Questo lavoro è sponsorizzato dal Lupus Research Institute (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 e NIH UL1-TR00165. Ringraziamo il Dott. Robert P. Kimberly per il suo continuo sostegno.

Tutti i donatori reclutati per questo studio hanno dato il consenso informato scritto e lo studio è stato approvato dalla University of Alabama a Birmingham Institutional Review Board. 1. HUVEC Cultura iniziale e Subculture <ol><li> La cultura umana vena ombelicale cellule endoteliali (HUVEC) in vitro in terreno di crescita completo che si compone di cellule endoteliali medio basale (vedere elenco dei materiali) supplementato con fattori di crescita delle cellule endoteliali. Nota: I fattori di crescita utilizzati in questo studio sono: 5 ng / ml ricombinante umano Epidermal Growth Factor (hEGF), 1,0 mg / ml di idrocortisone, 50 mg / ml di gentamicina e 50 ng / ml di amfotericina B-(GA-1000), 2 % siero fetale bovino (FBS), 0,5 ng / ml Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), crescita dei fibroblasti fattore-base con eparina (hFGF-B), Fattore 10 ng / ml umano 20 ng / ml ricombinante umano Insulin-like Growth ( R 3-IGF-1), 1 mg / ml di acido ascorbico, e 22,5 mg / ml di eparina. Il terreno completoviene preparato inizialmente a 37 ° C e poi può essere conservato a 4 ° C per l&#39;uso entro 1 mese di preparazione. </li><li> Per preparare un pallone di cellule, terreno di coltura completo viene aggiunto a un pallone di coltura tissutale 75 centimetri 2 (1 ml / 5 cm 2) e quindi il pallone viene lasciato equilibrare a 37 ° C / 5% di CO 2 in un incubatore umidificato per almeno 30 min. HUVEC umana saranno seminate direttamente nella stessa beuta cultura equilibrata ad una densità di 2.500-5.000 cellule / cm 2. </li><li> Mentre i media si equilibrante, scongelare rapidamente il esageratamente magazzino HUVEC in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Disperdere le cellule nel flaconcino archiviazione originale vortex e poi aggiungere direttamente nel pallone di coltura contenente il terreno di coltura completo pre-equilibrata HUVEC a raggiungere una densità di 2.500-5.000 cellule / cm 2. Agitare delicatamente il pallone per distribuire uniformemente le cellule e quindi restituire il pallone al incubatrice. Queste cellule rappresentano oggi il passaggio 1 °. </li> &lt;li&gt; Piano dovrebbe essere cambiato ogni due giorni fino a quando le cellule sono 70-80% confluenti. </li><li> Il HUVECs ora può essere raccolto dal pallone di coltura con tripsina / EDTA. Il mezzo di coltura viene aspirato dai palloni di coltura seguita da un risciacquo PBS per rimuovere eventuali residui di proteine ​​e calcio dalle cellule. Un 0,25% soluzione di tripsina-EDTA viene aggiunto ed entro 2-6 minuti il ​​distacco delle cellule dovrebbe essere evidente come valutato mediante microscopia ottica. </li><li> Quando il 90% delle cellule sono arrotondati dal piatto, fermare la tripsinizzazione aggiungendo un volume uguale di inibitore della tripsina 2x. Per facilitare la raccolta di cellule, aggiungere un&#39;altra uguale quantità di terreno di coltura completo. Trasferire le cellule staccate a una sterile provetta da centrifuga da 15 ml. </li><li> Centrifugare le cellule staccate a 225 xg per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e quindi risospendere le cellule in 2-3 ml di terreno di coltura completo. Determinare la concentrazione e la vitalità cellulare utilizzando un emocitometro e Trypan Blue. </li><li> Per utilizzare the raccolte le cellule di studio, ri-seme di ulteriori 75 centimetri 2 palloni con cellule ad una densità di 10.000 cellule / cm 2 e passare al punto 2.2. In alternativa, le cellule possono essere congelate a questo punto per studi futuri. Per il congelamento delle cellule, agglomerare le cellule per centrifugazione a 225 xg per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il sopranatante e risospendere il pellet di cellule in FBS contenente 10% DMSO ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml. La sospensione cellulare viene quindi trasferito cryovials e conservato a -80 ° C dopo il congelamento delle cellule in un contenitore cella di congelamento. </li></ol> 2. Preparazione HUVEC Strato <ol><li> L&#39;uso di surgelati