The authors are thankful to the nurses at the AMC that have facilitated the tissue collection. We would also like to acknowledge A.M.A. van der Laan for excellent technical support with the SHG and the two-photon imaging.

Questo protocollo segue le linee guida LUMC e AMC di umana comitato etico della ricerca. 1. Procedura chirurgica e Tissue Collection Nota: Anche se esistono varie tecniche per l&#39;asportazione chirurgica della contrattura di Dupuytren, il gold standard attuale è il fasciectomy parziali 15. La maggior parte dei pazienti sono trattati nella clinica day-surgery. <ol><li> Eseguire l&#39;intervento chirurgico in anestesia generale o regionale in base alle preferenze del paziente e anestesista di e comorbidità del paziente. Queste considerazioni sono oltre la portata di questo documento. Prima di Incisione, toccare la pelle con un oggetto appuntito per verificare che l&#39;anestesia sia soddisfacente. Utilizzare un laccio emostatico per facilitare la visualizzazione chirurgica in un campo esangue. </li><li> Dopo Prepping sterile e drappeggi, segnare l&#39;incisione previsto con una penna. Incidere la pelle con un bisturi sotto lente di ingrandimento sia longitudinalmente or utilizzando incisioni zigzag per prevenire contratture addizionali e anche per consentire l&#39;esposizione sufficiente. </li><li> Utilizzando forbici dissezione, liberare la pelle e lo strato sottocutaneo dalle sottostanti palmare fascia contratto. Identificare e proteggere il fascio neurovascolare del dito perché il cavo di malati può spostare verso la linea mediana. Una volta che il tessuto fibrotico (noduli e / o spinale) è delineato, accise bruscamente e regionale (subtotale) con un bisturi. Eseguire emostasi meticolosa sotto controllo del laccio al termine della procedura per impedire la formazione di ematomi. </li><li> Per chiudere la pelle, utilizzare ulteriori Z-plasties avere allungamento parziale della pelle. </li><li> Per questi studi utilizzano solo la parte del cavo nodulo fibrotico, la parte più attiva e cellulare della malattia. Avere il chirurgo esegue l&#39;identificazione macroscopica. I noduli isolati nel palmo della mano sono spesso precursori o un cavo, ma sono quasi mai resecati, come di solito non causano sintomi.Quelli che sono stati sottoposti a resezione i noduli che facevano parte di un cavo del dito contratto. Identificare questi noduli dalla parte spessa duro delle cordicelle nel handpalm (Figura 1A). </li><li> Una volta che il chirurgo rimuove il tessuto, trasferire immediatamente usando pinze sterili in una provetta da 50 ml contenente DMEM supplementato con 10% FCS e 1% (P / S). Mantenere il tessuto per un massimo di 2 ore in questo mezzo su una scatola di ghiaccio acquoso (4 ° C) (per esempio, il trasporto del tessuto dalla sala operatoria alla struttura coltura cellulare). </li><li> Mantenere i campioni in ghiaccio (4 ° C), mentre si prepara per il prossimo passo. Preparazione dei materiali e di coltura cellulare camera richiede 10-20 min. </li></ol> 2. Preparazione degli strumenti, Cultura Media e Cultura Inserti Nota: Tutte le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente salvo diversa indicazione. <ol><li> Preparare 500 ml di DMEM supplementato con 10% FCS e 1% (P / S) e filtro sterilize. Preriscaldare il mezzo a 37 ° C. </li><li> Forcipe Autoclave, un paio di forbici Mayo curve lama (150-170 mm di lunghezza) e un paio di forbici Metzenbaum e conservare in un contenitore sterile. </li><li> Sotto flusso laminare, aprire un 12-pozzetti cultura sterile. Inserire un inserto cultura (0,45 micron dimensioni dei pori, diametro 12 mm) in ciascun pozzetto della piastra 12 pozzetti (Figura 1B, pannello inferiore). </li><li> Riempire la piastra 12 pozzetti con 600 ml di preriscaldata (37 ° C) Mezzi di coltura pipettando su e così non direttamente sulla membrana