Gli autori ringraziano Gilbert verde per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal NIAMS / NIH (R01-AR060484) e DOD (W81XWH-12-1-0555) assegnato a SMY, e dal NIH (U24 CA92871 e U54 CA151838) attribuiti a MGP

Tutti gli studi su animali sono state realizzate in conformità con le disposizioni della cura degli animali e del Comitato Usa Johns Hopkins. 1. Near Infrared (NIR) imaging di fluorescenza di collagene rimodellamento scheletrico in vivo <ol><li> Photo-attivazione della iniezione vena CMP e la coda in gabbia <ol><li> Preparare 110 ml di soluzione di CMP gabbia per ciascun topo (20-30 g peso mouse): 100 ml di soluzione per il dosaggio, con un ulteriore 10 microlitri cuscino per la possibile perdita durante il trasferimento e l&#39;iniezione. Mescolare 11 ml di IR680-Ahx-NB (GPO) 9 soluzione madre (400 micron) con 11 ml di 100 mM cisteina in soluzione PBS sterile, quindi portare il volume complessivo a 110 ml con tampone 1x PBS. La soluzione peptide finale contiene 4 nmol di IR680-Ahx-NB (GPO) 9 e 1 nmol di cisteina in 100 ml di soluzione di 1x PBS. </li><li> Lentamente prelievi dagliw la soluzione peptide in una siringa da insulina 0,5 ml con una canna trasparente e un piccolo calibro (28-30 G) dell&#39;ago, e con attenzione rimuovere le bolle d&#39;aria. Accendere la lampada UV per permettere alla lampada di riscaldare per 2-5 min. </li><li> Posizionare la siringa-peptide contenente direttamente sotto la lampada UV (365 nm,&gt; 25 mW / cm 2) per 5 minuti per consentire fotoattivazione. </li><li> Nel frattempo, posizionare il mouse in un restrainer sotto una lampada riscaldata, etichettare il mouse con un pennarello indelebile sulla coda o altri metodi di identificazione come marchio auricolare o la punta del tatuaggio, e disinfettare la coda con il 70% di alcol. </li><li> Subito dopo l&#39;attivazione UV, iniettare 100 pl di-UV attivata IR680-Ahx-NB (GPO) 9 soluzione nella vena della coda, preferenzialmente nella parte posteriore della coda. Posizionare il mouse torna alla gabbia dopo l&#39;iniezione. </li></ol></li><li> NIR imaging di fluorescenza di attività rimodellamento del collagene <ol><li> Setla conca del letto di imaging della termocamera impulso a 37 ° C utilizzando Pearl Impulse software 2.0. </li><li> Ponga il mouse nude o rasati nella camera di induzione dell&#39;anestesia contenente il 2% isoflurano in ossigeno. Verificare la profondità di anestesia piano dalla mancanza di movimento del mouse durante la manipolazione e monitorando la frequenza delle respirazioni (~ 1/sec). </li><li> Dopo che il mouse è anestetizzato, aprire il cassetto Pearl imager, e mettere l&#39;animale sul letto di imaging. Rimuovere rapidamente la spina cono, e far scorrere il muso del mouse all&#39;interno del cono di tenere il mouse in anestesia (dal 2% isoflurano in ossigeno erogato a 2 L / min attraverso il cono naso) durante il processo di imaging. Una volta che il mouse è a posto, chiudere il cassetto. </li><li> Quando lo strumento indica &quot;ready&quot; sul pannello software di immagine, fare clic su &quot;canale 700&quot;, &quot;luce bianca&quot; e &quot;85 micron&quot; scatole seguito dal tasto &quot;Acquisisci immagine&quot;. NIR (eccitazione 685 nm, emissione 720 nm), und foto a luce bianca saranno poi scattate con messa a fuoco automatica e l&#39;esposizione. </li><li> Quando la registrazione è completata, aprire il