Questo protocollo presenta il metodo per migliorare transitoriamente la funzione cardiaca nei topi di distrofia muscolare di Duchenne trapiantando l'esone derivato dalle normali cellule progenitrici miogeniche. Il trapianto esosomiale può migliorare la funzione cardiaca nei topi DMD in associazione con una maggiore espressione di distrofia nei cuori riceventi. Il metodo appropriato per l'isolamento, la purificazione e il trapianto intramiocardico dell'esone contribuisce al successo del trapianto di esone per migliorare la funzione cardiaca per i topi con distrofia muscolare di Duchenne.
La terapia esosoma derivata da MPC potrebbe migliorare la funzione muscolare scheletrica mediante il trasferimento di mRNA di distrofina normale mediato da esosomi. Questo video illustra le tecniche critiche per la purificazione esosoma, la consegna di esosomi intramiocardio e l'ecocardiografia post-trapianto. La dimostrazione di ecocardiografia sarà fatta da Yan Shen, tecnico del nostro laboratorio.
Per iniziare questa procedura, sementi cinque milioni di cellule C2C12 in un piatto di coltura di 15 centimetri con 20 millilitri di DMEM completo contenenti 10%FBS e antibiotici. Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. Successivamente, utilizzare un rotore a secchiello oscillante per fbs ultracentrifugo a 100.000 volte G e a quattro gradi Celsius per 18 ore per preparare il mezzo impoverito da esosomi.
Scartare il pellet e raccogliere il supernatante. Quando le cellule monostrato raggiungono l'80% di confluenza nel piatto di coltura, sostituire il DMEM completo con un mezzo impoverito da esosomi. Utilizzare una pipetta di trasferimento per raccogliere il supernatante dal piatto di coltura cellulare ogni 48 ore.
Centrifugare i tubi a 150 volte G per dieci minuti per rimuovere le celle rimanenti. Filtrare il supernatante attraverso un filtro da 0,22 micrometri per eliminare eventuali detriti cellulari e trasferire i tubi filtrati da medi a ultra-chiari. Successivamente, utilizzare un rotore a benna oscillante per far precipitare i tubi a 100, 00 volte G e a 4 gradi Celsius per 120 minuti per far precipitare gli esosomi.
Resuspend il pellet contenente esosomi in PBS e quindi riempire l'intero tubo ultra-trasparente con PBS. Ultracentrifugare questa sospensione a 100, 00 volte G e a 4 gradi Celsius per 120 minuti per eliminare le proteine contaminanti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet esosoma in 100 microlitri di PBS.
Conservare a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro. In primo luogo, fissare ogni mouse anestetizzato in posizione supina su una piattaforma chirurgica fissando ogni arto con nastro adesivo. Posizionare una sutura 3-0 orizzontalmente sotto i denti superiori per tenere la mascella superiore in posizione.
Quindi, applicare la crema depilatoria sul lato sinistro del petto del mouse per rimuovere l'abete dalla pelle. Utilizzando un catetere calibro 24, eseguire l'intubazione endotracheale attraverso la cavità orale. E utilizzare un ventilatore per roditori per ventilare il topo con aria ambiente ad una velocità di 195 respiri al minuto.
Disinfettare la pelle con il 70% di alcol e il 10% di iodio di povidone. Quindi fai un'incisione obliqua da 10 a 15 millimetri dal bordo sternale sinistro all'ascella sinistra. Usa le forbici per tagliare il pettorale maggiore e il pettorale minore.
E fare una toracotamia sinistra attraverso il quarto spazio intercoastale. Inserire delicatamente bande retrattili per diffondere la cavità toracica a una larghezza di 10 millimetri facendo attenzione a non danneggiare il polmone sinistro. Dopo questo, utilizzare due pinzette dritte per rimuovere il pericardio.
Separali e posizionali dietro le punte del riavvolgitore per esporre il cuore. Utilizzare un ago per insulina calibro 31 per iniettare MPC-Exo o PBS intramiocardially nella parete anteriore del ventricolo sinistro in un sito. Quindi, utilizzare 6-0 suture di nylon per chiudere la cavità toracica, i muscoli pettorali e la pelle, in sequenza.
Due giorni dopo il trapianto di esosoma PBS, anestetizza i topi come delineato nel protocollo di testo. Utilizzare il nastro adesivo per fissare un mouse in posizione supina e applicare il gel acustico preriscaldato sull'area sinistra del torace. Quindi, utilizzare l'ecocardiografia per valutare la funzione ventricolare sinistra.
Ottenere la vista parasternale dell'asse lungo del ventricolo sinistro in due dimensioni e quindi ruotare la sonda ad ultrasuoni di 90 gradi per ottenere una vista dell'asse corto del ventricolo sinistro a livello muscolare papillare. Successivamente, registrare le immagini ecocardiografiche in modalità M e misurare il diametro diastolico finale ventricolare sinistro, il volume sistolico finale ventricolare sinistro, il volume diastolico finale ventricolare sinistro e il volume sistolico finale ventricolare sinistro. La frequenza cardiaca dei topi deve essere controllata almeno 400 bpm per la funzione di misurazione cardiaca.
Dopo che gli esosomi sono stati isolati e purificati dalle cellule C2C12, la loro presenza è confermata utilizzando l'analisi della microscopia elettronica a trasmissione. L'immagine della microscopia elettronica a trasmissione mostra la morfologia delle vescicole luminose e a forma rotonda degli esosomi derivati dal C2C12. L'analisi western blot conferma la presenza di marcatori esosomi tra cui CD63 e Tsg101.
Un'area di edema traslucido si osserva dopo l'iniezione intramiocardica nella parete anteriore del ventricolo sinistro dei topi mdx che indica che l'iniezione nel miocardio ha successo. La colorazione immunofluorescente per la distroficina viene quindi eseguita per determinare se l'erogazione cardiaca di MPC-Exo ripristina l'espressione distrofina-proteina nei cuori mdx. Il ripristino parziale dell'espressione di distrofica si osserva con la localizzazione della membrana in alcuni cardiomiociti.
La funzione cardiaca è misurata mediante ecocardiografia due giorni dopo l'erogazione intramiocardica per determinare se la traslazione di MPC-Exo migliora la funzione cardiaca nei topi mdx. Il trattamento MPC-Exo è visto per migliorare il movimento della parete interna rispetto al PBS, suggerendo che il trapianto MPC-Exo ha migliorato la funzione cardiaca nei topi mdx. L'uso di un ago di insulina calibro 31 con la punta a circa 20 gradi è fondamentale per il successo per la consegna della maggior parte degli esosomi nel miocardio e massimizza l'esposizione di esosomi iniettati ai cardiomiociti ospiti.
Seguendo la procedura, l'espressione di distroficina può essere rilevata dopo iniezione esosoma derivata da MPC mediante colorazione immunofluorescente che indica che l'erogazione esosoma derivata da MPC cardiaco ripristina l'espressione distrofina-proteina. Questa tecnica aprirà la strada al trattamento della cardiomiopatia con materiali genetici terapeutici che trasportano esosomi tra cui DNA, mRNA, lncRNA o microRNA.