dell&#39;inserto. Posizionare la piastra nel incubatore (37 ° C, 5% CO 2) (Figura 1B, pannello superiore). <ol><li> In alternativa, utilizzare un 24-pozzetti e aggiungere 300 ml di media per pozzetto. Il volume di terreno per pozzetto è ottimale quando uno strato del menisco viene formato tra il liquido e la parte inferiore dell&#39;inserto membrana. Nota: il supporto al fondo del pozzo diffonde attraverso la membr nitrocellulosaane formare lo strato menisco come illustrato negli schemi di figura 1B (pannello inferiore). </li></ol></li></ol> 3. Tissue Preparazione Impostazione ed Ex Vivo Tissue Culture Nota: Tutte le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente salvo diversa indicazione. <ol><li> Trasferire la parte del nodulo del cavo dal tubo 50 ml su un piatto da 100 millimetri Petri e aggiungere 10 ml di preriscaldata (37 ° C) di media. Assicurarsi che il tessuto è a contatto con il liquido durante l&#39;intera procedura. <ol><li> Rimuovere lo strato di grasso perinodulare usando le forbici Metzenbaum. Eliminare il tessuto adiposo. Con l&#39;uso di pinze e forbici curve pale, tagliare trasversalmente il tessuto in pezzi più piccoli (spessore massimo di 200 micron). </li></ol></li><li> Trasferire la piastra 12 pozzetti dal termostato nella cappa laminare. Verificare che la membrana dell&#39;inserto ha trasformato trasparente (umido) e quindi è in contatto con il fluido. </li><li> Utilizzando pinzeSollevare con attenzione una parte di tessuto toccando lo strato esterno (non applicare la tensione sul tessuto). Inserire una parte del tessuto sulla membrana dell&#39;inserto coltura cellulare in modo che il tessuto rimanga in interfase aria medio. Culture un massimo di due parti di tessuto sullo stesso inserto / pozzetto. </li><li> Assicurarsi che il tessuto è posto sulla membrana piatta, a contatto con il mezzo longitudinale tale che il tessuto non galleggia la membrana non sia completamente coperta dal mezzo. Evitare bolle d&#39;aria. Nota: A questo punto, è possibile aggiungere fattori di crescita o inibitori di interesse ai media; per esempio, composti di prova (A, B, C, D, E) in replicati e / o in curva concentrazione. Includere almeno 2 di controllo (non trattati) pezzi di tessuto in condizioni di crescita normali, per assicurare che l&#39;esperimento è stato impostato correttamente. Incubare tessuti per 3-7 giorni in un tessuto culturale incubatore. </li><li> Infettare il tessuto sia con costrutto lentivirale o adenoviral se sovraespressione o abbattere experiments di un bisogno gene di interesse da eseguire (Figura 2). Trasferire una parte di tessuto da 12-pozzetti in un piatto 35 millimetri con pinze. <ol><li> Utilizzare un volume massimo di 10 ml di elevata virus titolo. </li><li> Eseguire l&#39;iniezione sotto un microscopio di dissezione con una siringa da insulina caricata con 50 microlitri di PBS contenente 10 ml di virus selezionato. Inserire l&#39;ago perpendicolare al centro del tessuto. </li><li> Lentamente iniettare il contenuto della siringa. Non ritrarre direttamente l&#39;ago. Quando pungere il tessuto, non lasciare passare l&#39;ago attraverso l&#39;altro lato, ma mantenere l&#39;ago all&#39;interno del tessuto stesso (intorno al centro del tessuto). </li><li> Trasferire il tessuto di nuovo nel 12-pozzetti, chiudere la piastra di coltura e metterlo in incubatrice (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol></li></ol> 4. Whole-mount immunofluorescenza colorazione e la ricostruzione 3D Nota: Tutti i proprocedure vengono eseguite a temperatura ambiente salvo diversa indicazione. Il protocollo per l&#39;intero immunostaining montaggio e l&#39;imaging di seguito descritto è un adattamento da metodi precedentemente riportati utilizzati per altri tessuti 16-19. Buffer e materiali sono descritti nella tabella 1 e List materiali. <ol><li> Trasferimento tessuti dalla