Ringraziamo Manon Laprise per la formazione in ecocardiografia e Ann Chamberland per scattare le foto esposte nelle figure 1 e 2. Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research Grant MOP 44363 e Canada Chair 950-216.684.

Tutte le procedure indicate in questo protocollo sono state approvate dal Comitato Animal Care IRCM. 1. Sistema a ultrasuoni e la stazione di preparazione <ol><li> Avviare il sistema di imaging ad ultrasuoni e collegare la sonda e l&#39;unità di controllo fisiologia secondo le istruzioni del produttore (Figura 1). Scegli cardiaca programma di misurazione e la sonda che corrisponde al trasduttore 30 MHz. </li><li> Riempire il revolver del la sonda con acqua deionizzata. Evitare le bolle d&#39;aria in quanto interferiscono con risoluzione di immagini. Posizionare la sonda con il lato maniglia sul suo supporto vicino alla piattaforma di imaging (Figura 1A). </li><li> Disinfettare la piattaforma di imaging e area di lavoro. </li><li> Riempire completamente la bottiglia di gel ultrasuoni per evitare la formazione di bolle e metterlo capovolto nel suo insieme contenitore preriscaldamento a 37 ° C (Figura 1B). </li><li> Verificare i livelli di ossigenogen e isoflurano e il sistema di tubi per l&#39;anestesia. Un esperimento con ~ 8 embrioni avrebbe utilizzato circa il 15-20 L di ossigeno. </li><li> Mettere le bottiglie di balsamo oftalmica, crema depilatoria e l&#39;elettrodo gel nei pressi della piattaforma di imaging (Figura 1B). </li><li> Verificare che le funzioni della lampada a raggi infrarossi il calore. Durante la formazione, impostare il livello di calore, la posizione della lampada e la distanza della lampada a topi per mantenere costante la temperatura corporea e la frequenza cardiaca. Nota: preparazione adeguata del sistema e il materiale è critica. Lunghe procedure possono influenzare le caratteristiche fisiologiche ed emodinamiche di feti più a lungo anestesia deprime la funzione cardiaca abbassando la frequenza cardiaca, la pressione sanguigna e il livello di ossigenazione del sangue. Il tempo di elaborazione per ~ 8 feti (dimensione media della cucciolata nei C57BL / 6) dovrebbe essere di circa 1 ora. Altri ceppi di topo potrebbero fornire un numero elevato di feti, possibilmente con una dimensione più grande femmina. La formazione è fondamentale per ottimizzare la Processitempo ng. </li></ol> 2. Preparazione mouse <ol><li> Anestetizzare la femmina incinta in una camera con continuo ricambio di 2% isoflurano in ossigeno (200 ml / min) fino a quando diventa nonresponsive. </li><li> Posizionare il mouse sulla piattaforma di imaging in posizione supina, regolare il tubo per inalazione continua di 1,5% isoflurano in ossigeno (200 ml / min), e fissare il tubo di inalazione con nastro (Figura 2A). Anestesia sufficienti dovrebbero essere confermati nel corso del procedimento dalla postura rilassata del mouse e l&#39;assenza di qualsiasi risposta a coda e punta pizzichi. </li><li> Luogo elettrodi gel solo in alto a sinistra e destra elettrodi inferiori (destra anteriore della gamba e zampa posteriore sinistra, chiamata anche la posizione di piombo II) per elettrocardiografia. Piombo posizione II fornisce una migliore posizione verticale positivo P-wave definito e complesso QRS per determinare la frequenza cardiaca. Fissare le quattro zampe a ogni pad con del nastro (Figura 2A). Per prevenire la secchezza degli occhi, 1 goccia dibalsamo oftalmica in ogni occhio. </li><li> Radere l&#39;addome dal torace a vescica con un tagliatore di capelli. Quindi applicare la crema depilatoria per 2 minuti e pulirli con una garza e / o tampone di cotone per rimuovere con attenzione tutti i capelli rimanenti. Fare attenzione a non tagliare i capezzoli. </li><li> Inserire il termometro prelubrificati con elettrodo gel nel retto del femminile per monitorare la temperatura corporea (dovrebbe essere mantenuto a 37 ± 0,5 ° C regolando una lampada di calore a raggi infrarossi posto sopra la piattaforma). Frequenza cardiaca dovrebbe essere di 450 ± 50 battiti / min (bpm). Sia la temperatura e la frequenza cardiaca vengono visualizzati sul controllore fisiologia (Figura 1B). Nota: anestesia lunga, perdita di capelli e gel per ultrasuoni (anche se preriscaldata) può portare a ipotermia, che può influenzare la frequenza cardiaca della femmina. Se la temperatura corporea scende sotto 36,5 ° C, fermare la procedura e modificare la posizione della lampada di riscaldamento per regolare la temperatura e la frequenza cardiaca. Attendere un paio di minuti befORE procedere di nuovo. </li></ol> 3. Embrione Identificazione <ol><li> Premere delicatamente sul ventre nudo per individuare gli embrioni. Lentamente e leggermente diffonderli ad avere la maggior parte degli embrioni in un unico strato sotto la superficie addominale. In ogni corno uterino, sacche sono linearmente collegati l&#39;uno all&#39;altro. Provate a rispettare questo ordine