cassetto, girare il mouse e acquisire immagini da un&#39;altra angolazione. Il mouse può essere posizionato con la sua parte anteriore (ventrale), posteriore (dorsale) o lati di fronte alla telecamera. Strette strisce di nastro possono essere utilizzati come sistemi di ritenuta per allungare gli arti per ottenere la migliore vista sulla regione di interesse (ad esempio gabbia toracica, caviglie e polsi). </li><li> Un momento giusto per osservare la captazione scheletrica di IR680-CMP è compresa tra 24-96 ore dopo l&#39;iniezione (HPI), sulla base del dosaggio (~ 4 nmol / mouse). Per acquisire immagini ad alta risoluzione, sacrificare il mouse per dislocazione cervicale mentre sotto anestesia profonda dopo 72 hpi, togliere la pelle (e capelli) con pinze e forbici chirurgiche, e immagine dal NIR fluorescenza come descritto sopra. </li><li> Analizzare le immagini di fluorescenza NIR acquisite. </li></ol></li></ol> 2. Visualizzazione di Collageni in ex vivoSezioni di tessuto; 0 <ol><li> Preparazione del materiale <ol><li> Preparare 1 ml di 10% (w / v) di BSA in acqua deionizzata. Scongelare 1 ml di siero di capra in un bagno d&#39;acqua a temperatura ambiente. Tagliare alcuni pezzi di Parafilm delle dimensioni di circa 2 cm x 5 cm. </li><li> Preparare 10 ml di tampone di bloccaggio miscelando 500 ml di siero di capra, 1 ml di PBS 10x e 8,5 ml di acqua deionizzata. Preparare 5 ml di tampone di diluizione CMP diluendo 50 ml di 10% (w / v) BSA con 4,45 ml di acqua deionizzata e 500 microlitri di PBS 10x. </li><li> Diluire le soluzioni stock di carbossifluoresceina marcato gabbia CMP, CF NB (GPO) 9 (480 micron), a 5 micron utilizzando il tampone di diluizione CMP. Concentrazione ottimale CMP varia 2,5-30 mM, a seconda del tipo di tessuto e la natura di campioni di tessuto. Un volume di 100 microlitri è raccomandato per la colorazione una sezione di tessuto diapositiva. Conservare il solut CMP formulatoioni nel buio. </li><li> Lasciate il mouse scorre tessuto cornea portare a temperatura ambiente. Incubare i vetrini in tampone PBS 1x per 5 min. I tessuti cornea topo utilizzati in questa dimostrazione sono stati prefissati con 4% paraformaldeide in PBS per 1 ora, crioconservati in Tissue-Tek Ottobre medio, cryosectioned a 8 um di spessore, e montati su vetrini praticati. </li></ol></li><li> Colorazione tissutale e di imaging <ol><li> Porre i vetrini in una camera umidificata. Per ciascun vetrino, applicano 0,5 ml di soluzione di blocco e incubare i vetrini per 30 min a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di saturazione tamponando i vetrini su un tovagliolo di carta. </li><li> Applicare circa 100 ml di CF NB (GPO) 9 soluzioni per coprire le sezioni di tessuto di ogni diapositiva. Incubare i vetrini per 2 minuti per consentire alla soluzione CMP di permeare i tessuti. </li><li> Accendere la lampada UV. Quando la lampada è riscaldato, esporre il tessuto CMP coperto seZIONI alla luce UV per 6 minuti (365 nm, ~ 8 mW / cm 2) per deproteggere i CMP gabbia. Dopo l&#39;esposizione ai raggi UV, coprire le sezioni di tessuto di ogni diapositiva con un pezzo di Parafilm per evitare l&#39;essiccazione. Porre i vetrini nella camera umida e incubare a 4 ° C per 2 ore. </li><li> Preparare una diluizione 1:3,000 di soluzione DAPI in 1x PBS. Dopo CMP colorazione, rimuovere delicatamente il Parafilm con una pinza, e asciugare le diapositive su un