piastra di coltura a 2 ml microprovette contenenti PBS. Lavare 2x per 5 min in soluzione di PBS su una piattaforma rotante. Fissare tessuti in 4% PFA tamponata (1,5 ml di soluzione per tessuti in 2 ml provette da microcentrifuga), O / N a 4 ° C su una piattaforma rotante. </li><li> Rimuovere PFA e lavare 3x in PBS per 5 minuti ciascuno. </li><li> Disidratare tessuti mediante immersione in una soluzione di metanolo al 25% per 2 ore a temperatura ambiente su una piattaforma rotante. Aumentare la percentuale metanolo gradualmente (50%, 75%, 100%) con i tessuti immersi in ciascuna soluzione per 2 ore a temperatura ambiente su una piattaforma rotante. </li><li> Tessuti di trasferimento in DMSO / soluzione di metanolo (permeabilizzazione step) per 3 settimane a 4 ° C,come descritto in precedenza 18. Nota: In questa fase, i tessuti possono essere conservati a lungo termine in metanolo 100% a -20 ° C. </li><li> Procedere con la procedura di colorazione 16, 17; gradualmente reidratare tessuti (75% -50% -25% -0% serie metanolo). Eseguire ogni fase di reidratazione per 2 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C, sotto costante agitazione. </li><li> Incubare campioni con anticorpi primari in PBS contenente 1% di albumina sierica bovina (BSA) e 20% DMSO O / N a 4 ° C. Usare gli anticorpi ai seguenti rapporti con le scorte commerciali di PBS: anti-α actina muscolo liscio (1: 500, mouse), di tipo anti-collagene I (1: 500, di capra), anti-collagene di tipo III (1: 500, capra). </li><li> Lavare estesamente in PBS per 48 ore a 4 ° C (soluzione PBS cambiamento 3 a 4 volte). </li><li> Diluire appropriati anticorpi secondari (Alexa 555 anti-topo, Alexa 488 anti-capra) a 1: 250 di diluizione in PBS contenente 1% (BSA) e il 20% DMSO. Incubare O / N a 4 ° C. </li><li> Lavare estesamente in PBS per 48 ore a 476; C e incubare con contrasto nucleare, TO-PRO-3 diluito 1: 500 in PBS alla fase di lavaggio finale. Nota: TO-PRO-3 è un colorante DNA emettono lontano-rosso (con una linea laser 633 nm He-Ne) ed è abbinato per l&#39;imaging simultaneo con altri canali; in questo tipo di tipo caso collagene I / collagene III (488 nm), α actina muscolo liscio (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm). </li><li> Trasferire i tessuti ad una serie di metanolo (25% -50% -75%) a disidratare lentamente il tessuto; effettuare ogni passo di disidratazione per 2 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C sotto costante agitazione. <ol><li> Tessuti di trasferimento in tubi di polipropilene. Tessuti chiari in metilsalicilato (maniglia sotto cappa chimica) 18 o come uso alternativo soluzione BABB 19. Incubare a RT sotto costante agitazione fino a quando i tessuti diventano trasparenti. Mount tra una diapositiva e un copri sigillato con set dura mezzo di montaggio (Figura 1C, pannello superiore). </li></ol></li><li> Campioni un&#39;immagine su un micro confocale invertitaambito dotato di alta NA 63X e / o gli obiettivi immersione olio 100X (Figura 1C). <ol><li> Pulire l&#39;obiettivo con la soluzione di pulizia fornito dal produttore del microscopio. </li><li> Applicare una goccia di olio sulla lente dell&#39;obiettivo. Posizionare il vetrino con il campione sul palco microscopio e concentrarsi sul campione. </li></ol></li><li> Impostare le configurazioni del microscopio per l&#39;imaging simultaneo di fluorescenza a tre canali con linee laser 488 nm, 514 nm e 633 nm. </li><li> Acquisire le immagini XY singoli o più immagini sul piano focale (Z pila) (Figura 3a). Utilizzare maggiore larghezza di Z stack per eseguire la ricostruzione in 3D. Per ottenere un&#39;immagine ad alta risoluzione utilizzare bassa velocità di scansione, numero di scansioni medi (≥ 3) e di acquisire immagini a 16 bit di risoluzione 1.024 x 1.024 pixel. </li><li> Analizzare le immagini Z pila acquisite: prima rinominare e salvare il file