Questo lavoro è stato supportato da una Lundbeck Junior Capo Gruppo Fellowship a LNN. PWW riconosce il sostegno finanziamenti provenienti scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC). Ringraziamo anche il danese Molecolare Bioimmagini Center presso University of Southern Denmark di accesso a spinning microscopio disco.

Acquisizione di proteine ​​EGFP-tag nella membrana plasmatica di analisi CCI può essere fatto su un microscopio a epifluorescenza, una configurazione TIRF o su un microscopio disco rotante impostato per acquisire immagini della membrana di interesse. La dimensione pixel fotocamera così come il tempo tra i fotogrammi immagine è necessario per l&#39;analisi. Sequenze di immagini di 100-1,200 fotogrammi a una frequenza di 4-30 Hz possono essere utilizzate per l&#39;analisi. Durante l&#39;acquisizione, è importante mantenere la membrana a fuoco per tutta la durata della rappresentazione e concentrarsi su una frazione della membrana piatta in cui la fluorescenza è distribuita uniformemente. Spostamento di vescicole, sporgenti regioni di membrana e organelli cellulari può essere tagliata fuori più avanti nel processo di analisi. Il tempo di acquisizione dovrebbe essere scelta in modo che non vi è nessuna deriva o movimento della cellula. Per ottenere gli script di codice CCI per MATLAB, contattare Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). La prima volta che il codice CCI viene utilizzato, MAT apertoLAB e fare clic su File, quindi impostare il percorso, quindi aggiungere con sottocartelle e trovare la cartella nel computer in cui si trova il codice CCI. Quindi fare clic su ok, salvare e chiudere. Continuare ora con l&#39;analisi di colture descritte nei punti successivi. 1. Importare la sequenza di immagini d&#39;interesse in un programma di analisi di imaging come TIFF Stack Salvare il file con il nome: stack1.tif. <ol><li> Selezionare una regione rettangolare di interesse (ROI) in corrispondenza della parte piatta della membrana escluse organelli cellulari mobili e sporgente regioni di membrana. La dimensione raccolto è scelto in modo che un numero sufficiente di statistiche vengono generati per il bene k 2 terreni. </li><li> Ritagliare la regione e salvare il raccolto come file TIFF in una cartella appropriata. Se ci sono più colture dal film stesso, utilizzare un numero minimo, per esempio &quot;stack1crop.tif&quot;, &quot;stack1crop2.tif&quot;, &quot;stack1crop3.tif&quot;. </li><li> Posizionare la cartella contenente i raccolti a livello localesul computer, non su un server, mentre si fa l&#39;analisi CCI. </li></ol> 2. Importare le colture nel software di analisi One by One per eseguire l&#39;analisi <ol><li> Aprire MATLAB e digitare &quot;icsgui&quot; nella finestra di comando e premere INVIO. ICS GUI è il nome del file eseguibile del programma di grafica dell&#39;interfaccia utente spettroscopia di correlazione di immagine. </li><li> Nella GUI ICS fare clic sulla scheda &quot;CCI&quot;. Una schermata della finestra di analisi è illustrata nella Figura 1. </li><li> Trovare la cartella con il nome della cartella &quot;codice MATLAB&quot; e scorrere fino al file con il nome del file &quot;Script&quot; e aprire con un doppio clic su di esso. In alternativa, fate clic destro sul file e selezionare &quot;Apri con MATLAB&quot; o vai su File, Apri in MATLAB e aprire il file script. Questo file si chiama Editor. </li><li> Sul rotolo Editor per &quot;CCI carico set di dati&quot;, quindi copiare o nome file tipo e la posizione della cartella nella linea di comando che iniziacon img = ad esempio &quot;C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif&quot;. Nella riga di comando sotto il percorso della cartella impostare il numero di fotogrammi da analizzare - per esempio [1:500]. Utilizzare le stesse impostazioni per tutti i film consecutivi nella serie di dati. Se c&#39;è deriva fuoco in frame successivi, questi dovrebbero essere esclusi dall&#39;analisi. </li><li> Nell&#39;editor fare clic su &quot;salva&quot; e poi cliccare su &quot;valutare cella&quot;. Il set di dati viene caricato in nel software di analisi. </li><li> Nella finestra Analisi CCI nella GUI, immettere le impostazioni per l&#39;analisi: <ol><li> Deselezionare le caselle &quot;cellule T&quot;. </li><li> Inserisci il numero di scarti temporali da analizzare. Il numero di intervalli di tempo (τ) avrà effetto sulla trama di diffusione e deve essere scelta in modo che la trama diffusione è lineare. Inizia con l&#39;immissione di 25 per poi diminuire al punto in cui la trama diffusione è lineare. τ è il numero di Tempi di attesa dell&#39;analisi CCI confronta e un tempo di ritardo è il tempo bra un fotogramma e il successivo. Dovrebbe essere selezionato il valore più piccolo che dà una trama lineare. Il numero massimo di sfasamenti temporali è scelto in modo da ottenere una misura lineare, scegliendo un valore elevato produce dati che non possono essere montati linea. </li><li> Inserire il valore massimo k 2 (vedi cerchio 1 in figura 1), è di solito 20-50. Un buon k 2 trama è una trama in cui ci sono molti punti di dati che sono distribuiti lungo una linea. Inizia all&#39;entrata 70 e poi diminuire dopo aver valutato le k 2 e diffusione trame e selezionare il valore più basso in cui il cluster punti dati attorno ad una linea retta. Il valore k 2 è la grandezza quadrata della k-vettore spaziale nello spazio di Fourier. Inizialmente, l&#39;analisi deve essere ripetuta fino a quando vengono determinati i valori migliori, quindi utilizzare le stesse impostazioni per tutti i film consecutivi nella serie di dati, ma sempre verificare che le impostazioni selezionate danno una buona misura per i dati: buona k 2 piazzolee una trama diffusione lineare. </li><li> Fare clic su &quot;Impostazioni negozio e procedere&quot;. </li><li> Fare clic su &quot;sì&quot; per visualizzare tutti i grafici. </li><li> Fare clic su &quot;serie di immagini