La procedura di analisi e liste Streptomyces pellets da una due giorni di età coltura liquida-grown è schematicamente rappresentato in figura 1. Dettagli per il metodo sono riportati di seguito. 1. Crescita (compresa la preparazione dei Media e buffer) <ol><li> Preparare 1 L di 10x tampone fosfato salino (PBS; 80 g di NaCl, KCl 2 g, 14,4 g di Na 2 HPO 4, 2,4 g di KH 2 PO 4 in 1 L di acqua distillata portata a pH 7,4). Al momento dell&#39;uso aggiungere 100 ml di PBS 10x a 900 ml di acqua distillata per ottenere 1 L di PBS. </li><li> Preparare 1 L di mezzo YEME (3 g di estratto di lievito Difco, 5 g Bacto peptone, 3 g di estratto di malto Oxoid, 10 g di glucosio, 340 g di saccarosio, acqua distillata fino a 1 L) e 100 ml di 2,5 M MgCl 2. Sterilizzare entrambe le soluzioni in autoclave. Si noti che anche altri mezzi di Streptomyces possono essere usate 4,14. </li><li> Aggiungere 100 ml YEME medio e 0,2 ml di 2,5 M MgCl 2 a unsterile matraccio da 250 ml Erlenmeyer dotato di metallo avvolto molle. Preparare il maggior numero di palloni come campioni batterici per studiare. </li><li> Inoculare ciascuna beuta con 10 8 spore di Streptomyces per ottenere una concentrazione di spore di 10 6 spore / ml. Crescere i batteri per 2 giorni a 30 ° C agitando a 180 rpm. </li></ol> 2. Campionamento <ol><li> Trasferire 5 ml di campione da ciascuna coltura in una provetta Falcon da 15 ml usando una pipetta sterile 5 ml. Agitare delicatamente la cultura, tenendo il campione per assicurare che il campione sia rappresentativo di tutta la cultura. </li><li> Quando i campioni vengono analizzati immediatamente con COPAS senza passaggi di preparazione del campione sono necessari. Mantenere il campione su ghiaccio e procedere al passaggio 3.1 del presente protocollo. Quando i campioni sono analizzati in un punto secondo momento, fissare i pellets come descritto nei passaggi 2,3-2,5 di questo protocollo. Si noti che la fissazione impedisce anche la crescita dei batteri nel sistema tubo quando è ben pulito dopo Analyses. Assicurarsi che la fissazione con formaldeide non ostacola le analisi a valle. Per esempio, l&#39;RNA non poteva essere isolato dal pellet fungine dopo fissazione con formaldeide. Al contrario, l&#39;RNA è stato isolato con successo dopo fissazione con etanolo al 70% 12. </li><li> Aggiungere 600 ml di formaldeide al 37% a 5 ml di campione e miscelare invertendo il 3x tubo. Fissare i campioni in ghiaccio per 30 min. </li><li> Centrifugare i campioni a 2.500 xg in un rotore fissato a 4 ° C per 10 min. Rimuovere con attenzione il surnatante e lavare il pellet con 5 ml di PBS. </li><li> Ripetere passo 2.4 in modo che i granuli vengono lavate con PBS 2x. I campioni possono essere conservati in PBS a 4 ° C per diverse settimane. </li></ol> 3. Analisi COPAS <ol><li> Assicurarsi che il COPAS Inoltre, la pompa, il computer e il laser ad argon 488 nm siano accesi e avviare il software Biosort. Anche se acceso, il laser sarà ancora in modus standby. </li><li> Controllare se la bottiglia del liquido guaina è pieno e ilbottiglia di scarto è vuoto. </li><li> Fare clic su &#39;Start&#39; e poi &#39;RUN&#39; per cambiare il laser ad argon 488 nm dalla modalità