tovagliolo di carta per rimuovere la soluzione in eccesso CMP. Applicare circa 100 ml di soluzione DAPI diluito per ciascun vetrino tessuto e incubare per 1 min a temperatura ambiente. </li><li> Dopo la colorazione, immergere i vetrini in tampone PBS 1x in una vaschetta di colorazione per 5 min. Ripetere questa 3x in fresco 1x PBS per lavare agenti macchianti non associati. </li><li> Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio sulla sezione di tessuto e coprire con una scivolata copertura in vetro, evitando bolle d&#39;aria. Mettere i vetrini in un vassoio diapositiva di cartone per proteggerli dalla luce. </li><li>Immagine i fili di collagene (canale FITC) e nuclei cellulari (canale DAPI) nei vetrini di tessuto con un microscopio a fluorescenza. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Come si può vedere in questo protocollo, la consegna di CMP è semplice poiché la UV-attivazione dei CMP gabbia è l&#39;unico passaggio aggiuntivo alla coda comune protocolli di iniezione vena 19. La chiave è quello di iniettare le sonde peptide in uno stato a singolo filamento Uncaged e metastabile. Il gruppo gabbia impedisce CMP di auto-assemblaggio e vincolante di collagene (Figura 2b) fino a quando non viene rimosso dalla luce UV a questo punto il CMP inizia a piegare in tripla elica. La formulazione iniettabile contiene cisteina, che può reagire rapidamente con il gruppo gabbia spaccati durante l&#39;irradiazione UV per minimizzare la tossicità. Numerosi topi con ceppi diversi (ad esempio SKH-1 e DR-1) sono stati testati utilizzando questa formulazione, e non abbiamo rilevare eventuali difetti di salute comportamentali o di altri in questi topi fino a sei mesi. Se l&#39;iniezione non segue immediatamente dopo l&#39;esposizione ai raggi UV, i CMP si piega in triple eliche omotrimerica, che non hanno capacità di ibridazione. Figura 2C mostra un caso estremo in cui prima dell&#39;iniezione i CMP sono stati completamente riassemblati in triple eliche da tempo di ritardo lungo (&gt; 2 giorni). Per aggirare questo problema, la soluzione CMP deve essere preparato in concentrazione relativamente bassa (ad es ~ 40 micron), e iniettato in topi subito dopo UV-decaging. A causa della ridotta velocità tripla elica piegatura delle CMP in condizioni diluite (primo tempo di ripiegamento:&gt; 50 min) e la breve esposizione UV e il tempo di iniezione (5 ~ 7 min totale), la maggior parte dei CMP entrano nel flusso ematico in single- strand forma quando questo protocollo è seguita. Una volta iniettato, CMP dovrebbero rimanere come singoli trefoli, come la concentrazione viene ridotta di un fattore 20 nel pool sanguigna, con conseguente drastica riduzione del tasso rimontaggio 18. Se l&#39;iniezione è in ritardo (ad esempio per la movimentazione degli animali) e ripiegamento omotrimerica si sospetta, i peptidi parzialmente assemblati possono essere riattivati ​​dal riscaldamento sopra 7076; C dissociare i CMP di filamenti singoli, seguiti da rapido raffreddamento e di iniezione. Anche se meno conveniente, tali CMP-calore dissociata anche mostrare risultati attesi in vivo di targeting (Figura 2D). In questa dimostrazione, topi nudi sono stati usati per NIR fluorescenza perché fino al 50% del segnale NIR può essere bloccato da capelli. Quando si lavora con modelli murini pelo (soprattutto quelli con i capelli neri), si consiglia la rasatura il mouse