quando la diffusione. </li><li> Mark ogni embrione sul ventre nudo della femmina con un pennarello indelebile con la loro anteriore / posteriore e dorsale / ventrale direzioni. Conoscendo l&#39;orientamento faciliterà localizzare il cuore con la sonda. Numero degli embrioni nel giusto e corna di sinistra a partire dalla cervice (1, 2, 3 ... e 1 &#39;, 2&#39;, 3 &#39;... rispettivamente Figura 2B). Note: (i) Evitare di diffondere gli embrioni con forza eccessiva. Disegnare le loro posizioni su un pezzo di carta per tenere traccia di loro (Figura 2C). (Ii) C57BL / 6 femmine hanno ~ 8 feti per figliata. Tuttavia, 0-2 embrioni in ogni cucciolata sono lituato sotto le altre, rendendo impossibile la loro rappresentazione. Escludi questi embrioni dall&#39;analisi e valutare altre cucciolate, se necessario. </li></ol> 4. Misurazione frequenza cardiaca <ol><li> Mettere una piccola quantità di gel per ultrasuoni preriscaldata sul ventre nudo e distribuirlo in modo uniforme. Evitare la formazione di bolle. Aggiungere una maggiore quantità di gel (~ 5 ml) nell&#39;area specifica di immagine. </li><li> Tenere la sonda in contatto con lo strato di gel di spessore (10 mm) e spostare gradualmente la sonda verso la pelle mentre cerca il cuore pulsante. Una volta che il cuore pulsante è visualizzato sullo schermo, regolare l&#39;angolo della sonda di avere entrambi i ventricoli nella loro grande dimensione nel piano dell&#39;immagine (Figura 2D). </li><li> Inizia l&#39;acquisizione delle immagini. Con l&#39;avambraccio appoggiato sulla stazione, collocare il trasduttore sul gel ultrasuoni per ottenere un&#39;immagine reale sullo schermo di visualizzazione (Figura 2D). Mantenere la cresta del trasduttore sulla parte superiore e fare clic sul orientatio testina di scansionen marcatore (in alto a sinistra dell&#39;immagine) consentono il coordinamento del movimento della mano e l&#39;area visualizzata sullo schermo. </li><li> Partendo dalla cervice, spostare l&#39;embrione più vicino contrassegnato (1 o 1 &#39;nel corno uterino destra o verso sinistra) per visualizzare il cuore che batte sullo schermo. Perché profondità focale è fissa, spostare delicatamente la sonda su / giù e lateralmente senza perdere il contatto con il gel per ottenere il piano immagine desiderata. </li><li> Posizionare il cuore pulsante al centro dello schermo nella regione indicata dalla linea tratteggiata gialla che rappresenta la zona focale per una migliore acquisizione dati. </li><li> Acquisire la registrazione dal vivo. Ottenere l&#39;immagine esploratore e riprendere la registrazione (Figura 3A). Una volta ottenuto un minimo di 10 secondi di registrazione stabile, interrompere la registrazione e salvare. </li><li> Procedere alla prossima embrione. </li><li> Una volta che tutti gli embrioni vengono analizzati, premere il tasto &quot;Browse&quot; sulla tastiera per visualizzare l&#39;elenco delle registrazioni. Gioca ogni M-mode registrato tracing e di eseguire misurazioni multiple (almeno 5 per tracing) della distanza tra picchi adiacenti (ciclo tempo / flusso) per ottenere la frequenza cardiaca media (Figura 3B). Nota: Alcuni protocolli suggeriscono utilizzando un supporto stazionario per la sonda per evitare di tremare. Tuttavia, esso trattiene l&#39;angolo di analisi, rendendo l&#39;osservazione di embrioni laterali difficile. Si rallenta anche l&#39;analisi, il supporto deve essere regolata per ogni embrione. Tenendo la sonda mentre stabilirsi l&#39;avambraccio sulla stazione minimizza in modo efficiente agitazione. Allenamento con 5-10 femmine gravide si consiglia di ottimizzare il risultato. </li></ol> 5. Genotipizzazione <ol><li> Utilizzando forbici chirurgiche pulite e pinze, incidere longitudinalmente la pelle e lo strato muscolare dell&#39;addome. Individuare le sacche in ogni corno dell&#39;utero e corrispondere i numeri. Tagliare aprire il sacco vitellino per esporre l&#39;embrione nell&#39;ordine utilizzato al di sopra. Se non in una disposizione lineare, il disegno delle posizioni embrione su un pezzodi carta sarà fondamentale una volta che i segni sulla pelle non sono più visibili. </li><li> Tagliare solo ~ 4 mm di coda per la genotipizzazione del DNA genomico è molto efficiente estratto da code embrionali. Note: (i) La procedura chirurgica può essere eseguita in una posizione separata dalla camera di imaging. Tuttavia, è importante non spostare il mouse e avere la procedura chirurgica sulla piattaforma di imaging per tenere traccia degli embrioni numerate. Consultare il gestore stabulario per ottimizzare la procedura chirurgica. (Ii) La femmina incinta muore rapidamente a causa della perdita di sangue come i feti vengono rimosse per la genotipizzazione dopo imaging. Dopo il taglio della coda, i feti sono collocati 3 minuti in ghiaccio per l&#39;anestesia da ipotermia e poi decapitati con le forbici, come raccomandato dal nostro Comitato Animal Care. </li></ol>