standby a on. Dopo circa 60 secondi, quando il laser è acceso, fare clic su &#39;DONE&#39;. </li><li> Controllare i manometri. Le pressioni per &#39;guaina&#39;, &#39;campione&#39;, &#39;Sorter&#39; e &#39;pulito&#39; dovrebbe leggere intorno 4.0, 0.5, 2.7 e 10.9, rispettivamente. </li><li> Fare clic sulla casella di controllo accanto a &#39;OK Pressure&#39;. Il sistema, quindi, innesca la cella di flusso ed è pronto per l&#39;uso. </li><li> Le impostazioni standard sono assunti con &#39;Delay&#39; alle 11 e &#39;larghezza&#39; 7. Le soglie sono fissati a 50 per i &#39;segnali&#39; e 40 per &#39;TOF minimo&#39;, con TOF rappresenta il tempo di volo. (Per completezza: tutti i &#39;guadagni&#39; sono fissati a 1, il trigger è impostato su EXT (estinzione) e nella scheda &#39;Configuration&#39; sotto &#39;Scegli velocità di scansione&#39; 2.50 MHz viene scelto coincidenza è impostato su &#39;avanzata&#39;.). </li><li> Rimuovere l&#39;acqua rimanente dal una coppa campionid aggiungere 0.1 ml di campione Streptomyces dal punto 2.2 o 2.5 in tazza insieme con PBS (circa 50 ml). Assicurarsi che la coppa del campione sia chiuso correttamente. </li><li> Fare clic su &#39;Acquire&#39; per avviare la raccolta dei dati. Gestire la velocità del flusso di ottenere tra i 30-50 eventi al secondo. Se la portata è troppo alta, aggiungere PBS alla coppa campione. Se la velocità di flusso è troppo bassa, aggiungere più campione. </li><li> Quando almeno 2.500 eventi vengono raccolti click &#39;STOP&#39;. Per salvare &#39;Store&#39; tutti i dati di click e salvare il file per la successiva analisi statistica. Il software Biosort salva i dati in quattro file, di cui solo il file txt. Sarà utilizzata per la successiva analisi. </li><li> Pulire la coppa campione rimuovendo il campione con una siringa da 50 ml e lavaggio con acqua 2x. </li><li> Ripetere i passaggi 3,7-3,10 finché non vengono analizzati tutti i campioni. </li></ol> 4. Analisi dei dati <ol><li> Aprire il file txt. Ed eliminare dati con una EXT inferiore a 25 (utilizzando per esempio MS Excel). Questocorrisponde a detriti e frammenti di ife sciolti (per Aspergillus niger tutti i dati con un EXT inferiore a 150 vengono scartate) 4,12. Quindi, salvare tutti i Tof in una colonna in una pianura file (per molti file di dati può essere automatizzato in R linguaggio di programmazione, disponibile da: &#39;txt&#39;. <a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> ). </li><li> Assicurarsi SciLab (versione 5.3.2 o più recente da http://www.scilab.org/) viene installato insieme con la libreria &#39;fittools &quot;, che è disponibile, insieme al manuale, da: http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf </li><li> Avviare SciLab ed eseguire le funzioni necessarie della biblioteca fittools per modellare i dati. In breve: Installare la libreria fittools come indicato nel manuale (necessaria solo una volta). <ol><li> Caricare la libreria fittools. </li><li> Leggere i dati (file &#39;. Txt&#39;) in SciLab. </li><li>Log trasformare i dati (logaritmo naturale è la funzione log di default). </li><li> Montare il modello di 2 popolazioni ai dati. </li><li> Tracciare un grafico con l&#39;istogramma