immagine (xyz). Utilizzando il programma software del microscopio confocale, configurare un proge intensità massimaction delle immagini Z pila in un 3D ricostruito un&#39;immagine. <ol><li> Selezionare il file xyz, in &quot;Strumenti di processo&quot;, fare clic su sotto &quot;Visualizzazione&quot; e &quot;Proiezione 3D&quot;. Inserire &quot;Maximum&quot; nel metodo di proiezione (o &quot;media&quot; se il segnale fluorescente è saturo). Per una singola proiezione non cambiano X, Y, Z e aerei, e applicare lo strumento di proiezione (Figura 3B, r1). </li></ol></li><li> Utilizzare le immagini Z pila per creare una proiezione 3D con l&#39;animazione (software confocale) per scopi di visualizzazione. Selezionare il file xyz, negli strumenti di processo, fare clic su sotto &quot;Visualizzazione&quot; e &quot;Proiezione 3D&quot;. <ol><li> Clicca su &quot;Crea Movie&quot;. Inserire l&#39;angolo iniziale di rotazione in gradi (ad esempio, 0 ° come punto di partenza del film, l&#39;asse Y) e clicca su &quot;Set Start&quot;. Inserire l&#39;angolo di rotazione in gradi End (asse Y) come punto finale del film (ad esempio, 180 ° o 3606; per una rotazione completa) e clicca su &quot;Set End&quot;. </li><li> Selezionare &quot;Maximum&quot; come metodo di proiezione (o &quot;media&quot; se il segnale fluorescente è saturo). Inserire il &quot;numero di fotogrammi&quot; per la rotazione della ricostruzione 3D (ad esempio, 20 rotazioni o superiore per ridurre la velocità di rotazione). Fare clic su &quot;Applica&quot;. Esportare il filmato come file visivo (ad esempio, &quot;avi&quot;) (Film supplementare 1) o l&#39;esportazione in formato &quot;tiff&quot;, che crea un file di immagine per ogni angolo di rotazione (Figura 3B, rotazione r4, r10, r18). </li></ol></li></ol> 5. combinata seconda armonica Generation (collagene) e due fotoni fluorescenza Excited (elastina) Imaging su Ex Vivo Tissue durante Cultura Nota: Tutte le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente salvo diversa indicazione. <ol><li> Rimuovere le piastre transwell da incubatore e posizionare un singolo (non fissata) tiparte SSUE in una piastra di coltura cellulare 35 mm avente 500 ml di mezzo. </li><li> Posizionare il tessuto in modo che l&#39;asse lungo è piatto sulla piastra. Mantenere tessuto bagnato in ogni momento, tuttavia, non galleggiante. </li><li> Inserire obiettivo a immerso acqua del microscopio multifotone direttamente a contatto con il tessuto (Figura 1C). </li><li> Ottenere immagini con una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 800 nm e raccogliere la luce emessa tra 371-425 nm (SHG, collagene) e 474-532 nm (autofluorescenza, elastina) (Figura 3C). Eseguire microscopia a due fotoni in un microscopio confocale verticale dotato di un laser a femtosecondi utilizzando un obiettivo ad immersione 20X acqua / 1.0 NA. Confocale Process stack con il software del produttore. Nota: eccitazione con un laser vicino infrarosso di molecole di collagene crea imaging ad alta contrasto delle strutture di collagene nativo a diverse profondità. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+force+monitor+for+measurement+of+contraction+forces+generated+in+human+dermal+fibroblast+cultures:+evidence+for+cell-matrix+mechanical+signalling.">A culture force monitor for measurement of contraction forces generated in human dermal fibroblast cultures: evidence for cell-matrix mechanical signalling.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1201 (2), 186-192 (1994).</li><li>Verjee, L. S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulation+of+&#945;-smooth+muscle+actin+determines+the+contractile+phenotype+of+Dupuytren's+nodular+cells.">Post-transcriptional regulation of &#945;-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren's nodular cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).</li></ol>

