L'embriogenesi C.elegans dura circa 13 ore e di solito viene monitorata filmando un embrione alla volta. Il nostro protocollo, tuttavia, consente l'imaging 3D simultaneo time lapse di 80-100 embrioni. La capacità di raccogliere dati per un gran numero di embrioni C.elegans in via di sviluppo apre una nuova gamma di esperimenti, tra cui l'analisi quantitativa di eventi di sviluppo e schermi su larga scala.
Questo protocollo può essere facilmente adattato per catturare diversi processi di sviluppo o per immaginare embrioni che esprimono qualsiasi combinazione di marcatori nei tessuti di interesse. È difficile disperdere correttamente gli embrioni all'interno dei pozzi. Dovrebbero essere vicini per consentire la cattura di più embrioni per campo senza grumi in diversi piani Z.
Si consiglia di utilizzare due ricercatori per la dissezione affiancata, sul ghiaccio, e di bloccare i pozzi inutilizzati. Dimostreremo anche alcuni trucchi utili per impostare rapidamente una piastra ben messa in scena da 384 pozzi. Inizia sigillando una piastra con fondo di vetro da 384 po 'con foglio adesivo PCR per mascherare i pozzi inutilizzati.
Utilizzare un rasoio o bisturi per tagliare il foglio per esporre un sottoinsieme dei pozzi per l'uso. Aggiungere 70 microlitri di TMHC appena preparato in ogni pozzo e tenere la piastra sul ghiaccio. Escludere le due file esterne della piastra per evitare effetti sui bordi.
Per una rapida preparazione del campione, si raccomanda la dissezione affiancata da parte di due ricercatori. Quando tutta la soluzione è stata placcata, utilizzare pinzette fini e un microscopio a dissezione per trasferire circa 10 adulti gravidi in 150 microlitri di soluzione TMHC ghiacciata all'interno di uno scivolo di depressione per condizione. Usando le pinzette e un bisturi, sezionare i vermi per rilasciare gli embrioni e caricare una pipetta capillare tirata in un aspiratore di bocca.
Utilizzare la pipetta della bocca per trasferire tutti gli embrioni da due a otto cellule in singoli pozzi della piastra preparata ed esaminare la piastra per confermare che non sono presenti aggregati all'interno di alcun pozzo. Una volta raccolti tutti gli embrioni, depositare i campioni mediante centrifugazione e utilizzare una salvietta imbevuta di etanolo per rimuovere eventuali residui dal fondo della piastra. Posizionare la piastra nel supporto della piastra di un microscopio confocale dotato di un ambiente a temperatura controllata e utilizzare l'obiettivo 10X per eseguire una pre-scansione di ogni pozzo per identificare i campi con embrioni adatti.
Al termine della scansione, passare all'obiettivo 60X, regolare il piano focale in ogni punto per l'immagine da uno a quattro campi per pozzo e acquisire 18 sezioni Z a intervalli di due micrometri ogni 20 minuti per 10 ore. Una volta acquisite tutte le immagini, eseguire una scansione bassa, completamente ben illuminata, circa 20-24 ore dopo l'inizio dell'imaging notturno per valutare la letalità embrionale. Per il ritaglio automatico utilizzando l'eseguibile embryoCropUI, scaricare prima il programma da Zenodo e i testfile.
zip per determinare se il programma funziona correttamente sulla piattaforma. Una volta scaricato, decomprimere e navigare per trovare il file eseguibile embryoCropUI e fare doppio clic per avviare il programma. Selezionare Apri per caricare il primo campo visivo 4D specifico da ritagliare.
Quando si ritaglia una serie TIFF con più dimensioni, caricare solo la prima immagine della serie all'interno della cartella. Una volta caricate tutte le immagini, specificare i parametri di imaging, selezionare la correzione della sottrazione e dell'attenuazione dello sfondo e impostare l'ordine di raccolta delle immagini e i micron per pixel. Quindi selezionare Esegui, verrà creata una nuova sottocartella etichettata crop nello stesso percorso della cartella non ritagliata e le versioni ritagliate verranno salvate in questo percorso.
Per la visualizzazione, scaricare il plug-in MSV2 ImageJ aperto e combinato e le istruzioni dell'interfaccia utente grafica Zenodorepov2. docx da Zenodo e aprire il plugin in IMageJ. Individuare le righe tre e quattro e immettere il percorso in cui verranno archiviate le cartelle immagine dopo il ritaglio.
Nomi delle cartelle di immagine delle condizioni da elaborare e identificatore alfanumerico univoco per ogni esperimento overnight. Una volta immesse tutte le informazioni, fare clic su Esegui. Verrà visualizzata una finestra che avvierà una richiesta per passare alla cartella esterna contenente le cartelle di immagini ritagliate.
Una volta selezionata, apparirà un'altra finestra che consentirà la specifica dei parametri di imaging. Fare clic su OK. Il file composito inizierà ad essere assemblato.
Una volta generato il composito, esaminare i file lasciati aperti. Quando vengono immagini in combinazione, i ceppi di reporter personalizzati forniscono letture informative per la maggior parte dei principali eventi di sviluppo. Inclusa la specifica del solfato, l'intercalazione dorsale, l'involucro epidermico, l'allungamento e la neurogenesi.
24 ore dopo l'iniezione è un punto di tempo ottimale per l'imaging. A questo punto l'esaurimento delle proteine materne e l'inibizione dell'espressione genica zigotica sono entrambi efficaci producendo fenotipi distintivi distinti e altamente riproducibili in un ampio spettro di geni coinvolti nella specifica del solfato e nella morfogenesi. È importante essere pazienti durante le fasi di dissezione e selezione degli embrioni.
Ridurre al minimo il raggruppamento e la selezione dei piani focali appropriati sono essenziali anche per garantire dati di alta qualità. Il nostro protocollo può essere eseguito con una varietà di ceppi di marcatori fluorescenti e in combinazione con RNAi o mutanti. I nostri strumenti di elaborazione consentono un'analisi dei dati semplificata, automatizzata o manuale.
Utilizzando i ceppi, i metodi e gli strumenti descritti qui, il nostro gruppo ha eseguito uno schermo ad alto contenuto basato su RNAi destinato a circa 2.000 geni necessari per lo sviluppo embrionale. I metodi ad altissima produttività erano essenziali per questo progetto.