nella regione di interesse prima di imaging con un rasoio elettrico o di rimozione dei capelli. In figura 1, vi sono segnali falsi positivi regione addominale dell&#39;animale, che è causata da auto-fluorescenza delle clorofille nella dieta animale. Tali segnali di fondo possono essere significativamente ridotte passando il mouse per diete purificate circa 4 giorni prima di imaging. Come visto nelle figure 1 e 2A, vi sono forti assorbimenti CMP nello spin codae. Pertanto, per evitare artefatti derivanti da iniezioni coda vena imperfetti, si consiglia di iniettare nella parte posteriore della coda in modo che il sito di iniezione non viene catturata l&#39;immagine in fluorescenza. Il CMP etichettato consente di targeting e di imaging di luoghi specifici di rimodellamento del collagene in vivo che sono difficili da rilevare con altri metodi. Per esempio, i saggi di sangue ed urine basati ELISA sono sensibili per frammenti collagene telopeptide spaccati, ma il metodo non possono localizzare la fonte del turnover del collagene, perché riguarda antigeni solubili. Le principali limitazioni della tecnica di imaging in vivo utilizzando NIR etichettati CMP sono attenuazione della profondità di penetrazione e tempra da prossimali pooled globuli rossi come emoglobina è un quencher endogena di 680/710 nm coloranti NIR. Le future applicazioni di CMP di imaging in vivo comprendono SPECT o PET di imaging utilizzando CMP marcati con radionuclidi gamma emittenti diretti o con positroni emitters, per la diagnosi di patologie che coinvolgono il rimodellamento del collagene (ad esempio, l&#39;osteoporosi, l&#39;artrite, l&#39;aterosclerosi, e fibrosi). Questi CMP analoghi radio-marcati eliminerà le limitazioni della perdita di segnale dovuta alla profondità dei tessuti e la presenza di globuli rossi pool, e consentiranno misurazioni quantitative dei tessuti malati. Inoltre, il tempo di imaging relativamente tardi (ad esempio 48-96 HPI) derivanti dalla lenta liquidazione vincolante e di CMP potrebbe rendere difficile seguire rapidi cambiamenti nel rimodellamento del collagene. Tale limitazione può essere superata con una ulteriore ingegnerizzazione delle cinetiche di legame e l&#39;affinità di agenti di imaging CMP. Poiché CMP si lega al collagene denaturate che hanno poca struttura, imaging a base di collagene-CMP è complementare alla seconda microscopia generazione di armoniche che può solo fibre di collagene immagine 5. Quando la colorazione di sezioni di tessuto con contrassegnati in modo fluorescente CMP, abbiamo trovato vantaggioso per incubare l&#39;campioni nelle soluzioni peptide-UV attivato a 4 ° C, perché l&#39;ibridazione a tripla elica è facilitata a temperatura inferiore a 1,20. Si è anche scoperto che immergendo i vetrini in PBS fresco in un barattolo di colorazione è il modo più efficace per lavare i CMP non associati, che funziona molto meglio che limitarsi a pipettaggio tamponi di lavaggio sui campioni. L&#39;ibridazione CMP-collagene filamento è molto preciso e robusto, per cui il semplice protocollo di colorazione presentata in questo video può essere facilmente modificato per costaining biomarcatori supplementari, e per identificare collagene degradati in sezioni di tessuto non fissati. Questo è un efficace e conveniente alternativa all&#39;utilizzo di anticorpi anti-collagene per rilevare collageni fibrosi in vari campioni istologici.