<ol>
	<li>Hoffman, J. I., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 39, 1890-1900 (2002).</li><li>Miller, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+brain+development+in+newborns+with+congenital+heart+disease.">Abnormal brain development in newborns with congenital heart disease.</a> N. Engl. J. Med. 357, 1928-1938 (2007).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Wessels, A., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+anatomy+of+the+heart:+a+tale+of+mice+and.">Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and.</a> 15, 165-176 (2003).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ENU+induced+mutations+causing+congenital+cardiovascular+anomalies.">ENU induced mutations causing congenital cardiovascular anomalies.</a> Development. 131, 6211-6223 (2004).</li><li>Seidah, N. G., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+therapeutic+targeting+of+the+proprotein+convertases.">The biology and therapeutic targeting of the proprotein convertases.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 11, 367-383 (2012).</li><li>Roebroek, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+ventral+closure+and+axial+rotation+in+embryos+lacking+the+proprotein+convertase+Furin.">Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin.</a> Development. 125, 4863-4876 (1998).</li><li>Roebroek, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+redundancy+of+the+proprotein+convertase+furin+in+mouse+liver.">Limited redundancy of the proprotein convertase furin in mouse liver.</a> J. Biol. Chem. 279, 53442-53450 (2004).</li><li>Kisanuki, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie2-Cre+transgenic+mice:+a+new+model+for+endothelial+cell-lineage+analysis+in+vivo.">Tie2-Cre transgenic mice: a new model for endothelial cell-lineage analysis in vivo.</a> Dev. Biol. 230, 230-242 (2001).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+endothelial+furin+leads+to+cardiac+malformation+and+early+postnatal+death.">Loss of endothelial furin leads to cardiac malformation and early postnatal death.</a> Mol. Cell Biol. 32, 3382-3391 (2012).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ecocardiografia M-mode è un metodo efficace e semplice per misurare in utero frequenze cardiache di embrioni di topo. Trasduttori disponibili in commercio offrono una risoluzione sufficiente per visualizzarne i piccoli cuori pulsanti. Così, essi consentono la misurazione della frequenza cardiaca estremamente preciso, rispetto ad altri metodi quali misurazione impulsi, e possono sostituire microscopia video ad alta risoluzione. Tuttavia, gli strumenti attuali non consentono l&#39;analisi simultanea di tutti gl...

