sul micromanipolatore per allineare l'ago con la sonda ad ultrasuoni e l'embrione. Regolare l'angolo dell'ago con la ruota dell'angolo di iniezione per garantire un angolo di iniezione quasi perpendicolare rispetto alla parete uterina.
Quindi, utilizzando la ruota di iniezione sul micromanipolatore, inserire l'ago nella cavità amniotica con un solo movimento. Se la punta dell'ago scompare dall'immagine ecografica, spostare la sonda in avanti o indietro per riportare l'ago a fuoco. Quindi, iniettare il volume desiderato premendo Inject per il numero appropriato di volte.
Dopo aver iniettato il volume richiesto, attendere da 5 a 10 secondi prima di ritrarre l'ago con un movimento delicato. Spostare lo stadio all'embrione successivo e ripetere l'iniezione per gli altri due embrioni come dimostrato. Quindi, sollevare la sonda ad ultrasuoni e l'ago dal PBS utilizzando il micromanipolatore, allontanando l'ago dall'operatore per evitare danni e lesioni.
Usando una pinza, rimetti il primo e il secondo embrione nell'addome spingendoli delicatamente attraverso l'elastico. Quindi, afferrare delicatamente il tessuto adiacente al terzo embrione e tirare l'utero verso l'estremità superiore dell'incisione elastica. Tirare delicatamente dal quarto al sesto embrione con una pinza e lasciare che il terzo embrione rientri nell'addome.
Dopo che tutti gli embrioni con cavità amniotiche ottimali sono stati iniettati, spingere delicatamente gli embrioni e l'utero nell'addome del topo. La trasduzione riuscita della piastra neurale si traduce in embrioni con una forte espressione di un reporter fluorescente nel cervello e in altri tessuti derivati dall'ectoderma, come la pelle. L'iniezione di volumi eccessivamente elevati può causare difetti del tubo neurale, come l'encefalia.
Le iniezioni riuscite al giorno embrionale 7.5 determinano una trasduzione uniforme dal proencefalo al cervello posteriore, compreso il plesso coroideo. Le iniezioni di titoli bassi provocano la trasduzione di cloni unicellulari, mentre il virus ad alto titolo traduce quasi il 100% dell'intero cervello. Le sezioni coronali fino al giorno embrionale 13,5 embrioni hanno mostrato una trasduzione elevata e uniforme del tessuto neurale dell'occhio, del cristallino, della cornea e del mesenchima.
Dopo l'iniezione al giorno embrionale 9.5, le ghiandole salivari e i dotti si sviluppano intorno al giorno embrionale 11,5 dall'epitelio orale. L'epitelio linguale della lingua è ben trasdotto, mentre il mesenchima sottostante è negativo. Inoltre, i cluster positivi all'interno dell'epitelio linguale sono separati da sezioni negative, suggerendo la trasduzione della superficie papillare.
Le iniezioni al giorno embrionale 7.5 provocano una trasduzione diffusa del mesenchima della lingua al giorno embrionale 13.5, suggerendo che le iniezioni precoci colpiscono le cellule della cresta neurale, contribuendo al mesenchima nella lingua. Le iniezioni lentivirali portano anche a un bersaglio diffuso del sistema nervoso centrale e periferico, trasducendo sia i neuroni che i progenitori nel midollo spinale, così come i gangli della radice dorsale. Una buona preparazione è essenziale.
Assicurarsi che non vi siano perdite e che gli embrioni siano ben fissati, in modo da potersi concentrare interamente sulle iniezioni nella cavità del ratto. Dopo NEPTUNE, l'analisi può essere eseguita con vari metodi, come l'analisi immunofluorescente del cervello, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula o la nascita degli embrioni iniettati per l'analisi comportamentale.