Load&quot; (vedi cerchio 2 in Figura 1), poi cliccare su &quot;area di lavoro&quot;. </li><li> Selezionare &quot;imgSerCrop&quot;, quindi fare clic su &quot;Importa da lavoro&quot;. </li><li> Immettere le impostazioni della raccolta sistema di imaging. Nella &quot;dimensione pixel&quot; casella immettere la dimensione dei pixel previsto per il sistema di imaging in cui le pile di immagini vengono acquisite. Per AQP3-EGFP, 0.111 è stato utilizzato. Nella casella &quot;Immettere il tempo (s) tra i fotogrammi&quot;, 0,1150 è stato utilizzato per AQP3-EGFP. </li><li> Fare clic su &quot;seleziona ROI&quot;, inserire &quot;1&quot;, fare clic su ok e &quot;usare tutta l&#39;immagine&quot;. </li><li> Fare clic su &quot;Analisi Do CCI&quot; e fare clic su Sì per fare &quot;filtraggio immobile&quot;. I risultati si apriranno automaticamente le immagini. </li><li> Minimizzare la finestra delle impostazioni, ridurre al minimo le informazioni cellule window, e ridurre al minimo la finestra fotofisica. Nella finestra dinamiche, verificare che la trama dinamica mostra un fit lineare dei dati a una linea con una pendenza negativa significa che i punti dati correlano e libera diffusione può essere assunta. Registrare il coefficiente di diffusione per l&#39;intervallo di tempo specifico e k 2 impostazioni (non è necessario rilevare la deviazione standard del fit). I punti dati in k 2 terreni devono essere raggruppati attorno alla linea per il tempo determinato ritardi. </li><li> Barrare la casella &quot;Salva figure aperte come immagini&quot;, quindi fare clic su &quot;Salva figure aperte come immagini&quot; per salvare i file risultato. Salvare in una nuova cartella in C: Users Documenti AQP3diffusion. Fare clic su &quot;dati attuali chiara&quot; e proseguire con l&#39;analisi del prossimo raccolto. </li></ol></li></ol> 3. Medio del coefficiente di diffusione calcolata è calcolato per ottenere una panoramica dei dati analizzati <ol><li> Immettere i coefficienti di diffusione individuali di ogni ROI in un SPREadsheet (assicuratevi di annotare il τ e k 2 valori), utilizzare i nomi delle colture, come stabilito in precedenza. </li><li> Calcolare il coefficiente medio di diffusione e la deviazione standard utilizzando un foglio di calcolo. </li><li> Eseguire un test di Kolmogorov-Smirnov o studenti t-test per valutare le differenze statistiche utilizzando un livello di significatività del 5%. Confronti Quantitave tra le cellule (per esempio trattati vs non trattati) possono essere fatte. </li><li> Aprire la versione foglio delle piazzole di diffusione che è stato generato dal software di analisi per ciascuna coltura, e nella media dei dati per ciascuna condizione per ogni intervallo di tempo. Genera una nuova trama diffusione media per la presentazione di documenti o presentazioni. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=k-Space+image+correlation+spectroscopy:+A+method+for+accurate+transport+measurements+independent+of+fluorophore+photophysics.">k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics.</a> Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).</li><li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+Applications+to+membrane+dynamics.">Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).</li><li>Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lateral+diffusion+of+membrane+molecules+with+quantum+dots.">Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots.</a> Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li><li>Pinaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+a+glycosyl-phosphatidylinositol-anchored+protein+in+glycosphingolipid-rich+microdomains+imaged+by+single-quantum+dot+tracking.">Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking.</a> Traffic. 10, 691-712 (2009).</li><li>Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+analysis+of+single-molecule+tracking+data+by+comprehensive+testing+against+Monte+Carlo+simulations.">Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations.</a> Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).</li><li>Durisic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+correction+of+blinking+bias+in+image+correlation+transport+measurements+of+quantum+dot+tagged+macromolecules.">Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules.</a> Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).</li><li>Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+regulated+membrane+diffusion+of+a+green+fluorescent+protein-aquaporin+2+chimera.">cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera.</a> Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).</li><li>Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+the+endoplasmic+reticulum+of+an+aquaporin-2+mutant+causing+human+nephrogenic+diabetes+insipidus.">Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).</li><li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+image+correlation+spectroscopy+(PICS):+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data.">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys J. 92, 613-621 (2007).</li><li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy:+concept+and+application.">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).</li><li>Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., L&#248;cke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+cAMP+increases+aquaporin-3+plasma+membrane+diffusion.">Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Questo documento presenta una panoramica dettagliata passo-passo su come applicare il metodo di analisi CCI per determinare i coefficienti di diffusione di immagini di microscopia di proteine ​​marcate con proteine ​​fluorescenti. L&#39;analisi è indipendente dalla scelta sonda con una ampia gamma dinamica della densità etichettatura e può quindi essere applicato anche per proteine ​​marcate con punti quantici così come coloranti e proteine ​​fluorescenti come la EGFP. Pe...