CHD è la causa infettiva più comune di morte alla nascita 1. Interventi chirurgici multipli sono spesso necessari per correggere i difetti strutturali nei soggetti la cui qualità della vita può rimanere compromessa 1. I bambini con CHD sviluppano frequentemente disturbi neurologici, anche se non hanno subito un intervento chirurgico, indicando importante in utero conseguenze sullo sviluppo 2,3. Entrambi i fattori genetici e ambientali, come l&#39;esposizione a virus o agenti chimici (alcol) durante la gravidanza, causa CHD. Studiare le contributori genetici è ancora nella sua fase iniziale, ma in rapida crescita. Per identificare questi collaboratori e comprendere il loro ruolo nello sviluppo del cuore, fenotipo topi mutanti con uno strumento semplice e potente sarà di grande beneficio. Mouse è infatti un modello animale di scelta per studiare CHD, e la maggior parte dei casi umani può essere riprodotto in topi 4,5. Di conseguenza, mouse fetale fenotipo cardiaco è diventato increasingly importante indagare l&#39;eziologia della malattia coronarica umana e richiede strumenti adeguati. Anche se gli studi istologici su campioni fissati hanno un valore inestimabile, in tempo reale immagini di animali vivi è fondamentale per comprendere la fisiologia del cuore. Microscopia Video offre immagini dal vivo. Tuttavia, richiede laparotomia per esporre embrioni, compromettendo così la loro stato fisiologico e emodinamico. Recentemente, ecocardiografia è diventata la tecnica di imaging standard per valutazioni cardiache nella clinica così come nei topi. Ecocardiografia fetale mouse viene condotta utilizzando sistemi standard ultrasuoni clinici, nonché sistemi ad ultrasuoni ad altissima frequenza. Questi ultimi prevedono 30 MHz o trasduttori di frequenza superiore che generano immagini bidimensionali e permettono di valutare gli stadi embrionali precoci. Questi trasduttori hanno una profondità relativamente scarsa penetrazione (~ 13 mm), che è tuttavia sufficiente avere piani d&#39;immagine adeguate e determinare pa cuore fondamentaleparametri, come la frequenza cardiaca, diametro interno del ventricolo sinistro e destro in diastole e sistole e setto e lo spessore della parete, senza eseguire laparotomia. Nel nostro studio, abbiamo utilizzato un sistema ad ultrasuoni ad altissima frequenza per valutare le frequenze cardiache di embrioni di topo al giorno E18.5 embrionale. Abbiamo scelto un trasduttore 30 MHz che fornisce un campo visivo di 20 mm x 20 mm, l&#39;ideale date le dimensioni dei feti, con una lunghezza focale di 12,7 mm. Tuttavia, un trasduttore frequenza più elevata può essere scelto per analizzare stadi precoci di sviluppo. L&#39;M-mode selezionata permette la visualizzazione dei tessuti in movimento grazie ad una risoluzione temporale massimo di 1.000 fotogrammi / sec. La procedura completa è semplice e deve essere effettuata il più rapidamente possibile per evitare qualsiasi perturbazione degli stati fisiologici ed emodinamiche del feto. L&#39;analisi di circa 8 embrioni richiede circa 1 ora.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="591">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:164px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:160px;">Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td style="width:104px;">CP0406v2</td>
			<td style="width:163px;">1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ultrasound gel</td>
			<td>Parker Laboratories Inc.</td>
			<td>Aquasonic Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Electrode gel</td>
			<td>Parker Laboratories Inc.</td>
			<td>Spectra 360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ophthalmic gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>Tear-Gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Depilatory cream</td>
			<td>Church &#38; Dwight Co., Inc.</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Hair clipper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gauze/cotton swap</td>
			<td>Q-tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Permanent marker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:164px;">High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System</td>
			<td style="width:160px;">Visual Sonics</td>
			<td style="width:104px;">Vevo770</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">30 MHz Transducer</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>RMV707B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:164px;">Imaging platform and physiology controller unit</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Anesthetic System</td>
			<td>Cyprane North America Inc.</td>
			<td>312462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Infrared heating lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in utero measurement of heart rate in mouse by noninvasive m-mode echocardiography