e il modello (opzionale). </li><li> Bootstrap i dati (1.000 repliche). </li><li> Montare il modello per i dataset bootstrap. </li><li> Ottenere la fiducia intervalli di stime dei 5 parametri. Questo fornirà informazioni sulla frazione partecipazione (p) delle popolazioni, i loro mezzi (2 μ 1 e μ 2) e le deviazioni standard allegate (α 1 e α 2). Inoltre, gli intervalli di confidenza al 95% sono determinate dal rimontaggio con il modello bootstrapping (1.000 repliche) 12,13,15. Quando gli intervalli di confidenza del mezzo non si sovrappongono e l&#39;intervallo di confidenza del p è tra 0,025-0,975 il set di dati può essere spiegata come una combinazione di due popolazioni di distribuzioni normali. (Nota thalla frazione partecipazione di piccoli pellet è p, mentre la partecipazione di grandi pellets è 1 -. p) La relazione tra TOF e il diametro di un pellet Streptomyces uguale 0,57 × TOF + 159 micron 4. </li></ol></li><li> Nel caso in cui due popolazioni si trovano impiego i Tof medi ordinamento parametri nel COPAS come superiore e limite inferiore per ordinare ulteriormente le piccole e grandi pellet. Si noti che anche altri parametri di selezione possono essere scelti a seconda delle esigenze dell&#39;utilizzatore. </li></ol> 5. Pellet ordinamento <ol><li> Caricare il campione Streptomyces che deve essere risolto come descritto al punto 3.7. </li><li> Impostare &#39;Ordinamento Limits&#39; e fornire dettagli sul minima (Lo) e massima (Hi) valori TOF. In alternativa, impostare una zona selezionando &#39;Regioni&#39; e poi &#39;Definisci Porta Regione&#39; per selezionare le palline con le dimensioni o le proprietà desiderate. </li><li> Posizionare un tubo da 50 mlraccogliere più palline che soddisfano i parametri di ordinamento. In alternativa, una piastra di micro-titolazione può essere utilizzato per ordinare singoli pellet. Sono necessari pellets multiple (10 4 -10 5) per il DNA e l&#39;estrazione delle proteine. Un singolo pellet è sufficiente per l&#39;analisi qPCR dell&#39;espressione genica, ma più pellets sono necessari per l&#39;RNA sequenziamento. </li><li> Decidere e impostare il numero di palline che devono essere ordinati e fare clic su &#39;Sort manuale&#39; per ordinare per i parametri selezionati. Quando viene raggiunta la quantità impostata di pellet, l&#39;ordinamento termina automaticamente. </li><li> Rimuovere rimasto campione con una siringa da 50 ml dalla coppa campioni e lavare la tazza con 2x acqua. Ripetere i passaggi 5,1-5,5 se altri campioni devono essere ordinati. </li><li> Prima di spegnere il COPAS sciacquare la tazza del campione con acqua per rimuovere i rimanenti pellet e pulire la coppa campioni con il 70% EtOH e / o 2% di ipoclorito in acqua. Eseguire un campione di acqua clorata per pulire l&#39;intero sistema e ripetere questo con acqua. Empty tegli traboccare contenitore e pulire o sostituire il filtro che risiede in questo contenitore. </li><li> Al termine, fare clic su &#39;STOP&#39; per rilasciare la pressione dal sistema. Quando il motore si ferma chiudere il programma e fare clic su &#39;arresto senza rimuovere&#39;. Quindi spegnere il computer, il COPAS, il laser, e la pompa. </li></ol>