Gli autori hanno presentato una domanda di brevetto per la malattia di Dupuytren: cultura d&#39;organo 3D. # GB1307200. Contratti di licenza e di servizi commerciali sono a disposizione.

Le fasi più critiche di coltura ex vivo tessuto connettivo umano sono l&#39;uso immediato del tessuto dopo la rimozione chirurgica per garantire la redditività; il tessuto dovrebbe rimanere in soluzione salina media o in ogni momento; mantenere una cultura sterile; sezioni trasversali di tessuto devono avere spessore massimo di 200 micron; set up del sistema di coltura ex vivo è ottimale quando il tessuto è in contatto con il mezzo ma non completamente sommerso. Piano dovrebbe essere aggiunto solo ...

Malattia di Dupuytren (DD), una malattia benigna fibroproliferativa provoca la flessione permanente delle dita a causa della formazione di noduli e corde nel palmo della mano. Anche se la diffusione della malattia è particolarmente alta tra i caucasici del Nord Europa, l&#39;eziologia genetica alla base della malattia resta sconosciuta 1. La caratteristica principale del DD è l&#39;eccesso di produzione di matrice extracellulare (ECM) proteine ​​(per esempio, collagene), che costituiscono un tessuto fibroso duro che occupa lo spazio tra i tendini e la pelle del palmo della mano e delle dita, interrompendo definitivamente i movimenti fini della mano 2, 3. La ricorrenza della malattia suggerisce alterazioni genetiche sottostanti come causa di fibrosi 1, 4. Un trattamento efficace potrebbe essere quella di indirizzare direttamente le incontrollabili meccanismi fibrotiche a livello cellulare e molecolare. Il nostro recente lavoro sulla fibrosi ci ha portato allo sviluppo di unnuovo sistema cultura in 3D che permette di cultura a breve termine di tessuto fibrotico umano con il potenziale di test anti-droga. Questo sistema ha contribuito a superare l&#39;approccio limitazione di colture di fibroblasti 2D e definire un ruolo per la regolazione giù parziali, raggiunti da exon skipping, di TGFβ attivazione della via nella mediazione fibrosi 5. Abbiamo sviluppato un metodo di coltura ex vivo campioni di resezione umano da pazienti DD di studiare l&#39;interazione tra miofibroblasti e ECM circostante 5, 6. Lo studio della fibrosi tessuto connettivo DD nonché altre malattie fibrotiche basa sull&#39;analisi istopatologica del escisso chirurgica esemplari, l&#39;isolamento dei fibroblasti del tessuto e la creazione di colture primarie o procedure di separazione delle cellule. Questi approcci sono alquanto statico in quanto non consentono la manipolazione delle proprietà esogena malattia o intervento terapeutico dallo sperimentatore. Inoltre, ce primariall culture tendono ad adattarsi alle condizioni di coltura e le loro proprietà di espressione genica differiscono sostanzialmente dalla situazione in vivo su ogni passaggio, anche durante i primi passaggi (tra il passaggio 3 e 6) 7, 8. Siamo riusciti a mantenere il materiale chirurgico rifiuti ex vivo condizioni di coltura per un periodo di tempo che permette lo studio delle caratteristiche specifiche del paziente e lo screening di composti farmacologici anti-fibrotiche o anti-infiammatori. Il sistema si basa su una membrana di nitrocellulosa che permette il contatto del tessuto con il mezzo, ma non con la plastica, quindi, impedendo l&#39;alterazione del tessuto su di attaccamento, come precedentemente osservato quando la coltura fibroblasti DD così come altri tipi di cellule 9. Non è richiesta alcuna gel di collagene o altro substrato proteine ​​ECM, poiché la stessa tessuto DD produce grandi quantità di queste proteine. Questo è vantaggioso per il mantenimento dei nativi microambiente ECM e il fatturato del peccatosubstrati matrice ce sono importante regolatore dell&#39;architettura del tessuto e della funzione 10, 11. Ad esempio, le proteine ​​ECM, come fibronectina, laminina e collagene, possono influenzare la polarità anteriore-posteriore fibroblasti come simile mostrati per polarità apicale-basale in cellule epiteliali 12, 13 . cellule polarizzate hanno una distribuzione asimmetrica di molecole extracellulari che determina la migrazione delle cellule e l&#39;espressione genica, ad esempio, l&#39;accessibilità α1β1 integrina sulla membrana colpisce adesione delle cellule al collagene di tipo I 14. Dal momento che l&#39;obiettivo primario di questo modello 3D è stato quello di preservare il microambiente nativo, è stato utilizzato alcun substrato matrice ECM artificiale. In breve: campioni di resezione sono ugualmente tagliati in un ambiente sterile e posti su membrane nitrocellular. Se è richiesto un trattamento somministrato tramite iniezione i tessuti vengono iniettati dopo che sono state collocate sulla membrana. Se il trattamento non ha bisogno di essere amministrato via injezione poi il composto viene aggiunto al mezzo di coltura (Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM), con siero fetale di vitello 1% (FCS), 1% di penicillina-streptomicina (P / S)). Le colture vengono mantenute per un massimo di dieci giorni dopo che il tessuto è fissato in 4% paraformaldeide (PFA), elaborati attraverso soluzione di saccarosio al 30%, incorporato in OCT e conservati a -80 ° C, come descritto in precedenza 5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>high glucose, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PIHA01250</td>
			<td>0.45um pore size, 12mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type I</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1310-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- &#945; smooth muscle actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type III</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1330-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPRO-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylsalicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsccope glass coverslips</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>BB024060A1</td>
			<td>24x60mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope SuperFrost slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>AA00000102E</td>
			<td>76x26mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 II confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 710 NLO upright confocal microscope</td>
			<td>Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA 
			water-immersion objective.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human dupuytren's ex vivo culture for the study of myofibroblasts and extracellular matrix interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Il metodo di ex vivo, 3D coltura del tessuto connettivo è un sistema di set up semplice e robusto per comprendere la relazione tra ECM e altri componenti cellulari che costituiscono il tessuto DD e potenzialmente altri tipi di fibrosi pure. Inoltre questo sistema permette un metodo affidabile per testare gli effetti dei composti sulla differenti tipi cellulari ei loro effetti sul carico fibrotica 20. I passi da raccolta di materiale chirurgico rifiuti derivati ​​da f...