HUVECs passaggio 2 °: rinascita e della cultura. Se si utilizza cellule in attiva crescita, passare al punto 2.2. <ol><li> Scongelare il esageratamente contenente 2 HUVECs passaggio ° dal punto 1.8 rapidamente in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Trasferire le cellule dal esageratamente a 15 ml tubo da centrifuga sterile e aggiungere 10 ml di crescita medium. </li><li> Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il surnatante per rimuovere il DMSO residuo. </li><li> Risospendere il pellet di cellule con mezzo di crescita completo e trasferire le cellule in un pallone da 75 centimetri 2. Aggiungere mezzo di crescita per un volume totale di circa 20-25 ml ed incubare a 37 ° C / 5% di CO 2. </li></ol></li><li> Esaminare visivamente la coltura cellulare per confluenza ogni giorno con materiale varia ogni due giorni. Di solito entro 2-4 giorni, le cellule raggiungeranno 80-90% di confluenza momento in cui saranno pronti per l&#39;uso nel saggio camera di flusso. </li><li> Per preparare il piatto di coltura che verrà utilizzato nella camera di flusso (vedere Sezione 5), aggiungere 1 ml di 10 mg / ml di fibronectina e 0,05% (w / v) di gelatina in una piastra di coltura tissutale a 35 mm e pipetta diverse volte per assicurarsi che l&#39;intera superficie della piastra è rivestita. Rimuovere la fibronectina e gelatina soluzione eccessivo e asciugare la piastra per almeno 30 min per ottimizzare la formazione della matrice proteica. Il fibronectin e la gelatina soluzione può essere riutilizzato fino a 10x. </li><li> Raccogliere le cellule HUVEC dal punto 2.2 utilizzando tripsina-EDTA come descritto nei passaggi 1,5-1,7. Seed 500.000 celle in ogni piatto di coltura di tessuti spalmati. Aggiungere 2 ml di mezzo di crescita in ogni piatto e incubare a 37 ° C / 5% di CO 2. </li><li> Consentono alle cellule di crescere a confluenza come al punto 2.2. Le cellule devono essere ispezionati visivamente tutti i giorni con i cambiamenti di media ogni due giorni. Prima del saggio camera di flusso, il primo HUVEC con 20 ng / ml di TNF-α umano per 4-6 ore a upregulate e stimolare adesione espressione molecola. </li></ol> 3. Purificata Ligand Coating <ol><li> Disegnare un cerchio di 0,5 cm di diametro con un pennarello o penna al centro di un piatto di coltura tissutale da 35 mm. </li><li> Piastre 20 ml di 20 mg / ml di proteina A nella zona segnata. Utilizzare la punta della pipetta per diffondere la proteina Una soluzione per coprire l&#39;intera area all&#39;interno del cerchio di diametro 0,5 centimetri. È importante non toccare o graffiare la superficie del dish. Incubare a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Lavare le proteine-A 3x piastra ricoperta con 1 ml di PBS (pH 8.0). </li><li> Tavola 50 microlitri 1% BSA nella zona indicata per bloccare un legame non specifico sulla piastra. Incubare per 2 ore a 4 ° C. </li><li> Lavare le piastre 3x bloccati con 1 ml di PBS come nella fase 3.3. </li><li> Preparare i Fc-adesione recettore ligando soluzioni di proteine ​​chimeriche per il rivestimento. In questo esperimento, una soluzione ICAM-1/Fc chimera a 25 ug / ml e un P-Selectin/Fc chimera a 0.5 mg / ml in PBS (pH 8,0) è stato utilizzato. </li><li> Cappotto l&#39;area contrassegnata con 50 ml di substrato. Incubare una notte a 4 ° C. Il piatto deve essere utilizzato entro due giorni e la zona rivestita non dovrebbe essere permesso di asciugare. Aggiungere PBS se necessario, per mantenere la soluzione 50 microlitri sulla piastra. </li></ol> 4. Separazione dei neutrofili (Tutti i passi eseguiti a temperatura ambiente) <ol><li> Dopo aver ottenuto il consenso informato, raccogliere il sangue partecipante da salasso in unn anticoagulante tubo di raccolta sangue o vacutainer (EDTA o eparina). Dopo la raccolta del sangue, diluire il sangue 1:1 con PBS prima della separazione. </li><li> Preparare uno strato di due Ficoll per separare PBMC e neutrofili in 50 ml provette da centrifuga. Primo aggiungere 15 ml di Ficoll pesante (vedere elenco dei materiali, ρ = 1,118-1,120), e poi strato cura 10 ml luce Ficoll (vedere elenco dei materiali, ρ = 1,077-1,080) sulla parte superiore del pesante Ficoll. Ci dovrebbe essere un netto confine tra Ficoll luce e strati