L&#39;organizzazione spazio-temporale quadridimensionale e mobilità laterale delle proteine ​​di membrana di plasma sono strettamente regolati e possono svolgere un ruolo nella funzione della proteina, l&#39;attività e le interazioni proteina-proteina. Diffusione laterale delle proteine ​​di membrana del plasma, è tradizionalmente stata studiata calcolando i coefficienti di diffusione per singole particelle di time-lapse imaging di quantum dot o tingere etichettati proteine ​​della membrana plasmatica 2-4. Questo approccio richiede l&#39;inserimento di un tag extracellulare della proteina di membrana plasmatica per quantum dot o etichettatura colorante, che può compromettere folding e la funzione e, quindi, non può essere raggiunto per alcune proteine. Il volume sterico di un punto quantico ha dimostrato di rallentare la diffusione della proteina 5 ed inoltre, solo una piccola frazione delle proteine ​​nella popolazione rechino punti quantici, e non è noto se la frazione è rappresentativa del totale pool di proteine ​​di membrana plasmatica. TRA singola particellacking (SPT) misurazioni dei coefficienti di diffusione di immagine serie di proteine ​​marcate quantum dot coinvolge la mappatura delle posizioni di punta impressi delle particelle con bidimensionale gaussiano si adatta seguiti da ampie algoritmi di analisi. L&#39;analisi è computazionalmente molto intenso, che richiede un&#39;ampia curva non lineare adatta in ogni fotogramma l&#39;immagine di una sequenza di time-lapse per approssimazioni della funzione microscopio punto di spread (tipicamente bidimensionale gaussiane spaziale) e il successivo collegamento delle posizioni delle particelle in traiettorie delle particelle descrive l&#39; moto delle singole molecole 6,7. Un&#39;immagine tecnica di correlazione sviluppata di recente, k-spazio Image Correlation Spectroscopy (CCI) permette semplici misurazioni relative di coefficienti di diffusione di fluorescenza tagged proteine ​​di membrana del plasma. La possibilità di calcolare regolarmente coefficienti di diffusione delle proteine ​​di membrana marcate con proteine ​​fluorescenti da CCI è uno strumento unico che tienediversi vantaggi rispetto quantum dot tradizionale analisi SPT: Non è richiesto alcun inserimento di tag extracellulari e richiede tempo etichettatura extracellulare (linee cellulari che esprimono proteine ​​fluorescenti possono essere utilizzati); coefficienti di diffusione sono estratti dal pool totale di proteine ​​fluorescenti rispetto a un sottoinsieme etichettato con punti quantici; analisi è semplice, senza la necessità di monitorare singole proteine ​​e l&#39;analisi può essere eseguita utilizzando un codice esistente senza necessità di programmazione utente aggiuntivo. Il metodo è veloce perché è una tecnica che permette il calcolo della media veloce e calcolo dei coefficienti di diffusione. Queste misure diffusione rapidi per la popolazione proteina completano le informazioni più dettagliate trasporto molecolare ottenuto per un sottoinsieme della popolazione dai metodi SPT scrupoloso. tempo CCI correla microscopia a fluorescenza sequenze di immagini che sono stati prima trasformati in spazio di Fourier, e quindi separa flfluttuazioni uorescence dovute a fotofisica da quelli dovuti al trasporto molecolare 1. Come risultato, CCI possono determinare la densità numerica, velocità di flusso, e la diffusione di fluorescente molecole marcate pur essendo distorti da fotoscolorimento complesso o lampeggiante dei fluorofori. Questo rende CCI uno strumento utile per determinare rapidamente la dinamica di diffusione di proteine ​​della membrana cellulare fluorescenza marcata senza la necessità di algoritmi di scrittura personalizzati. Proteine ​​Oltre fluorescente, CCI possono essere applicate anche a Quantum Dot-marcato proteine ​​di membrana 8. Questo documento fornisce un&#39;introduzione step-by-step di come usare CCI per estrarre i coefficienti di diffusione delle proteine ​​di membrana plasmatica EGFP-taggate dimostrando come posizionare il raccolto, come utilizzare il codice e come valutare le trame generate, da cui diffusione coefficienti vengono estratti. Come esempio, i dati ottenuti facendo girare insieme di dischi-microscopia a riflessione interna totale semi-fluorescenzaModalità nce (TIRF), di una proteina renale canale di acqua aquaporin-3 (AQP3) con etichetta EGFP è presentato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31600-083</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicilin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=en&amp;region=DK">13752</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15160070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11860038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol red free medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11880-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=en&amp;region=DK">D8418&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15630056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning Disk Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Ti Eclipse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:71px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">Ixon+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy measurement of diffusion coefficients of egfp-tagged plasma membrane proteins using k-space image correlation spectroscopy