<ol>
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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Citometria a flusso ha permesso l&#39;analisi ad alta velocità di un gran numero di singole cellule, che ha contribuito alla nostra comprensione di eterogeneità nelle popolazioni clonali 6. Citometria a flusso regolare non è fattibile per l&#39;analisi del pellet miceliali pluricellulari di streptomycetes e funghi. Il nostro lavoro ha dimostrato che l&#39;analisi high-throughput del pellet Streptomyces è fattibile utilizzando COPAS. La procedura descritta qui è semplice, veloce e altamente riproducibile. Il parametro fondamentale tenere a mente durante il funzionamento dello strumento è la velocità di flusso, che non deve superare i 100 eventi / sec (passo 3.8 del presente protocollo). Se la concentrazione pellet, e quindi anche la velocità del flusso, diventa troppo elevata, i valori TOF vengono calcolati correttamente, poiché lo strumento non rileva singoli pellet. Sufficientemente diluizione del campione con l&#39;aggiunta di PBS supera questo problema. Limitazioni L&#39;uso COPAS più<html> d qui ha un diametro dell&#39;ugello di 1 mm, che è adatto per misurare particelle con una dimensione che vanno 30-700 micron. Questo ugello consente pertanto pellets formate da streptomycetes misurazione. Nel caso dei funghi filamentosi micro-colonie possono essere più grandi, che limita l&#39;applicabilità generale del COPAS Plus.. Il COPAS XL può misurare particelle fino a 1.500 micron di dimensione ma la sua sensibilità nella gamma inferiore di diametro è inferiore rispetto a quella del COPAS Plus.. Sia il COPAS Plus e il COPAS XL non è in grado di analizzare le particelle di dimensioni inferiori a 30 micron. Ciò implica che le singole spore microbiche o cellule non possono essere analizzati. Inoltre, il COPAS non può analizzare con precisione piccoli aggregati di spore e cellule o le piccolissime micro-colonie. Per questo, devono essere utilizzati analizzatori di cellule normali. Questa limitazione viene superata dalla Biosorter di Union Biometrica capace di analizzare particelle nell&#39;intervallo 1-1,500 micron. Il premio acquisto è comunque alto. t &quot;&gt; Risoluzione dei problemi Il COPAS è uno strumento robusto che è facile da usare. Tuttavia, a volte pellet non vengono rilevate dopo il caricamento di un campione nella tazza campione e iniziare la misurazione. La causa è in genere un tubo di entrata intasato, che può essere facilmente risolto premendo il comando &#39;pulito&#39;. Questo forzerà il pellet indietro dal sistema di tubi nella tazza campione. Un motivo in alternativa potrebbe essere che il coperchio non è posizionato correttamente sulla tazza del campione. Questo porta alla perdita di pressione e la mancata concomitante per rilevare pellets. Significato e direzioni future Abbiamo qui concentrati sull&#39;analisi della dimensione pellet ma l&#39;installazione COPAS è anche in grado di analizzare e liste basato su fluorescenza e densità. Rivelazione della fluorescenza consente di analizzare l&#39;espressione genica basato su reporter come GFP. Inoltre, la composizione di cellule può essere valutata. Ancora più potente è la possibilità di separare pellets in base a questi parametriTERS. Pellets ordine possono essere utilizzati per le analisi a valle, compresi tutti-omiche studi. Infatti, abbiamo già risolto 60.000 grandi e 200.000 piccole palline, e dimostrato che il proteoma era significativamente differente tra grandi e piccole palline 4. Questa tecnologia fornisce dunque nuovi contatti per migliorare streptomycetes come fabbriche di cellule. Il vantaggio principale della tecnologia COPAS è il tempo. Precedenti studi sulla pellet cellulari sono stati eseguiti utilizzando la microscopia, e questo limita il numero di pellet che possono essere analizzati fino a diverse centinaia 16. Studi di microscopia già suggerito l&#39;esistenza di due popolazioni di pellets in Streptomyces colture liquide cresciuto 16. Infatti, due popolazioni di pellet sono stati rilevati, indipendentemente dalle condizioni di coltura in un gran numero di differenti streptomycetes 4. Questa eterogeneità dimensione non è limitata a streptomycetes filamentosi, ma è stata osservata anche in funghi filamentosi 12 &lt;/ Sup&gt;. In tutti i casi, i meccanismi alla base della eterogeneità non sono ancora noti. La possibilità di ordinare pellet in base alle dimensioni e fluorescenza ci permette di svelare tali meccanismi.