Cardiopatie congenite (CHD) è la causa infettiva più frequente di morte alla nascita. L&#39;incidenza di CHD va 4-50 / 1, 000 nascite (Malattia e stime regionali lesioni, Organizzazione Mondiale della Sanità, 2004). Ambulatori che spesso compromettono la qualità della vita sono necessari per correggere i difetti cardiaci, ricordandoci l&#39;importanza di trovare le cause di CHD. Modelli di topo mutante e tecnologia di imaging dal vivo sono diventati strumenti essenziali per studiare l&#39;eziologia di questa malattia. Anche se i metodi avanzati permettono l&#39;imaging dal vivo di cuori anomali negli embrioni, gli stati fisiologici e emodinamici di quest&#39;ultimo sono spesso compromesse a causa di procedure chirurgiche e / o lunghi. Noninvasive immagini ecografiche, tuttavia, può essere utilizzato senza chirurgicamente esporre gli embrioni, mantenendo quindi la loro fisiologia. Qui, usiamo semplice ecografia M-mode per valutare le frequenze cardiache di embrioni a E18.5 in utero. La rilevazione dei tassi anormali del cuore è davvero un buon indicatoretor di disfunzione del cuore e, quindi, costituisce un primo passo verso l&#39;identificazione di difetti di sviluppo che possono portare a insufficienza cardiaca.

Il suddetto metodo è stato usato per valutare l&#39;impatto della presenza o assenza della furina serina proteasi in cellule endoteliali su frequenze cardiache di embrioni di topo a E18.5 in utero. Furin appartiene alla famiglia delle convertasi proprotein (PC) che i precursori delle proteine ​​fendere dopo residui basici. Furin e suoi substrati sono proteine ​​secretorie e scissione possono verificarsi nel Golgi, endosomi o sulla superficie cellulare. Substrati chiave di furin includono TGFb, e fattor...

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In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Ultra-ultrasuoni ad alta frequenza è un potente strumento di imaging dal vivo per esaminare anomalie cardiache nei piccoli animali. La sua invasività consente di mantenere lo stato fisiologico di embrioni. Qui, vi mostriamo l&#39;uso di M-mode ultrasuoni per misurare le frequenze cardiache di embrioni a E18.5 in utero.