Diffusione laterale e la compartimentalizzazione delle proteine ​​di membrana del plasma sono strettamente regolati nelle cellule e, quindi, lo studio di questi processi saranno rivelare nuovi spunti per la funzione delle proteine ​​di membrana plasmatica e la regolamentazione. Recentemente, k-spazio correlazione Immagine Spectroscopy (CCI) 1 è stato sviluppato per consentire misurazioni di routine di coefficienti di diffusione direttamente dalle immagini delle proteine ​​di membrana plasmatica con targhetta modo fluorescente, che evitate distorsioni sistematiche introdotte dal fotofisica sonda. Sebbene la base teorica per l&#39;analisi è complessa, il metodo può essere implementato da non esperti utilizzando un codice liberamente disponibile per misurare coefficienti di diffusione di proteine. CCI calcola una funzione di correlazione tempo da una pila di microscopia a fluorescenza dopo trasformazione di Fourier di ogni immagine reciproca spazio (k-). Successivamente, media circolare, logaritmo naturale trasformare e lineare adatta per la funzione di correlazione produce il coefficiente di diffusione. Questodocumento fornisce una guida step-by-step per l&#39;analisi delle immagini e la misurazione dei coefficienti di diffusione via CCI. In primo luogo, un frame rate elevato sequenza di immagini di una proteina di membrana plasmatica fluorescente viene eseguita utilizzando un microscopio a fluorescenza. Poi, è selezionata una regione di interesse (ROI) evitando organelli intracellulari, vescicole mobili o sporgenti regioni di membrana. Lo stack ROI viene importato in un codice liberamente disponibile e diversi parametri definiti (vedi sezione Method) sono impostati per l&#39;analisi CCI. Il programma genera quindi un &quot;pendio di piste&quot; complotto dalle funzioni di tempo di correlazione k-spazio, e il coefficiente di diffusione è calcolato dalla pendenza del grafico. Qui di seguito è una procedura step-by-step CCI per misurare il coefficiente di diffusione di una proteina di membrana utilizzando l&#39;renale canale di acqua aquaporin-3 con etichetta EGFP come un esempio canonico.