Ficoll pesanti. Infine, sovrapporre accuratamente 25 ml del campione di sangue diluito in cima al Ficoll luce senza disturbare lo strato di Ficoll. </li><li> Centrifugare la provetta a 250 xg per 30 min a temperatura ambiente. Nota: Il freno rotore della centrifuga deve essere spento per questi giri per minimizzare potenziali perturbazioni della separazione cellulare durante rotore decelerazione al termine della centrifugazione. Dopo la centrifugazione, i seguenti strati (dall&#39;alto al basso) sono presenti: lo strato superiore è il Follo plasmawed dallo strato PBMC sulla parte superiore dello strato Ficoll luce, lo strato neutrofili con pochi globuli rossi (RBC) è tra la luce e pesante Ficoll seguita dal livello Ficoll pesante e globuli rossi nella parte inferiore del tubo. </li><li> Raccolto e trasferire lo strato neutrofili in un nuovo tubo 50 ml con una pipetta di trasferimento, aggiungere PBS ad un volume finale di 50 ml e centrifugare a 225 xg per 10 min a temperatura ambiente. <ol><li> Dopo la centrifugazione, ci possono essere ancora globuli rossi mescolati con i neutrofili. Aspirare il surnatante verso il basso fino alla tacca 10 ml. Risospendere il pellet neutrofilo-RBC da lieve agitazione del tubo (o una breve vortex a bassa velocità) e poi lavare nuovamente con 50 ml di PBS. </li></ol></li><li> Dopo il secondo lavaggio, aspirare il supernatante. Per rimuovere i globuli rossi contaminanti, risospendere le cellule pellet nel residuo PBS mediante agitazione (o corto vortex), aggiungere 25 ml di H 2 O e vortex delicatamente per 10 secondi per la lisi RBC. <ol><li> Aggiungere 25 ml di 1.8% NaCl e mescolare subitomediante centrifugazione a 225 xg per 10 min a temperatura ambiente. La RBC contaminanti dovrebbe essere lisato lasciando un bianco pellet di cellule neutrofili. </li></ol></li><li> Lavare il pellet di cellule neutrofili con PBS. </li><li> Risospendere le neutrofili isolate in mezzo RPMI con 10% FBS e determinare la concentrazione cellulare al microscopio luce con un emocitometro. </li><li> Regolare la densità cellulare a 500.000 cellule / ml con completo RPMI-10% FBS medie. </li></ol> 5. Flusso Camera Adesione saggio <ol><li> Montare la camera di flusso. Posizionare il piatto 35 millimetri contenente le HUVEC confluenti o ligandi del recettore adesione purificate sul tavolo microscopio. Collegare la camera di flusso piastra parallelo con pompa a siringa, sistema di aspirazione e lasciare una linea aperta per l&#39;ingresso dei neutrofili. Inserire la camera di flusso sulla parte superiore della piastra e fissare il gruppo di camera di flusso 13. (Vedi figura 1) </li><li> Avviare il programma di registrazione video sul computer collegato to il microscopio. Regolare il campo e messa a fuoco del microscopio fino a quando un campo libero con le cellule HUVEC completamente sviluppati o in un campo all&#39;interno della regione di rivestimento ligando è visibile. </li><li> Utilizzando la pompa a siringa, sciacquare la camera di flusso con RPMI. Assicurarsi che non vi siano bolle d&#39;aria all&#39;interno della camera o la linea di ingresso dei neutrofili. </li><li> Se lo si desidera, i neutrofili possono essere trattate con basse dosi (10 -8 M) fMLP per 10 min. Questo consentirà una corrispondenza del livello basale di attivazione dei neutrofili tra diversi donatori 14. </li><li> Utilizzare la pompa a siringa per iniettare i neutrofili nella camera di flusso a velocità definite (una velocità di 350 ml / min, il che equivale a una sollecitazione di taglio di 1,5 dyne / cm 2 è usato in questo studio). Registrare il video. Poiché neutrofili può avvenire rapidamente, un video con una lunghezza di 4-5 min è generalmente sufficiente per quantificare gli eventi di adesione per l&#39;analisi. </li><li> Una cella aderente è definita come una cellula che si muove meno del diametro di cellaentro 5 secondi sul HUVEC o ligando superficie rivestita 15,16. Contare il numero totale di cellule aderenti nel campo presente nel video registrato utilizzando questa regola. Con la registrazione di video di lunghezza simili con neutrofili diversi donatori, si può calcolare l&#39;aderente cellule / min per confrontare le proprietà di adesione tra i diversi donatori. </li></ol>

