We are grateful to the Roney Family Foundation for the support of this study. We acknowledge the contribution of Dr. M. Lucrecia Alvarez to the planning and execution of the experiments described in this work.

NOTA:. I passi necessari per l&#39;isolamento dei esosomi urinari con il metodo di precipitazione modificato sono illustrati nella Figura 1 Le fasi iniziali prevedono la rimozione di grandi cellule morte e detriti cellulari mediante centrifugazione. Il pellet finale ottenuto dal supernatante raccolto da ciascun passo successivo corrisponde al exosome, che viene sciolto in soluzione di isolamento per l&#39;ulteriore estrazione di proteine, RNA e DNA. 1. Raccolta delle urine <ol><li> Prima della raccolta delle urine, preparare con inibitori della proteasi cocktail secondo le istruzioni del produttore e aggiungere 3,125 ml di questo cocktail per una presa sterile vuota. La provetta contenente il cocktail di inibitori delle proteasi può quindi essere distribuito ai volontari per la raccolta delle urine. NOTA: La ragione per l&#39;aggiunta di inibitore della proteasi è quello di minimizzare la degradazione della proteina nel campione di urina. Anche se abbiamo usato un particolare cocktail inibitore della proteasi daSigma, altri inibitori della proteasi disponibili in commercio possono essere sostituiti. </li><li> Raccogliere circa 10 ml di urina prima nullo. Processo urine subito dopo la raccolta, senza la conservazione o refrigerazione. Isolare le exosomes urinarie in duplicato utilizzando il metodo di precipitazione modificato; uno dei duplicati è per DNA, RNA totale e l&#39;estrazione delle proteine, mentre l&#39;altra è per la quantificazione delle particelle exosome urinarie. NOTA: Un campione di urine delle 24 ore può essere raccolto per l&#39;isolamento exosome memorizzando a 4 ° C. </li></ol> 2. Rimozione dei detriti cellulari e Tamm-Horsfall Protein (THP) <ol><li> Trasferire i campioni di urina a 15 ml provette. Centrifugare 10 ml di urina a 17.000 xg per 10 min a 37 ° C per eliminare cellule e detriti cellulari (Figura 1). </li><li> Utilizzando una pipetta, trasferire il surnatante in una nuova provetta per ulteriori elaborazioni. Risospendere il pellet in 500 ml di soluzione di isolamento 250 mM di saccarosio, mette alla prova (10 mManolamine, pH 7,6), seguito da 10 minuti di incubazione con DL-ditiotreitolo (DTT: concentrazione finale 200 mg / ml) a 37 ° C. NOTA: DTT si aggiunge a degradare THP, che intrappola esosomi, con conseguente riduzione della resa. Fare attenzione a lasciare il pellet indisturbata durante il trasferimento del surnatante, e confermare che il surnatante è chiaro di pellet. </li><li> Campioni di sedimenti di Vortex ogni 2 minuti fino a quando il pellet è completamente sciolto. Poi aggiungere 500 ml di soluzione di isolamento al pellet disciolto. </li><li> Immediatamente dopo l&#39;aggiunta della soluzione di isolamento al pellet, centrifugare a 17.000 xg per 10 min a 37 ° C. Pipettare il supernatante e si combinano con il supernatante raccolto precedente. </li><li> Risospendere il pellet in 50 ml di soluzione di isolamento per l&#39;analisi SDS-PAGE. NOTA: PBS o TBS possono essere utilizzati al posto di soluzione di isolamento per risospendere il pellet. </li></ol> 3. Isolamento di Exosome Pellet <ol><li> Per 11 ml di supern raccoltaatant, aggiungere 3,3 ml di reagente ExoQuick-TC e incubare a 4 ° C per almeno 12 ore. NOTA: Il rapporto tra volume di supernatante di reagente ExoQuick-TC può essere regolata per aumentare o diminuire la resa exosomal. Abbiamo osservato che minori volumi di reagente aggiunto producono rendimenti più piccole di esosomi. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, centrifugare la miscela campione / ExoQuick-TC a 10.000 xg per 30 min a 25 ° C. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provetta per l&#39;analisi SDS-PAGE. </li><li> Il pellet exosome può essere conservato a -80 ° C per il DNA, RNA e proteine ​​estrazione e la quantificazione delle particelle exosome utilizzando CD9 ELISA 11. NOTA: Il pellet exosome può essere conservato a -80 ° C per 1 anno con congelamento e scongelamento limitata. </li></ol> 4. Biomarker rilevazione e l&#39;analisi di Exosome Pellet <ol><li> Per le analisi a valle, estrarre il DNA, RNA e proteine ​​dal pellet exosome utilizzando il DNA / RNA / Kit di isolamento delle proteine ​​e un ki isolamento RNAt secondo le istruzioni del produttore. Determinare le concentrazioni utilizzando uno spettrofotometro Nanodrop misurando l&#39;assorbanza a 260 e 280 nm con 2 ml di campione. </li><li> Eseguire quantitativa real time RT-PCR (qPCR) usando saggi microRNA TaqMan (nel nostro caso, abbiamo utilizzato umani miR-192- e miR-1207-5p-specifici test) o primer miRNA specifici. </li><li> Per l&#39;analisi SDS-PAGE, utilizzare 4-12% Bis-Tris gel e campioni di proteine ​​separati da unidimensionale elettroforesi. Visualizza gel usando il kit di colorazione argento secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Eseguire l&#39;analisi Western Blot utilizzando membrane PVDF secondo le istruzioni fornite dal produttore. Utilizzare anticorpo policlonale di coniglio all&#39;apoptosi-linked gene-2 ​​interagendo proteina X o ALIX e anticorpo monoclonale mouse per tumore gene di suscettibilità 101 proteine ​​o TSG101 nella rilevazione Western Blot. Quantificare la densità delle bande da open access software NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) oun programma simile. </li><li> Quantificare il numero di particelle exosome urinari ottenuti con un kit ELISA CD9 secondo le istruzioni del produttore. </li></ol>