Il collagene, la proteina più abbondante nel mammifero, gioca un ruolo fondamentale nello sviluppo dei tessuti e la rigenerazione sostenendo proliferazione e differenziazione delle cellule. Mentre collageni fibrosi (ad esempio di tipo I, II), nei tessuti connettivi dare resistenza meccanica ai tessuti, il collagene reticolare (tipo IV) formano impalcatura di base della membrana basale in cui le cellule si attaccano e formano tessuti organizzati. Rimodellamento del collagene coinvolge sia degradazione del collagene (da proteasi) e sintesi (promosso da fattori di crescita). Sebbene rimodellamento del collagene, per esempio in osso, fa parte del normale processo di rinnovamento dei tessuti, l&#39;attività rimodellamento eccesso, o la sua presenza in posizioni anomale, indica tipicamente cicatrizzanti risposta ad un trauma o patologie croniche come il cancro, l&#39;osteoporosi, l&#39;artrite, e fibrosi 1-4. La capacità di collageni immagine direttamente in fase di rimodellamento in vivo potrebbe portare alla comprensione dei progressiione di queste malattie, così come nuovi strumenti diagnostici e terapie. Ad esempio, l&#39;imaging dal vivo in grado di fornire informazioni sulla gravità e la posizione delle malattie, e può anche essere utilizzato per valutare l&#39;efficacia di nuovi agenti terapeutici. Multiphoton microscopia a scansione laser e generazione di seconda armonica sono state applicate a collageni fibrillari immagine per monitorare rimodellamento della matrice extracellulare in tumore in topi vivi 5. Tuttavia, questa tecnica richiede animali da montare con le camere plica dorsale trasparenti, che è una procedura invasiva. Rappresentazione diretta e non invasiva di rimodellamento del collagene beneficerà di una sonda che si rivolge specificamente collagene in fase di ristrutturazione. Tale sonda è difficile preparare quanto deve distinguere i collageni rimodellamento dai collageni normali e mature, che sono abbondanti nei tessuti normali 6. Il collagene è costituito da proteine ​​struttura estremamente rara chiamata tripla elica, che èspaccati da proteasi come metalloproteinasi della matrice (MMP) durante rimodellamento del collagene. I frammenti di collagene spaccati perdono la loro struttura a tripla elica e diventano fili piegati (gelatina), ulteriormente digeriti da proteasi aspecifici 1. E &#39;stato recentemente scoperto che il peptide mimetico collagene (CMP), che ha la propensione a piegare in struttura a tripla elica può rivolgono specificamente filamenti di collagene che si dissociano dal suo stato tripla elica da una denaturazione calore o da degradazione enzimatica 1,7. L&#39;associazione è guidata principalmente da tripla elica ibridazione tra CMP monomeriche e le ciocche di collagene denaturato. Perché CMP auto-assemblano in triple eliche omotrimerica a temperatura ambiente con poca forza trainante per il collagene ibridazione, un CMP in gabbia [(GPO) 4 NB GPO (GPO) 4, designato come NB (GPO) 9, O: idrossiprolina], è stato sviluppato , che contiene un nitrobenzil foto distaccabilegruppo (NB) attaccato alla glicina centrale del peptide. Il gruppo gabbia NB impedisce stericamente il CMP di piegatura in tripla elica, ancora, la rimozione del gruppo gabbia per irraggiamento UV innesca subito la piegatura tripla elica del collagene e ibridazione 1. Quando CMP monomeriche etichettati con vicino infrarosso (NIR) fluorofori sono sistematicamente consegnati a modello i topi, possono rivolgono specificamente e permettere imaging in vivo di collagene denaturate nei tessuti sottoposti a normale (per esempio in osso e la cartilagine) e patologici (ad esempio nei tumori) rimodellamento 1 . CMP fluorescente possono essere utilizzati anche per l&#39;imaging collageni in sezioni di tessuto istologici. In studio istologico, i tessuti raccolti sono spesso conservati da fissazione per mantenere i componenti cellulari e la morfologia dei tessuti in generale dal deterioramento. Le procedure di fissaggio, che comprendono calore, e il trattamento con solventi organici e chimici cross-linking reagenti (ad esempio paraformaldeide), snaturare la struttura a tripla elica del collagene 8. Questo denaturazione genera i siti per CMP ibridazione. E &#39;stato dimostrato che i CMP fluorescente possono legarsi specificamente a collageni in sezioni di tessuto fissate (ad esempio pelle, cornea, e osso) ancora più efficace di un anticorpo anti-collagene, che ha permesso l&#39;identificazione facile di condizioni patologiche in tessuti del fegato fibrotici 9. Il CMP rivolge fili di collagene denaturato contenenti sequenza amminoacidica di motivi tripla elica, che è comune a tutti i tipi di collagene. Pertanto CMP può essere considerato un ampio spettro agente collagene colorazione. Qui vi presentiamo procedure sperimentali dettagliate per i) l&#39;imaging fili di collagene denaturato in vivo e collagene ii) visualizzando in ex sezioni di tessuto vivo con CMP Caged fluorescente. Un tag NIR, IR680, è stato coniugato al CMP gabbia per l&#39;imaging dal vivo, while carboxyfluorescein (CF) è stato utilizzato nel tessuto lavoro colorazione per la sua compatibilità con microscopi a fluorescenza standard. Questo protocollo si concentra sulla applicazione di imaging del CMP, ritenuti correlati al rimodellamento del collagene. Metodi per la sintesi CMP possono essere trovati nelle precedenti relazioni 1,7,9-15. In questo rapporto video, immagini tessuti scheletrici in topi normali e sezioni tissutali di topo cornea sono stati scelti per scopo dimostrativo, ma i metodi qui presentati possono essere facilmente applicati a molte patologie e modelli biologici che coinvolgono rimodellamento del collagene (ad esempio i tumori, la guarigione delle ferite), come nonché a quasi ogni campione di tessuto prefissata contenente collagene.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IRdye 680RD Maleimide (IR680)</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">929-71050</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5(6)-Carboxyfluorescein</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">21877-5G-F</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:123px;">Advanced Chemtech</td>
			<td style="width:137px;">YC2200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:123px;">Butler Veterinary Supply</td>
			<td style="width:137px;">4/4/5260</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat Serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">G9023-10ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A9647</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:137px;">10236276001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluoroshield mounting medium</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">F6182-20ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:643px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringes</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:137px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV lamp</td>
			<td style="width:123px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:137px;">1447T17</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Pearl impulse imager</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">9400</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Surgical forceps and scissors</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EasyDip slide staining system</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;">M900-12B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">20-place cardboard microscope slide tray</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:123px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">12-545-c</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;">Eclipse TE2000-E</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging denatured collagen strands in vivo and ex vivo via photo-triggered hybridization of caged collagen mimetic peptides