Per acquisire stack di immagini adatte ad essere analizzati con CCI, possono essere utilizzati diversi sistemi microscopio. È possibile analizzare sequenze di immagini da un microscopio epi-fluorescenza, nonché una configurazione disco TIRF o filatura. La membrana deve essere piatta, senza grandi organelli cellulari in movimento o lo spostamento di vescicole / oggetti. Questo articolo presenta una sequenza di immagini lasso di tempo di AQP3 con etichetta EGFP in cellule MDCK vive impressi su un microscopio disco rotan...

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Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Questo documento fornisce una guida passo per passo per la tecnica di analisi fluttuazione k-Image Space Correlation Spectroscopy (CCI) per misurare i coefficienti di diffusione delle fluorescente proteine ​​di membrana plasmatica in cellule di mammifero vive.

Facile Misura di diffusione Coefficienti di EGFP-tagged plasma proteine ​​di membrana Uso k-spazio Spettroscopia di correlazione Immagine

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

easy-measurement-diffusion-coefficients-egfp-tagged-plasma-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Views.  Aarhus University.  Questo documento fornisce una guida passo per passo per la tecnica di analisi fluttuazione k-Image Space Correlation Spectroscopy (CCI) per misurare i coefficienti di diffusione delle fluorescente proteine ​​di membrana plasmatica in cellule di mammifero vive. 

Video: Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) of macromolecules, and can be applied to both in vitro and in vivo biological systems. Multi-fluorescence recovery after photobleaching is performed by photobleaching a region of interest within a fluorescent sample using an intense laser flash, then attenuating the beam and monitoring the fluorescence as still-fluorescent molecules from outside the region of interest diffuse in to replace the photobleached molecules. We will begin our demonstration by aligning the laser beam through the Pockels Cell (laser modulator) and along the optical path through the laser scan box and objective lens to the sample. For simplicity, we will use a sample of aqueous fluorescent dye. We will then determine the proper experimental parameters for our sample including, monitor and bleaching powers, bleach duration, bin widths (for photon counting), and fluorescence recovery time. Next, we will describe the procedure for taking recovery curves, a process that can be largely automated via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) for enhanced throughput. Finally, the diffusion coefficient is determined by fitting the recovery data to the appropriate mathematical model using a least-squares fitting algorithm, readily programmable using software such as MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

In this article we will describe the procedure for measuring diffusion coefficients using multi-photon fluorescence recovery after photobleaching. We will begin by aligning the laser along the optical path to the sample and determining the proper experimental parameters, then continue generating and finally fitting fluorescence recovery curves.

Misurare coefficienti di diffusione via a due fotoni di recupero fluorescenza Dopo photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Ricerca

Biologia

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Misurazione quantitativa della traslocazione GLUT4 sulla membrana plasmatica mediante citometria di flusso

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristallizzazione delle proteine ​​di membrana lipidica in Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Mappatura diffusione molecolare nella membrana plasmatica da parte di più-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

L&#39;utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

La base di Cell-L-Glutatione Protezione saggi per studiare endocitosi e riciclo dei Plasma proteine ​​di membrana

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging Plasma membrana Deformazioni Con pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and product development. Stress-strain relationships are typically obtained from mechanical testing data to enable comparative assessment among samples and in some cases identification of constitutive mechanical properties. However, errors may be introduced through the use of average strain measures, as significant heterogeneity in the strain field may result from geometrical non-uniformity of the sample and stress concentrations induced by mounting/gripping of soft tissues within the test system. When strain field heterogeneity is significant, accurate assessment of the sample mechanical response requires measurement of local strains. This study demonstrates a novel biomechanical testing protocol for calculating local surface strains using a mechanical testing device coupled with a high resolution camera and a digital image correlation technique. A series of sample surface images are acquired and then analyzed to quantify the local surface strain of a vascular tissue specimen subjected to ramped uniaxial loading. This approach can improve accuracy in experimental vascular biomechanics and has potential for broader use among other native soft tissues, engineered soft tissues, and soft hydrogel/polymeric materials. In the video, we demonstrate how to set up the system components and perform a complete experiment on native vascular tissue.

We describe the use of digital image correlation to characterize the local surface strain field on vascular tissue samples subjected to uniaxial tensile testing. These measurements facilitate precise quantification of the sample mechanical response and the generation of constitutive stress-strain relations.

Utilizzo di Digital Image Correlation per caratterizzare ceppi locali vascolari campioni di tessuto

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...

Facile Misura di diffusione Coefficienti di EGFP-tagged plasma proteine ​​di membrana Uso k-spazio Spettroscopia di correlazione Immagine

Facile Misura di diffusione Coefficienti di EGFP-tagged plasma proteine di membrana Uso k-spazio Spettroscopia di correlazione Immagine