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	<li>Harley, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+scan+in+women+with+systemic+lupus+erythematosus+identifies+susceptibility+variants.">Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants.</a> in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+ICAM1-ICAM4-ICAM5+Locus+Is+Associated+with+Systemic+Lupus+Erythematosus+Susceptibility+in+Multiple+Ancestry+Populations.">Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations.</a> Ann. Rheum. Diseases. 71 (11), 1809-1814 (2012).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+leukocyte+recruitment+in+the+inflammatory+process.">Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process.</a> Cardiovasc. Res. 32 (4), 733-742 (1996).</li><li>Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neutrophil-endothelial+cell+adhesion+in+inflammatory+disorders.">Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders.</a> J. Crit. Care. 9 (1), 47-71 (1994).</li><li>Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+and+inflammatory+injury.">Adhesion molecules and inflammatory injury.</a> FASEB J. 8 (8), 504-512 (1994).</li><li>Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+of+LFA-1+and+Mac-1+with+intercellular+adhesion+molecule-1+in+facilitating+adherence+and+transendothelial+migration+of+human+neutrophils+in+vitro.">Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro.</a> J. Clin. Invest. 83 (6), 2008-2017 (1989).</li><li>Marlin, S. D., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+intercellular+adhesion+molecule-1+(ICAM-1)+is+a+ligand+for+lymphocyte+function-associated+antigen.">Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen.</a> Cell. 51 (5), 813-819 (1987).</li><li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates:+Distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins.">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65 (5), 859-873 (1991).</li><li>Smith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+steps+involved+in+the+transition+to+stationary+adhesion+of+rolling+neutrophils:+A+brief+review.">Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review.</a> Microcirculation. 7, 385-394 (2000).</li><li>Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+construction+of+a+linear+shear+stress+flow+chamber.">Design and construction of a linear shear stress flow chamber.</a> Ann. Biomed. Eng. 21 (1), 77-83 (1993).</li><li>van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+a+parallel-plate+flow+chamber+for+studying+cellular+adhesion+to+solid+surfaces.">Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces.</a> J. Biomed. Mater. Res. 26 (6), 725-738 (1992).</li><li>Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+flow+in+the+parallel+plate+flow+chamber:+Implications+for+cell+capture+studies.">Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies.</a> Biophys. J. 67, 889-895 (1994).</li><li>Kucik, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Adhesion+Under+Flow+Conditions.">Measurement of Adhesion Under Flow Conditions.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 9.6.1-9.6.10 (2003).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Lupus+Associated+ITGAM+Variants+Alter+Mac-1+Function+on+Neutrophils.">Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils.</a> Arthritis. Rheum. , (2013).</li><li>Bacabac, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+shear+stress+in+parallel-plate+flow+chambers.">Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers.</a> J. Biomech. 38 (1), 159-167 (2005).</li><li>Kucik, D. F., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, ., Goosmann, U., C, A., Zychlinsky, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. 36 (36), (2010).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> J Vis Exp. (17), 745 (2008).</li><li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+variations+in+absolute+wall+shear+stress+levels+within+one+species+and+between+species.">Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species.</a> Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).</li><li>Nagaoka, T., Yoshida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+evaluation+of+wall+shear+stress+on+retinal+microcirculation+in+humans.">Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo guida la separazione e l&#39;isolamento dei neutrofili minimamente attivati ​​per l&#39;accurata quantificazione di neutrofili in condizioni di stress puro. Neutrofili è un processo critico nell&#39;infiammazione. Poiché varianti genetiche in molecole multiple di questo processo hanno dimostrato di predisporre allo sviluppo della malattia autoimmune 1,2, è necessario un sistema di test in grado di valutare quantitativamente ditta neutrofili umani adesione. Il metodo descritto in questo protocollo consente la determinazione accurata e quantitativa del potenziale adesivo compatto di neutrofili in un ambiente controllato in vitro sotto stress pura. Questo metodo consente quindi il confronto diretto di adesione dei neutrofili quantitativa tra individui genotipizzati per determinare l&#39;importanza della variazione genetica in molecole di adesione 14. Diversi passaggi di questo metodo meritano attenta considerazione per ragRisultati e altamente quantitativi e riproducibili. Nella preparazione HUVEC, è fondamentale per raggiungere il 100% di confluenza cella prima di utilizzarle nella camera di flusso. Per l&#39;utilizzo di superfici rivestite con ligando purificato, l&#39;area di rivestimento substrato deve mai essere lasciata asciugare per evitare la denaturazione del legante. Inoltre, la preparazione dei neutrofili umani è fondamentale per il successo dell&#39;esperimento. Questioni chiave isolare neutrofili dal sangue includere manipolazione delicatamente minimizzando vortex per evitare l&#39;attivazione, mantenendo le cellule a temperatura ambiente (cioè il sangue non dovrebbe essere memorizzato su ghiaccio e centrifugazione procedura deve essere eseguita a temperatura ambiente) e completando l&#39;isolamento e l&#39;esperimento nel minor tempo possibile. Ci sono altri metodi di isolamento dei neutrofili che possono anche essere utilizzati per preparare le cellule per questi saggi 17,18. Da un punto di vista pratico saggi, di adesione con appena isolate neutrofili umani<html> deve essere iniziato entro 3-6 ore dopo partecipante salasso. Come neutrofili sono estremamente sensibili alla manipolazione, tempi prolungati tra il prelievo di sangue e il loro utilizzo potrebbe influenzare i risultati del test. Determinazione accurata di concentrazione cellulare neutrofili prima del test camera di flusso è anche necessario per ottenere risultati accurati e riproducibili. Durante il test camera di flusso, è importante monitorare attentamente la registrazione video per garantire che la velocità di flusso è costante e non c&#39;è turbolenza per tutta la durata dell&#39;esperimento. Le variazioni di velocità di flusso o la presenza di turbolenze richiedano che l&#39;esperimento ripetuto. Dopo l&#39;esperimento, è anche importante valutare le rimanenti neutrofili microscopicamente per garantire che i neutrofili non sono grumi. Aggregazione a questo punto indicherebbe che i neutrofili sono diventati attivato che potrebbero alterare significativamente la densità neutrofili durante l&#39;esperimento. contenuto &quot;&gt; La camera di flusso crea una tensione in prossimità omogenea pura all&#39;interno della camera (τ = 6Qμ / (wh 2), dove Q = portata, μ = viscosità dinamica, e w = larghezza della camera di flusso, h = altezza del flusso camera 15). Nei nostri studi, abbiamo utilizzato una portata di 350 ml / min per neutrofili, che crea uno stress pura di 1,5 dyne / cm 2 (w = 0.25 cm, h = 0,01 pollici, la viscosità dell&#39;acqua a 37 ° C (0,007 poise) è stato utilizzato come approssimazione della viscosità RMPI media). Per una camera di flusso specifico, si può modificare la portata per ottenere diversi livelli di stress pura per simulare diverse condizioni fisiologiche. Tipica shear stress fisiologico in vasi sanguigni umani possono intervalli tra 0.5-5.0 dyne / cm 13,16. sollecitazioni di taglio in altri vasi sanguigni e altri animali sono stati elencati nella Tabella 1 113,16,19 20. Mentre il nostro metodo si è concentrato sullo studio dell&#39;adesione delle neutrophi umanals, questo metodo non è limitato a neutrofili e può essere facilmente applicato ad adesione o studi rotolamento di altri tipi di cellule con semplici modifiche. Inoltre, i substrati di questo metodo possono essere modificati per scopi diversi. Sebbene questo protocollo è facilmente adattabile a diversi studi, ci sono alcune limitazioni. Il protocollo attuato qui richiede grande numero di cellule primarie per l&#39;analisi. Questo può precludere l&#39;analisi di pile di piccoli animali. Inoltre, la necessità di immobilizzare ligandi adesione purificati in una conformazione attiva / disponibili possono limitare la gamma di ligandi. L&#39;uso delle proteine ​​di fusione Fc-migliora notevolmente le possibilità di ottenere una corretta conformazione ligando sulla superficie della lastra. Tuttavia, il metodo ha una notevole flessibilità per consentire l&#39;analisi quantitativa di eventi di adesione. Questi studi permettono di migliorare notevolmente la nostra comprensione di coppie recettore-ligando adesione, e l&#39;importanza potenziale funzione di varianti genetichein queste proteine, nella patogenesi di malattie umane.