Il collagene è un importante componente strutturale della matrice extracellulare che supporta la formazione di tessuto e manutenzione. Sebbene rimodellamento del collagene è parte integrante di rinnovo normale tessuto, eccessiva quantità di attività rimodellamento è coinvolto nei tumori, artrite e molte altre condizioni patologiche. Durante rimodellamento del collagene, la struttura a tripla elica di molecole di collagene è interrotto da proteasi nell&#39;ambiente extracellulare. Inoltre, collageni presenti in molti campioni istologici sono parzialmente denaturate dai processi di fissazione e conservazione. Pertanto, questi filamenti di collagene denaturate possono servire come obiettivi efficaci per l&#39;imaging biologico. Abbiamo già sviluppato un peptide di collagene mimetica in gabbia (CMP), che può essere foto-triggered per ibridare con fili di collagene denaturate formando la struttura a tripla elica, che è unica al collagene. Gli obiettivi generali di questa procedura sono i) per l&#39;immagine filamenti di collagene denaturato resulting dalle normali attività di rimodellamento in vivo, e ii) per visualizzare collagene in ex sezioni di tessuto vivo utilizzando i CMP Caged foto-attivato. Per raggiungere ibridazione efficace e di successo in vivo ed ex vivo di imaging, CMP in gabbia fluorescente sono o-photo attivato immediatamente prima dell&#39;iniezione endovenosa, o sono azionati direttamente su sezioni di tessuto. Normale scheletrico rimodellamento del collagene in topi nudi e collagene nelle sezioni prefissati topo di tessuto corneale sono ripreso in questa procedura. Il metodo di imaging basata sulla tecnologia ibridazione CMP-collagene qui presentato potrebbe portare ad una maggiore comprensione del processo di rimodellamento tissutale, nonché consentire lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici per le malattie associate all&#39;attività elevato rimodellamento del collagene.