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Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Malattia di Dupuytren (DD) è una malattia fibroproliferativa del palmo della mano. Qui vi presentiamo un protocollo per i campioni della cultura di resezione di DD in un tridimensionale (3D) sistema di coltura. Tale sistema di coltura a breve termine permette conservazione della struttura 3D e proprietà molecolari del tessuto fibrotico.

Umana Dupuytren di<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura per lo Studio dei miofibroblasti e matrice extracellulare Interazioni

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

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Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

10.3K Views.  Leiden University Medical Center.  Malattia di Dupuytren (DD) è una malattia fibroproliferativa del palmo della mano. Qui vi presentiamo un protocollo per i campioni della cultura di resezione di DD in un tridimensionale (3D) sistema di coltura. Tale sistema di coltura a breve termine permette conservazione della struttura 3D e proprietà molecolari del tessuto fibrotico. 

Video: Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

Ex Cultura Vivo del tessuto del paziente e l&#39;esame di consegna Gene

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

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Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Neuroendocrini umani cella linee tumorali come un modello tridimensionale per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e terapia dei tumori neuroendocrini

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

Un umano<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Placca aterosclerotica modello per studiare Lesione Biologia

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

Procedura per la safena umane Veins<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusione e rinforzo esterno

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modello per studiare Hormone azione in seno umano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo ed ex vivo approcci per studiare il cancro ovarico metastatico colonizzazione delle strutture Lattea Spot in peritoneale adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Generazione di Microtumors Uso 3D Biogel Umano Sistema Cultura e cellule di glioblastoma paziente-derivato per Kinomic Profiling and Drug Testing risposta

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Strategico cellule endoteliali tubo saggio Formazione: Confronto tra matrice extracellulare e fattore di crescita ridotto matrice extracellulare

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Fosforo-31 spettroscopia di risonanza magnetica: uno strumento per misurare<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacità fosforilazione ossidativa mitocondriale nel muscolo scheletrico umano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

Procedura di preparazione per la misura della reattività in Mouse arteriole retiniche Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...