Varianti genetiche in entrambi i β 2 integrine e ligandi in ICAM ora sono riconosciuti per essere associato con lo sviluppo della malattia autoimmune 1,2. La determinazione delle conseguenze funzionali di queste varianti in cellule derivate da individui con queste varianti è necessario per la nostra comprensione di come queste varianti contribuiscono alla patogenesi della malattia autoimmune. Tali studi funzionali consentono la determinazione dei meccanismi attraverso i quali naturalmente varianti genetiche modellano la risposta immunitaria nella salute e nella malattia. Nell&#39;esempio specifico del LES, ora sappiamo che le varianti in ITGAM (CD11b) e il suo ligando, ICAM-1, fortemente associamo con lo sviluppo della malattia di 1,2. Perché neutrofili sono fondamentali nelle risposte infiammatorie, lo studio quantitativo dei neutrofili può fornire approfondimenti meccanicistici sul modo in cui le varianti genetiche in ITGAM / ICAM alterano l&#39;infiammazione. NeutropHIL ferma adesione alle cellule endoteliali (EC) è un processo altamente regolato e svolge un ruolo fondamentale nella risposta infiammatoria 3,4. La ferma adesione di neutrofili segue rotolamento dei neutrofili iniziale e la cattura alla CE e, infine, può portare a trasmigrazione in vivo. Questi processi coinvolgono diversi tipi di molecole di adesione, incluse ICAM-1, ICAM-2, P-selectina, E-selectina sulle cellule endoteliali e β 2 integrine sulla neutrofili 5-9. Così, attenta quantificazione dei neutrofili da donatori con diverse varianti alleliche delle molecole di adesione sarà importante per capire le conseguenze funzionali e patologiche di queste varianti genetiche. Sperimentazione di una camera di flusso in grado di creare un ambiente in vitro con sollecitazione di taglio fluido simile a quello osservato nell&#39;ambiente vaso sanguigno in vivo 10-12. Infatti, un saggio camera di flusso accoppiato con umbili umanacal cellule endoteliali della vena (HUVEC) può simulare l&#39;ambiente in vivo di un vaso sanguigno. Usando questo metodo, si possono studiare le proprietà adesive cellulari complessive verso cellule endoteliali. Inoltre, l&#39;ambiente altamente controllato della camera di flusso consente anche la valutazione della cella legame ai ligandi adesione purificate come ICAM-1 per facilitare lo studio di interazioni recettore-ligando specifico. Vi presentiamo qui un metodo che utilizza un sistema di test di adesione camera di flusso per studiare le proprietà adesive dei neutrofili nel sangue periferico umano di HUVEC e ai substrati ligando purificati. Utilizzando questo metodo con cellule di donatori che esprimono diverse varianti alleliche molecola di adesione ci permette di valutare come queste varianti genetiche possono alterare impresa neutrofili umana adesione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="677">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:677px;">Table of Reagents Materials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Name of reagent</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:268px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">25200-056</td>
			<td style="width:268px;">with Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">2X Trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">R-002-100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">35mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430165</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:192px;">75cm2 tissue culture flask</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430641</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Dage-MTI</td>
			<td style="width:111px;">Model 300T-RC</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Cell freezing container&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Biocision</td>
			<td style="width:111px;">BCS-045</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-3156</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EGM-2 Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc</td>
			<td style="width:111px;">CC-4176</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth factors for basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">FBS</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">10082-147</td>
			<td style="width:268px;">Certified, Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Gelatin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">G9391</td>
			<td style="width:268px;">from bovine skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:107px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:111px;">02-671-51B&#160;</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F2006</td>
			<td style="width:268px;">from human plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Flow chamber</td>
			<td style="width:107px;">Glyco Tech</td>
			<td style="width:111px;">31-001</td>
			<td style="width:268px;">Circular flow chamber for 35mm dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">fMLP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">47729</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Histopaque-11191</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">11191</td>
			<td style="width:268px;">Heavy ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">HUVEC</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-2517A</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">ICAM-1</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">720-IC</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Lymphocyte separation medium</td>
			<td style="width:107px;">Mediatech Inc.</td>
			<td style="width:111px;">25072CV</td>
			<td style="width:268px;">Light ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Microscope</td>
			<td style="width:107px;">Zeiss</td>
			<td style="width:111px;">Axiovert 100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875</td>
			<td style="width:268px;">with L-Glutamine and Phenol Red&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Protein A</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P6031</td>
			<td style="width:268px;">resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">P-Selectin</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">137-PS</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:107px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:111px;">KDS270</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">TNF-a</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">PHC3015</td>
			<td style="width:268px;">Recombinant Human Protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human neutrophil flow chamber adhesion assay