In utero Misurazione della frequenza cardiaca in mouse da non invasiva ecocardiografia M-mode

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

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Medicine

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

11.3K Views.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal.  Ultra-ultrasuoni ad alta frequenza è un potente strumento di imaging dal vivo per esaminare anomalie cardiache nei piccoli animali. La sua invasività consente di mantenere lo stato fisiologico di embrioni. Qui, vi mostriamo l'uso di M-mode ultrasuoni per misurare le frequenze cardiache di embrioni a E18.5 in utero. 

Video: In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Transthoracic Echocardiography in Mice

In recent years, murine models have become the primary avenue for studying the molecular mechanisms of cardiac dysfunction resulting from changes in gene expression. Transgenic and gene targeting methods can be used to generate mice with altered cardiac size and function,1-3 and as a result, in vivo techniques are needed to evaluate their cardiac phenotype. Transthoracic echocardiography, pulse wave Doppler (PWD), and tissue Doppler imaging (TDI) can be used to provide dimensional measurements of the mouse heart and to quantify the degree of cardiac systolic and diastolic performance. Two-dimensional imaging is used to detect abnormal anatomy or movements of the left ventricle, whereas M-mode echo is used for quantification of cardiac dimensions and contractility.4,5 In addition, PWD is used to quantify localized velocity of turbulent flow,6 whereas TDI is used to measure the velocity of myocardial motion.7 Thus, transthoracic echocardiography offers a comprehensive method for the noninvasive evaluation of cardiac function in mice.

Transthoracic echocardiography offers a noninvasive method for the evaluation of cardiac function in mice. A combination of ultrasound and Doppler imaging modalities can be used to obtain dimensional measurements of the heart and intracardiac blood flow, which together provide an assessment of cardiac systolic and diastolic performance.

L&#39;ecocardiografia transtoracica in topi

In recent years, murine models have become the primary avenue for studying the molecular mechanisms of cardiac dysfunction resulting from changes in gene ...

Ricerca

Medicina

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Un modello murino di Nell&#39;utero Trapianto

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

Valutazione del ventricolo destro Struttura e funzione in modello murino di polmonare Arteria Costrizione da ecocardiografia transtoracica

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events of myocardial injuries, various mouse models of myocarditis have been widely used. This study involved experimental autoimmune myocarditis (EAM) induced with cardiac myosin heavy chain (Myhc)-&#945; 334-352 in A/J mice; the affected animals develop lymphocytic myocarditis but with no apparent clinical signs. In this model, the utility of magnetic resonance microscopy (MRM) as a non-invasive modality to determine the cardiac structural and functional changes in animals immunized with Myhc-&#945; 334-352 is shown. EAM and healthy mice were imaged using a 9.4 T (400 MHz) 89 mm vertical core bore scanner equipped with a 4 cm millipede radio-frequency imaging probe and 100 G/cm triple axis gradients. Cardiac images were acquired from anesthetized animals using a gradient-echo-based cine pulse sequence, and the animals were monitored by respiration and pulse oximetry. The analysis revealed an increase in the thickness of the ventricular wall in EAM mice, with a corresponding decrease in the interior diameter of ventricles, when compared with healthy mice. The data suggest that morphological and functional changes in the inflamed hearts can be non-invasively monitored by MRM in live animals. In conclusion, MRM offers an advantage of assessing the progression and regression of myocardial injuries in diseases caused by infectious agents, as well as response to therapies.

This study demonstrates the successful establishment of magnetic resonance microscopy imaging as a non-invasive tool to assess the cardiac abnormalities in mice affected with autoimmune myocarditis. The data indicate that the technique can be used to monitor the disease-progression in live animals.