<ol>
	<li>Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acids+within+urinary+exosomes/microvesicles+are+potential+biomarkers+for+renal+disease.">Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease.</a> Kidney Int. 78, 191-199 (2010).</li><li>Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+proteomic+profiling+of+exosomes+in+human+urine.">Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).</li><li>Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+quantitative+proteomics+strategy+for+protein+biomarker+studies+in+urinary+exosomes.">A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes.</a> Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).</li><li>Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+systems+biology+principles+to+protein+biomarker+discovery:+urinary+exosomal+proteome+in+renal+transplantation.">Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation.</a> Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).</li><li>Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+exosomes+in+urine.">Isolation and purification of exosomes in urine.</a> Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).</li><li>Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection,+storage,+preservation,+and+normalization+of+human+urinary+exosomes+for+biomarker+discovery.">Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery.</a> Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).</li><li>Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).</li><li>Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+proteomics+and+phosphoproteomics+of+urinary+exosomes.">Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes.</a> J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).</li><li>Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methods+for+isolation+of+urinary+microvesicles+to+identify+biomarkers+of+nephrotic+syndrome.">Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome.</a> Kidney Int. 78, 810-816 (2010).</li><li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+protein,+microRNA,+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers.">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li><li>Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+association+of+-667+aquaporin-2+(AQP-2)+A/G+promoter+polymorphism+with+the+incidence+and+clinical+course+of+chronic+kidney+disease+in+Korea.">Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea.</a> Renal Fail. 29, 693-698 (2007).</li></ol>

Spese di pubblicazione di questo articolo sono stati pagati da SBI Biosciences.

La maggior parte dei metodi che comportano la precipitazione di esosomi da urine non affrontano la rimozione della rete polimerica formata da proteina di Tamm-Horsfall (THP). Questa proteina è presente in grandi quantità nelle urine, dove intrappola putativamente esosomi durante iniziale centrifugazione a bassa velocità. Nel nostro metodo modificato abbiamo ridotto THP con DTT prima precipitazione exosome. Come mostrato in figura 2, una maggiore quantità di THP è stata osservata nelle urine non tra...