Ferma neutrofili alle cellule endoteliali svolge un ruolo critico nel processo infiammatorio sia in salute e malattia. Il processo di adesione dei neutrofili dell&#39;impresa coinvolge molte molecole di adesione tra cui membri della famiglia delle integrine β 2 e le loro contro-recettori della famiglia ICAM. Recentemente, naturalmente varianti genetiche sia β 2 integrine e ICAM sono segnalati per essere associati con la malattia autoimmune. Così, la capacità adesiva quantitativa dei neutrofili da individui con diverse forme alleliche di queste molecole di adesione è importante studiare rispetto a meccanismi alla base dello sviluppo di autoimmunità. Studi adesione a sistemi camera di flusso possono creare un ambiente con sollecitazione di taglio fluido simile a quello osservato nell&#39;ambiente vaso sanguigno in vivo. Qui, presentiamo un metodo che utilizza un sistema di dosaggio camera di flusso per studiare le proprietà adesive quantitativi di neutrofili nel sangue periferico umanos di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) e di substrati ligando purificati. Con questo metodo, le capacità adesive neutrofili da donatori con diverse varianti alleliche in recettori di adesione possono essere valutati e confrontati. Questo metodo può anche essere modificato per valutare l&#39;adesione di altri tipi di cellule primarie o linee cellulari.