La valutazione non invasiva della Cardiac Anomalie in Experimental Autoimmune miocardite da Risonanza Magnetica Imaging Microscopy nel mouse

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular (LV) filling compared with a continuous linear jet. Vortex ring development is most often quantified with vortex formation time (VFT), a dimensionless parameter based on fluid ejection from a rigid tube. Our group is interested in factors that affect LV filling efficiency during cardiac surgery. In this report, we describe how to use standard two-dimensional (2D) and Doppler transesophageal echocardiography (TEE) to noninvasively derive the variables needed to calculate VFT. We calculate atrial filling fraction (&#946;) from velocity-time integrals of trans-mitral early LV filling and atrial systole blood flow velocity waveforms measured in the mid-esophageal four-chamber TEE view. Stroke volume (SV) is calculated as the product of the diameter of the LV outflow track measured in the mid-esophageal long axis TEE view and the velocity-time integral of blood flow through the outflow track determined in the deep transgastric view using pulse-wave Doppler. Finally, mitral valve diameter (D) is determined as the average of major and minor axis lengths measured in orthogonal mid-esophageal bicommissural and long axis imaging planes, respectively. VFT is then calculated as 4 &#215; (1-&#946;) &#215; SV/(&#960;D3). We have used this technique to analyze VFT in several groups of patients with differing cardiac abnormalities. We discuss our application of this technique and its potential limitations and also review our results to date. Noninvasive measurement of VFT using TEE is straightforward in anesthetized patients undergoing cardiac surgery. The technique may allow cardiac anesthesiologists and surgeons to assess the impact of pathological conditions and surgical interventions on LV filling efficiency in real time.

We describe a protocol to measure vortex formation time, an index of left ventricular filling efficiency, using standard transesophageal echocardiography techniques in patients undergoing cardiac surgery. We apply this technique to analyze vortex formation time in several groups of patients with differing cardiac pathologies.

Determinazione non invasiva del vortice formazione tempo usando l'ecocardiografia Transesophageal durante l'ambulatorio cardiaco

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Transdermico misurazione del tasso di filtrazione glomerulare in topi

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Noninvasive Electrocardiography in the Perinatal Mouse

Electrocardiography (ECG) has long been relied upon as an effective and reliable method of assessing cardiovascular (and cardiopulmonary) function in both human and animal models of disease. Individual heart rate, rhythm, and regularity, combined with quantitative parameters collected from ECG, serve to assess the integrity of the cardiac conduction system as well as the integrated physiology of the cardiac cycle. This article provides a comprehensive description of the methods and techniques used to perform a noninvasive ECG on perinatal and neonatal mouse pups as early as the first postnatal day, without requiring the use of anesthetics. This protocol was designed to directly address a need for a standardized and repeatable method for obtaining ECG in newborn mice. From a translational perspective, this protocol proves to be entirely effective for characterization of congenital cardiopulmonary defects generated using transgenic mouse lines, and particularly for analysis of defects causing lethality at or during the first postnatal days. This protocol also aims to directly address a gap in the scientific literature to characterize and provide normative data associated with maturation of the early postnatal cardiac conduction system. This method is not limited to a specific postnatal timepoint, but rather allows for ECG data collection in neonatal mouse pups from birth to postnatal day 10 (P10), a window that is of critical importance for modeling human diseases in vivo, with particular emphasis on congenital heart disease (CHD).

Here, we present a noninvasive electrocardiography (ECG) protocol, optimized for early postnatal mice, that does not require the use of anesthetics.

Elettrocardiografia non invasiva nel topo perinatale

Electrocardiography (ECG) has long been relied upon as an effective and reliable method of assessing cardiovascular (and cardiopulmonary) function in both ...

Morphological and Functional Assessment of the Right Ventricle Using 3D Echocardiography

Traditionally, it was believed that the right side of the heart has a minor role in circulation; however, more and more data suggest that right ventricular (RV) function has strong diagnostic and prognostic power in various cardiovascular disorders. Due to its complex morphology and function, assessment of the RV by conventional two-dimensional echocardiography is limited: the everyday clinical practice usually relies on simple linear dimensions and functional measures. Three-dimensional (3D) echocardiography overcame these limitations by providing volumetric quantification of the RV free of geometrical assumptions. Here, we offer a step-by-step guide to obtain and analyze 3D echocardiographic data of the RV using the leading commercially available software. We will quantify 3D RV volumes and ejection fraction. Several technical aspects may help to improve the quality of RV acquisition and analysis as well, which we present in a practical manner. We review the current opportunities and the limiting factors of this method and also highlight the potential applications of 3D RV assessment in current clinical practice.