La Figura 1 mostra un tipico risultato di come foto-triggered IR680-Ahx-(GPO) 9 distribuisce in un sano SKH1 femmina topo nudo dopo l&#39;iniezione 24-96 hr postale. Essa mostra evidente accumulo CMP nello scheletro dopo il 24 HPI, a quel punto la maggior parte dei peptidi non legati sono stati in gran parte ripulito. Il processo di CMP ibridare con i trefoli di collagene rimodellamento sembra relativamente lento, soprattutto in contrasto con altre sonde di imaging peptide RGD (ad esempio 16). Questo probabilmente è dovuto al tasso lento ripiegamento del collagene tripla elica 17,18. Tuttavia, una volta ibridati, i trefoli CMP sono fortemente legati ai tessuti collagene, come solo lieve riduzione del segnale è visto dopo 24 hpi (Figura 1). A 96 hpi, l&#39;immagine NIR fluorescenza del mouse dopo la rimozione della pelle dimostra chiaramente la captazione scheletrica di IR680-Ahx-(GPO) 9 in spina dorsale e costole, nonché all&#39;interno delle ginocchia, caviglie,polsi e mandibole inferiori (Figura 2A). In ex vivo colorazione dei tessuti, foto-triggered fluorescenza marcata CMP Caged specificamente ibridano in filamenti di collagene denaturato in sezioni di tessuto. In Figura 3, CMP colorazione rivela chiaramente i fini fibrille di collagene parallele nello stroma corneale, che dimostra il suo uso come agente specifico colorazione collagene. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1.jpg" /> Figura 1. Seriali NIR immagini di fluorescenza di un topo nudo somministrati per via endovenosa con foto-decaged IR680-Ahx-(GPO) 9 mostra la captazione scheletrica in quattro giorni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width = &quot;4in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. NIR immagini di fluorescenza di topi somministrati con la foto-decaged IR680-Ahx-(GPO) 9 (A), gabbia IR680-Ahx-NB (GPO) 9 senza esposizione ai raggi UV (B), prefolded tripla elica [IR680-Ahx-(GPO ) 9] 3 (C), o calore dissociata singolo filamento IR680-Ahx-(GPO) 9 (D) a 96 HPI dopo la rimozione della pelle. scheletrico di targeting dal CMP può essere osservata solo in A e D. Segnali di fluorescenza NIR sono mostrati in scala arcobaleno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3.jpg" /> Figura 3. Micrografie fluorescenza di un co toposezione di tessuto rneal prefisso in paraformaldeide, e colorati con DAPI e la foto-triggered CF (GPO) 9 utilizzando il protocollo 2, visualizzando denso stroma collagene (macchiata da CMP, in verde), così come epitelio cellulare e endotelio (macchiata di DAPI, in blu ) (barra della scala: 100 micron).