Streptomycetes sono batteri filamentosi suolo che sono ben noti per la loro abilità a rendere antibiotici, nonché composti che possono essere usati come immunosoppressori o per combattere le infezioni fungine o 1,2 cancro. Inoltre, questi organismi producono enzimi che sono di interesse per una vasta gamma di applicazioni industriali 3. La maggior parte di questi composti commercialmente interessanti sono prodotte in bioreattori. Crescita di streptomycetes in bioreattori è caratterizzata dalla formazione di strutture complesse di ife interconnesso, noti come grumi o pellet. Queste strutture multicellulari sono molto eterogenei rispetto alle dimensioni 4 e possono raggiungere dimensioni che sono più di un milione di volte più grande di un batterio unicellulare come Escherichia coli o Bacillus subtilis. Sebbene eterogeneità è considerato come un tratto utile in sistemi biologici naturali 5, è considerato un trabocchetto produzione nel settore. Biocoltivazioni reattori devono essere riproducibile e controllabile per ottenere i massimi rendimenti possibili. Una comprensione dettagliata del ruolo di ciascuno dei tipi di pellet in un bioreattore è quindi fondamentale migliorare streptomycetes come fabbriche. La citometria a flusso è comunemente usato per analizzare le singole celle di una popolazione 6. Citofluorimetri possono acquisire informazioni multiparametrica simultaneamente caratteristiche delle cellule (come le dimensioni, la densità e multicolore fluorescenza) di misura. In questo modo, le proprietà della cella possono essere correlati contribuendo in tal modo alla nostra comprensione di eterogeneità all&#39;interno di una cultura e l&#39;esistenza di distinte popolazioni di cellule 6. Strumenti più specializzati hanno reso possibile ordinare le celle in base a parametri definiti dall&#39;utente. Per esempio, i mutanti possono essere sottoposti a screening. A seguito di ordinamento, tali cellule mutanti possono essere coltivati ​​per un&#39;ulteriore caratterizzazione. Questo ha già dimostrato di essere utile, tra l&#39;altro,per migliorare la produttività dei ceppi 7,8. Gli ugelli di citofluorimetri tipicamente consentono il passaggio di cellule con un diametro massimo di circa 10 micron. Pertanto, pellets di streptomycetes non possono essere analizzati con citofluorimetri regolari. Essi, tuttavia, possono essere analizzati con l&#39;oggetto complesso Parametric Analyzer e Sorter (COPAS). Come citofluorimetri regolari, COPAS può acquisire i dati multiparametrici di particelle in un alto modo di throughput. A seconda del tipo di COPAS 10-1,500 micron particelle di dimensioni possono essere analizzati. Inoltre, permette di classificare delle singole particelle che possono essere usati per la coltivazione o analisi a valle, come l&#39;isolamento di DNA, RNA, o proteine. COPAS è stato inizialmente progettato per l&#39;analisi e la cernita di piccoli organismi pluricellulari, come il nematode Caenorhabditis elegans 9, e degli embrioni di Drosophila e larve 10. Gli strumenti sono stati utilizzati anche per zebrafish 11 bisnd per funghi filamentosi 12,13. Questi ultimi organismi formano anche pellets miceliali che sono anche più grandi di quelle formate da batteri filamentosi. Abbiamo recentemente dimostrato che l&#39;uso di COPAS è anche fattibile per streptomycetes 4. Siamo qui descriviamo la procedura sperimentale per l&#39;utilizzo dei COPAS per valutare pellet eterogeneità Streptomyces coelicolor, compresi i dettagli sulla metodologia per ordinare pellet in base alle dimensioni. Si prega di notare, tuttavia, che questo metodo può essere utilizzato anche per l&#39;analisi di altri streptomycetes-pellet formatura.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Copas PLUS</td>
			<td style="width:183px;">Union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">PLUS</td>
			<td style="width:479px;">Large particle flow cytometer including lasers and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>210933</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid Malt Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OXLP0039B</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Media components. Add after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:212px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td style="width:479px;">Fixation of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hypochlorite Solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71696</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EtOH</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20816.367</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:212px;">Erlenmeyer Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td>214-1132</td>
			<td>Culture flask for growing Streptomyces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Springs</td>
			<td style="width:183px;">Verenfabriek De Spiraal</td>
			<td style="width:119px;">Custom-Made</td>
			<td>Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sterile Centrifuge Tube (15 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Syringes (50 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>Z683698&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter

Streptomycetes sono batteri filamentosi suolo che vengono utilizzati nell&#39;industria per la produzione di enzimi e antibiotici. Quando coltivate in bioreattori, questi organismi formano reti di ife interconnesso, noto come pellet, che sono varie per dimensione. Qui si descrive un metodo per analizzare e pellets ordinamento miceliali utilizzando un complesso di oggetti parametrici Analyzer e Sorter (COPAS). Istruzioni dettagliate sono presenti per l&#39;uso dello strumento e l&#39;analisi statistica dei dati di base. Abbiamo, inoltre, descrive come pellet possono essere ordinati in base alle impostazioni definite dall&#39;utente, che permette l&#39;elaborazione a valle, come l&#39;analisi del RNA o contenuto proteico. Utilizzando questa metodologia il meccanismo di base la crescita eterogenea può essere affrontato. Ciò sarà determinante per migliorare streptomycetes come una fabbrica di cellule, considerando il fatto che la produttività correla con dimensioni pellet.

Misure COPAS di pellet Streptomyces Streptomycetes formano pellets miceliali in colture liquide che hanno una vasta gamma di formati. Per analizzare distribuzione dimensionale pellet, un liquido di 2 giorni di età coltivate cultura Streptomyces coelicolor è stato sottoposto a grande flusso di particelle citometria utilizzando un COPAS Plus. Profiler munita di un ugello ad 1 mm. Un tipico output COPAS è un grafico a dispersione, come visualizzato in figura 2A. L&#39;asse x rappresenta il tempo di volo (TOF), che è correlato con la dimensione pellet (cioè ci vuole più tempo per pellet di grandi dimensioni per passare il raggio laser). L&#39;asse y indica l&#39;estinzione, che rappresenta la densità ottica dell&#39;oggetto. Ogni punto nel diagramma di dispersione corrisponde ad un singolo evento, cioè un singolo pellet passare il raggio laser. È importante sottolineare che, quando il campione è troppo concentrato (cioè quando il laser rileva più di 100 eventi / sec), il COPAS spesso non riesce a rilevare singole pellets. Questo porta a valori TOF falsi troppo elevati. Diluizione del campione riduce i valori medi TOF, fino ad un punto in cui un&#39;ulteriore diluizione fa alcun impatto più TOF. Questo punto è raggiunto quando circa 100 pellets / sec stati analizzati. Rappresentare i punti di dati in un istogramma indica che le dimensioni non sono distribuiti normalmente (Figura 2B). La distribuzione sembra essere inclinato verso destra. Entra trasformando il set di dati, inoltre, non ha portato ad una distribuzione normale (Figura 2C). Per valutare se la distribuzione delle dimensioni può essere spiegato assumendo una miscela di due distribuzioni normali i dati sono stati matematicamente modellato 12,15. Modeling infatti indicato che la distribuzione delle dimensioni può essere spiegato assumendo l&#39;esistenza di due distinte popolazioni di pellets. La frazione di piccole palline consisteva di 92% di tutti i pellet con una dimensione media di 248 micron, mentre la popolazione di grande pelconsente (8% di tutte le pellet) ha una dimensione media di 319 micron (notare che due popolazioni si presume sussistere quando la frazione di partecipazione è compresa tra 2,5-97,5%). Ordinamento di pellet Streptomyces in base alle dimensioni Micro-colonie delle popolazioni di grandi e piccoli pellet sono stati ordinati. A tal fine, le dimensioni medie pellet delle due popolazioni sono stati usati per definire i confini per l&#39;ordinamento. Pellets di dimensioni inferiori a 248 micron sono stati considerati dalla piccola popolazione pellet, mentre pellets di dimensioni superiori a 319 micron sono stati considerati dal grande popolazione pellet (Figura 3), in modo da limitare l&#39;ordinamento di pellets dalla sovrapposizione delle due dimensioni distribuzioni. Analisi microscopica di pellet ordinati mostrato le loro dimensioni distinte (Figura 3). I pellets raccolti possono essere ulteriormente utilizzati per DNA, RNA, proteine ​​o isolamenti. &lt;img alt = &quot;Figura 1&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Rappresentazione schematica del setup sperimentale per misurare e analizzare pellets Streptomyces utilizzando COPAS. Per dettagli, vedere le procedure sperimentali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> Figura 2. Dimensione Pellet eterogeneità di culture Streptomyces liquido cresciuto. Analisi COPAS di un 2-day-old S. cultura coelicolor YEME (A) indica che le dimensioni pellet (indicati come Time of Flight) sono valori normalmente non distribuired (B), e non diventi così quando log-trasformato (C). Invece, sono stati rilevati due popolazioni di pellet che si differenziano per TOF (e quindi di dimensioni). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> Figura 3. Frazionamento di pellet Streptomyces a seconda delle dimensioni. Pellet con dimensioni inferiori a 248 micron (indicata in rosa) sono stati considerati piccoli pellet, che pellet con una dimensione maggiore di 319 micron (indicato in blu) sono stati considerati grandi pellet. Analisi microscopica confermato la differenza di dimensioni. Si noti che queste misure sono state calcolate a partire dai dati di log-trasformati utilizzando la relazione descritta tra TOF e il diameter di un pellet Streptomyces, che equivale a 0,57 × TOF + 159 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a>