Here, we provide a step-by-step acquisition and analysis protocol for the 3D volumetric assessment of the right ventricle, mainly focusing on the practical aspects that maximize the feasibility of this technique.

Valutazione morfologica e funzionale del ventricolo destro mediante ecocardiografia 3D

Traditionally, it was believed that the right side of the heart has a minor role in circulation; however, more and more data suggest that right ...

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion pressure. However, it is difficult to monitor the dynamic changes of the coronary arterioles and the capillaries in the whole heart, primarily due to its motion and non-stop beating. Here we describe a method that enables monitoring of arterial perfusion rate, pressure and the diameter changes of the arterioles and capillaries in mouse right ventricular papillary muscles. The mouse septal artery is cannulated and perfused at a constant flow or pressure with the other dynamically measured. After perfusion with a fluorescently labeled lectin (e.g., Alexa Fluor-488 or -633 labeled Wheat-Germ Agglutinin, WGA), the arterioles and capillaries (and other vessels) in right ventricle papillary muscle and septum could be readily imaged. The vessel-diameter changes could then be measured in the presence or absence of heart contractions. When genetically encoded fluorescent proteins were expressed, specific features could be monitored. For examples, pericytes were visualized in mouse hearts that expressed NG2-DsRed. This method has provided a useful platform to study the physiological functions of capillary pericytes in heart. It is also suitable for studying the effect of reagents on the blood flow in heart by measuring the vascular/capillary diameter and the arterial luminal pressure simultaneously. This preparation, combined with a state-of-the-art optic imaging system, allows one to study the blood flow and its control at cellular and molecular level in the heart under near-physiological conditions.

Presented here is a protocol to study the coronary microcirculation in living murine heart tissue by ex vivo monitoring of the arterial perfusion pressure and flow that maintains the pressure, as well as vascular tree components including the capillary beds and pericytes, as the septal artery is cannulated and pressurized.

Misurazione dinamica e imaging di capillari, arterioli e periciti nel cuore del topo

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

Measurement of Heart Contractility in Isolated Adult Human Primary Cardiomyocytes

The evaluation of changes in heart contractility is essential during preclinical development for new cardiac- and non-cardiac-targeted compounds. This paper describes a protocol for assessing changes in contractility in adult human primary ventricular cardiomyocytes utilizing the MyoBLAZER, a non-invasive optical method that preserves the normal physiology and pharmacology of the cells. This optical recording method continuously measures contractility transients from multiple cells in parallel, providing both medium-throughput and valuable information for each individual cell in the field of view, enabling the real-time tracking of drug effects. The cardiomyocyte contractions are induced by paced electrical field stimulation, and the acquired bright field images are fed to an image-processing software that measures the sarcomere shortening across multiple cardiomyocytes. This method rapidly generates different endpoints related to the kinetics of contraction and relaxation phases, and the resulting data can then be interpreted in relation to different concentrations of a test article. This method is also employed in the late stages of preclinical development to perform follow-up mechanistic studies to support ongoing clinical studies. Thus, the adult human primary cardiomyocyte-based model combined with the optical system for continuous contractility monitoring has the potential to contribute to a new era of in vitro cardiac data translatability in preclinical medical therapy development.

This protocol describes how to measure contractility in adult human primary cardiomyocytes from donor hearts with the MyoBLAZER system, a reliable platform for assessing drug-induced changes in contractility during preclinical development.

Misurazione della contrattilità cardiaca in cardiomiociti primari umani adulti isolati

The evaluation of changes in heart contractility is essential during preclinical development for new cardiac- and non-cardiac-targeted compounds. This ...