Esosomi urinari sono piccole vescicole interne di 100 nm di corpi multivescicolari (MVB) derivate da tutti i tipi di cellule in condizioni normali e patologiche nello spazio urinario compresi podocytes glomerulare, cellule tubulari renali e cellule che rivestono le sistemi di drenaggio urinario che sembrano essere arricchito per miRNA 1 -2. Molti ricercatori hanno rilevato proteine ​​distinte in esosomi isolate da urine di soggetti sani e quelli con renale e / o malattie sistematiche 3-5. Esosomi possono essere isolati con metodi diversi, come due fasi ultracentrifugazione differenziale con o senza saccarosio 6-7, combinando filtro nanomembrana con ultracentrifugazione 8-9, 10-11 o precipitazione. Abbiamo recentemente sviluppato un metodo semplice, veloce, scalabile ed efficace per isolare esosomi urinari e rilevare miRNA e biomarcatori proteici 11. Sebbene biomarker possono essere rilevati in una varietà di diversi fluidi biologici, urine è la scelta più conveniente per i pazienti con malattie del rene e del tratto urinario perché può essere ottenuta in grandi quantità in modo relativamente non invasivo. Anche se ci sono diversi metodi per isolare esosomi urinarie 6-11, la procedura più comunemente usato dipende ultracentrifugazione differenziale con un cuscino di saccarosio 30%. Mentre questo metodo è efficiente e la qualità dei exosomes risultanti isolati con questa procedura è alta, la tecnica si richiede personale specializzato ed è, richiede diversi passaggi ultracentrifugazione richiede tempo. Altri metodi, come la filtrazione e precipitazioni, sono stati sviluppati per l&#39;isolamento di esosomi, tra cui uno che utilizza un reagente di precipitazione proprietario (cioè, ExoQuick-TC: Biosciences System; Mountain View, CA). Anche se le precipitazioni usando questo reagente è veloce e relativamente facile, la purezza dei esosomi isolate è basso rispetto alla meth ultracentrifugazioneod. Recentemente abbiamo confrontato sei metodi per l&#39;isolamento di esosomi urinari, tra cui una modifica del metodo di precipitazione mediante ExoQuick-TC, che abbiamo sviluppato nel nostro laboratorio 11. Abbiamo scoperto che questo metodo di precipitazione modificato prodotto maggiori quantità di proteine, miRNA e mRNA e la procedura in sé era più veloce e più facile da implementare che ultracentrifugazione. Qui, descriviamo il protocollo sperimentale del nostro metodo di precipitazione modificato in modo graduale, e comprendono una discussione sui vantaggi e gli svantaggi di questa tecnica rispetto ad altri metodi di isolamento exosome. Il metodo di precipitazione modificato prevede una precipitazione iniziale di particelle exosome, seguita dalla rimozione di proteina di Tamm-Horsfall, che è correlato con le proteine ​​exosomal, e noto per ridurre exosome resa dalle urine. Abbiamo trovato che tali modifiche aumentato la resa e la purezza della preparazione exosomal dall&#39;urina.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="736">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:111px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning 15ml Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:111px;">Corning (Sigma Aldrich)</td>
			<td style="width:119px;">CLS430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:111px;">Sorvall</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DL-dithiothreitol</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9779</td>
			<td>used at final concentration of 200 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12 % Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td>For SDS-PAGE analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ECL Advance Western blotting detection kit</td>
			<td style="width:111px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">RPN2135</td>
			<td>For western blot detection of biomarkers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Exoquick-TC Reagent</td>
			<td style="width:111px;">System Biosciences (SBI)</td>
			<td style="width:119px;">EXOTC50A-1</td>
			<td>For exosome isolation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Exosome CD9 ELISA Complete Kit</td>
			<td style="width:111px;">System Biosciences (SBI)</td>
			<td style="width:119px;">EXOEL-CD9-A-1</td>
			<td>For exosome quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">80004</td>
			<td>For DNA, RNA, Protein isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rneasy MinElute Cleanup kit</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For Protein Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ProteoSilver Sliver Stain Kit</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PROTSIL1-1KT</td>
			<td>For staining SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For running the SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan microRNA assays</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For RT-PCR assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">qBasePlus v1.5 software</td>
			<td style="width:111px;">Biogazelle NV</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For analysis of RT-PCR assay data</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit polyclonal antibody to ALIX</td>
			<td style="width:111px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For western blot detection of biomarkers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse monoclonal antibody to TSG101</td>
			<td style="width:111px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For western blot detection of biomarkers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a modified precipitation method to isolate urinary exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

Esosomi urinarie trasportano proteine, miRNA e mRNA biomarcatori secreti dalle cellule epiteliali renali. L&#39;isolamento e la rilevazione di questi esosomi possono fornire un utile strumento diagnostico per la diagnosi precoce delle malattie renali come la nefropatia diabetica. Ci sono diversi metodi per l&#39;isolamento di esosomi da campioni di urina raccolti da soggetti umani. Abbiamo precedentemente confrontato sei metodi di isolamento urine exosome e studiato conseguente proteine, i livelli di mRNA e miRNA 1...

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A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Un metodo di precipitazione modificata per isolare urinaria Esosomi

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

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17.5K Views.  Translational Genomics Research Institute (TGen). This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.