Esempi di neutrofili legame di un ligando purificato (ICAM-1/P-Selectin) camera di flusso rivestito (Figura 2) o di legarsi ad un HUVEC rivestite saggio camera di flusso (figura 3) neutrofili sono mostrati. Come mostrato nelle figure, neutrofili continuano ad accumularsi / aderire alla superficie rivestita o HUVEC in condizioni di flusso continuo. Nelle nostre condizioni sperimentali tipiche, possiamo osservare 50-70 neutrofili umani saldamente aderenti alla superficie rivestita o HUVEC durante un periodo di registrazione di quattro minuti. Tuttavia, le varianti alleliche delle molecole di adesione dei neutrofili, o le varianti alleliche del substrato (ligando purificato o HUVEC), potrebbero alterare sostanzialmente quantitativa neutrofili 14. Abbiamo anche valutato la dipendenza temporale degli eventi di adesione dei neutrofili osservati nei nostri studi. Mentre stiamo mantenendo condizioni di flusso costante, è possibile che le proprietà adesive delle cellule cambiano nel tempo. Huttavia, negli relativamente brevi corsi di tempo nei nostri studi, non osserviamo differenze consistenti nel tasso di adesione nel corso del tempo. Ad esempio, valutare l&#39;adesione ai 1-2 punti temporali minuti rispetto alla adesione osservata tra i 3-4 numero minimo di punti di tempo non sono sempre diversi. Naturalmente, se le cellule vengono stimolate durante l&#39;esperimento adesione, poi cambiamenti nelle proprietà adesive nel tempo si poteva aspettare. Nei nostri studi, abbiamo controllato per isolare l&#39;attivazione dei neutrofili indotta intenzionalmente priming delle cellule con una bassa dose di fMLP (10 -8 M) per 10 minuti prima dell&#39;inizio dello studio. Le cellule endoteliali (HUVEC nei nostri studi) richiedono l&#39;attivazione prima di aumentare l&#39;espressione delle molecole di adesione per una ottimale ferma adesione dei leucociti. In assenza di pre-trattamento, le cellule endoteliali (HUVEC) sosterranno pochissimo adesione dei neutrofili. Nei nostri studi, abbiamo usato 10 ng / ml trattamento TNFa per 4-6 ore prima dell&#39;uso. IL-1β (10 ng / ml) e<html> LPS (0,5-1 mg / ml) può essere usato per pre-attivare le cellule endoteliali. Importante, greggia HUVEC può essere utilizzato come controllo negativo per garantire che l&#39;adesione delle cellule è causata da specifiche interazioni cellulari neutrofili-endoteliale (recettore-mediata). In alternativa, anticorpi anti-recettore possono essere usati per bloccare i recettori specifici per valutare la specificità di aderenza. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1.jpg" /> Figura 1. Configurazione della camera di flusso sul palco microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> oad/51410/51410fig2.jpg &quot;/&gt; Scatti Figura 2 schermo da un video di esempio di neutrofili che aderiscono alla ICAM-1/P-Selectin superficie rivestita in diversi momenti (A:. 0 punto di tempo, B: 1 punto min Tempo, C: 2 punti min di tempo, e D: 4 min punto di tempo). La concentrazione di ICAM-1 è 25 mg / ml e P-selectina è di 0,5 mg / ml. Velocità del flusso dei neutrofili è di 350 ml / min, con densità di neutrofili a 500.000 cellule / ml. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3.jpg" /> Figura 3 colpi di schermo da un video di esempio di neutrofili che aderiscono alla superficie HUVEC rivestita in diversi momenti (A: 0 punti di tempo, B: 1 min punto di tempo, C: 2 punti di min di tempo, e D: 4 min punto di tempo)..Velocità del flusso dei neutrofili è di 350 ml / ml con densità neutrofili 500.000 cellule / ml. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td> Specie </td><td > Posizione </td><td > Shear stress (dyne / cm 2) </td></tr><tr ><td> Umano </td><td> Arteria caroid Comune </td><td> 11.6 </td></tr><tr ><td> Umano </td><td> Dell&#39;arteria branchiale </td><td> 6.5 </td></tr><tr ><td> Umano </td><td> Arteria femorale comune </td><td> 4.3 </td></tr><tr ><td> Umano </td><td> Aorta surrenale </td><td> 7.3 </td></tr><tr ><td> Umano </td><td> Aorta Supraceliac </td><td> 4.2 </td></tr><tr ><td> Umano </td><td> Superficiale arteria fermoral </td><td> 4.4 </td></tr><tr ><td> Umano </td><td> Venule </td><td> 0,5-5,0 </td></tr><tr ><td> Umano </td><td> Retina prima arteriole </td><td> 40.2 </td></tr><tr ><td> Umano </td><td> Secondo arteriole della retina </td><td> 0.001 </td></tr><tr ><td> Umano </td><td> Retina prima venule </td><td> 23.2 </td></tr><tr ><td> Umano </td><td> Secondo venule retiniche </td><td> 0.43 </td></tr><tr ><td> Cane </td><td> Arteria caroid Comune </td><td> 15.8 </td></tr><tr ><td> Coniglio </td><td> Arteria caroid Comune </td><td> 23.3 </td></tr><tr ><td> Ratto </td><td> Arteria caroid Comune </td><td> 46.6 </td></tr><tr ><td> Mouse </td><td> Arteria caroid Comune </td><td> 64.8 </td></tr><tr ><td> Cane </td><td> Arteria femorale comune </td><td> 9.8 </td></tr><tr ><td> Coniglio </td><td> Arteria femorale comune </td><td> 156.8 </td></tr><tr ><td> Ratto </td><td> Arteria femorale comune </td><td> 65.9 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Esempio di shear stress nei diversi organi e specie diverse. * Riassunte dai riferimenti 13, 16, 19, e 20.