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Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Questa procedura dimostra in vivo vicino IR imaging di fluorescenza delle attività di rimodellamento del collagene nei topi, nonché ex vivo colorazione di collagene in sezioni di tessuto con gabbia collagene peptidi mimetici che possono essere foto-attivati ​​per ibridare con fili di collagene denaturato.

Imaging denaturate collagene fili<em&gt; In vivo</em&gt; E<em&gt; Ex vivo</em&gt; Via Photo-triggered ibridazione di Caged collagene Mimetic peptidi

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

11.8K Views.  University of Utah.  Questa procedura dimostra in vivo vicino IR imaging di fluorescenza delle attività di rimodellamento del collagene nei topi, nonché ex vivo colorazione di collagene in sezioni di tessuto con gabbia collagene peptidi mimetici che possono essere foto-attivati ​​per ibridare con fili di collagene denaturato. 

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High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Ad alta risoluzione di immagini 3D Ex-Vivo I campioni biologici da Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Ricerca

Bioingegneria

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional (3D) tissue wherein hematopoiesis is regulated by spatially organized cellular microenvironments termed niches2-4. The organization of the BM niches is critical for the function or dysfunction of normal or malignant BM5. Therefore a better understanding of the in vivo microenvironment using an ex vivo mimicry would help us elucidate the molecular, cellular and microenvironmental determinants of leukemogenesis6.
Currently, hematopoietic cells are cultured in vitro in two-dimensional (2D) tissue culture flasks/well-plates7 requiring either co-culture with allogenic or xenogenic stromal cells or addition of exogenous cytokines8. These conditions are artificial and differ from the in vivo microenvironment in that they lack the 3D cellular niches and expose the cells to abnormally high cytokine concentrations which can result in differentiation and loss of pluripotency9,10.
Herein, we present a novel 3D bone marrow culture system that simulates the in vivo 3D growth environment and supports multilineage hematopoiesis in the absence of exogenous growth factors. The highly porous scaffold used in this system made of polyurethane (PU), facilitates high-density cell growth across a higher specific surface area than the conventional monolayer culture in 2D11. Our work has indicated that this model supported the growth of human cord blood (CB) mononuclear cells (MNC)12 and primary leukemic cells in the absence of exogenous cytokines. This novel 3D mimicry provides a viable platform for the development of a human experimental model to study hematopoiesis and to explore novel treatments for leukemia.

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

A 3D culture system for hematopoiesis is described using human cord blood and leukemic bone marrow cells. The method is based on the use of a porous synthetic polyurethane scaffold coated with extracellular matrix proteins. This scaffold is adaptable to accommodate a wide range of cells.

Ex vivo Mimicry di emopoiesi normale e anormale umana

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Nanoparticelle virali per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Tumore

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

In sintesi in vitro di Native, Spaziatura fibrosa lungo e segmentale collagene spaziatura lungo

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar gradiente di diffusione del sistema per Indagare Chemiotassi in un 3D collagene Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Layer-by-layer collagene Deposizione nel Microfluidic Dispositivi per microtessuto Stabilizzazione

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

Quantificazione dell'organizzazione del collagene fibrilla con strumenti a base di trasformata curvelet

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...

The Preparation of Chicken Ex Ovo Embryos and Chorioallantoic Membrane Vessels as In Vivo Model for Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging and Microbubble-Mediated Drug Delivery Studies

The chicken embryo and the blood-vessel rich chorioallantoic membrane (CAM) is a valuable in vivo model to investigate biomedical processes, new ultrasound pulsing schemes, or novel transducers for contrast-enhanced ultrasound imaging and microbubble-mediated drug delivery. The reasons for this are the accessibility of the embryo and vessel network of the CAM as well as the low costs of the model. An important step to get access to the embryo and CAM vessels is to take the egg content out of the eggshell. In this protocol, three methods for taking the content out of the eggshell between day 5 and&#160;8 of incubation are described thus allowing the embryos to develop inside the eggshell up to these days. The described methods only require simple tools and equipment and yield a higher survival success rate of 90% for 5-day, 75% for 6-day, 50% for 7-day, and 60% for 8-day old incubated eggs in comparison to ex ovo cultured embryos (~50%). The protocol also describes how to inject cavitation nuclei, such as microbubbles, into the CAM vascular system, how to separate the membrane containing the embryo and CAM from the rest of the egg content for optically transparent studies, and how to use the chicken embryo and CAM in a variety of short-term ultrasound experiments. The in vivo&#160;chicken embryo and CAM model is extremely relevant to investigate novel imaging protocols, ultrasound contrast agents, and ultrasound pulsing schemes for contrast-enhanced ultrasound imaging, and to unravel the mechanisms of ultrasound-mediated drug delivery.

This protocol describes three methods on how to obtain and use 5 to 8-day old chicken embryos and their chorioallantoic membrane (CAM) as an in vivo&#160;model to study contrast-enhanced ultrasound imaging and microbubble-mediated drug delivery.

La preparazione di embrioni di pollo ex ovo e vasi della membrana corioallantoica come modello in vivo per l'imaging ecografico con mezzo di contrasto e studi di somministrazione di farmaci mediati da microbolle