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Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Colture Streptomyces liquidi coltivati ​​sono caratterizzati da pellet miceliali che sono eterogenei in termini di dimensioni. Siamo qui descrive un metodo per analizzare e ordinare tali pellets in maniera high-throughput. Questi pellet possono essere utilizzati per ulteriori analisi, che fornirà porta a comprendere e controllare la crescita eterogeneità.

Ordinamento dei<em&gt; Streptomyces</em&gt; Pellet cella utilizzando un complesso di oggetti parametrici Analyzer e Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

10.9K Views.  Leiden University.  Colture Streptomyces liquidi coltivati ​​sono caratterizzati da pellet miceliali che sono eterogenei in termini di dimensioni. Siamo qui descrive un metodo per analizzare e ordinare tali pellets in maniera high-throughput. Questi pellet possono essere utilizzati per ulteriori analisi, che fornirà porta a comprendere e controllare la crescita eterogeneità. 

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A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

Un multi-parametrica Perifusion Sistema isolotto all&#39;interno di un dispositivo Perifusion Microfluidic

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Ricerca

Biologia

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescenza separazione delle cellule attivate delle protoplasti impianto

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Vescicole lipidiche-mediata Cromatografia di affinità mediante Magnetic separazione delle cellule attivate (LIMACS): un nuovo metodo per l&#39;analisi delle interazioni proteina-lipide

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Cella di analisi specifica di<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Foglie usando fluorescenza activated cell sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Ottimizzato Metodi di modellazione e colorazione proliferazione per il monitoraggio divisione cellulare utilizzando coloranti Tracking Cellulari

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Analisi singola particella open-source per Super-risoluzione Microscopia con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza per l'isolamento delle popolazioni cellulari Scleractiniane

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, prevent fracture. In the interest to both optimize peak bone mass and combat various musculoskeletal diseases (i.e., post-menopausal osteoporosis, anorexia nervosa, type 1 and 2 diabetes mellitus), incredible efforts have been made in the field of bone biology to fully characterize osteoblasts throughout their differentiation process. Given the primary role of mature osteoblasts to secrete matrix proteins and mineralization vesicles, it has been noted that these processes take an incredible amount of cellular energy, or adenosine triphosphate (ATP). The overall cellular energy status is often referred to as cellular bioenergetics, and it includes a series of metabolic reactions that sense substrate availability to derive ATP to meet cellular needs. Therefore, the current method details the process of isolating primary, murine bone marrow stromal cells (BMSCs) and monitoring their bioenergetic status using the Real-time cell metabolic flux analyzer at various stages in osteoblast differentiation. Importantly, these data have demonstrated that the metabolic profile changes dramatically throughout osteoblast differentiation. Thus, using this physiologically relevant cell type is required to fully appreciate how a cell's bioenergetic status can regulate the overall function.

Real-time cell metabolic flux assay measures the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate, which corresponds to mitochondrial and glycolytic adenosine triphosphate production, using pH and oxygen sensors. The manuscript explains a method to understand the energy status of osteoblasts and the characterization and interpretation of the cellular bioenergetic status.

Utilizzo dell'analizzatore di flusso metabolico cellulare in tempo reale per monitorare la bioenergetica degli osteoblasti

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids potential pitfalls caused by the heterogeneity of tissues and unleashes the powerful transcriptome analysis. The protocol described here demonstrates how to use the Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) method to isolate ribosome-bound RNAs from a small amount of EGFP-expressing cells in a complex tissue without cell sorting. This protocol is suitable for isolating cell-type-specific RNAs using the recently available NuTRAP mouse model and could also be used to isolate RNAs from any EGFP-expressing cells.

This protocol aims to isolate cell-type-specific translating ribosomal mRNAs using the NuTRAP mouse model.

Isolare RNA specifici del tipo di cellula da campioni di tessuto eterogeneo congelati a scatto senza selezione cellulare

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...