Watch this Scientific Journal Video about Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay at JoVE.com

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

È riportato un metodo di quantificazione neutrofili. Questo metodo crea un ambiente di flusso dinamico simile a quello riscontrato in un vaso sanguigno. Permette la ricerca di neutrofili adesione a entrambi le molecole purificate di adesione (ligando) o substrato di cellule endoteliali (HUVEC) in un contesto simile all&#39;ambiente in vivo con lo stress puro.

Umano camera di flusso neutrofili saggio

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

human-neutrophil-flow-chamber-adhesion-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K Views.  University of Alabama at Birmingham.  È riportato un metodo di quantificazione neutrofili. Questo metodo crea un ambiente di flusso dinamico simile a quello riscontrato in un vaso sanguigno. Permette la ricerca di neutrofili adesione a entrambi le molecole purificate di adesione (ligando) o substrato di cellule endoteliali (HUVEC) in un contesto simile all'ambiente in vivo con lo stress puro. 

Video: Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Umano In Vitro</emSoppressione> come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

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Immunologia e infezioni

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un flusso di Adesione saggio per studiare Leucocyte reclutamento a epatici umani sinusoidali Endotelio in condizioni di stress Shear

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

Semplificato umani neutrofili extracellulari Traps (NET) Isolamento e Manipolazione

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Saggio di adesione Sotto Shear stress per lo studio di linfociti T-Adhesion Molecule Interazioni

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Analisi di adesione dinamico per l'analisi funzionale delle terapie di anti-adesione nelle malattie intestinali infiammatorie

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Preparazione del midollo osseo intero per l'analisi della citometria di massa delle cellule di lignaggio neutrofilo

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...