Questo è un protocollo per l'isolamento delle cellule staminali del muscolo topo primario per lo studio del metabolismo ex vivo. Questo protocollo fornisce una popolazione molto più ampia di cellule staminali rispetto ad altri protocolli che abbiamo provato in passato. E soprattutto, una volta differenziate queste cellule staminali in miotubi, mostrano una fisiologia normale, quindi cose come i ritmi circadiani.
Quando si prova questa procedura per la prima volta, prendere appunti dettagliati e salvare diverse immagini perché ogni espianto tissutale sembra diverso e ci saranno variazioni nella crescita dei mioblasti. Senza dimostrazione visiva, è difficile sapere se si isolano le celle corrette. Abbiamo beneficiato del generoso aiuto di altri che ci hanno mostrato questo metodo quando lo abbiamo stabilito nel nostro laboratorio.
Dopo aver preparato il piatto per la dissezione secondo il manoscritto, preparare una camera umida posizionando da due a tre fogli di carta assorbente spessa in un sacchetto di plastica e utilizzare una pipetta per bagnare la superficie della carta con acqua sterile. Posizionare la camera sotto la luce UV per cinque minuti per sterilizzare. Sezionare il muscolo desiderato da un topo di quattro-otto settimane e risciacquare delicatamente in PBS contenente 40 microgrammi per millilitro gentamicina per sterilizzare.
Utilizzare forcep sterili per trasferire il muscolo in una piastra di Petri sterile non rivestita di 10 centimetri. Aggiungere 0,5 a un millilitro di mezzi di placcatura sul muscolo in modo che il tessuto sia umido ma non galleggiante. Utilizzare un bisturi sterile o una lama di rasoio per affettare delicatamente il muscolo in piccoli frammenti.
Utilizzare le forcep o una pipetta per trasferire i frammenti muscolari sulla superficie di una piastra pre-rivestita di sei centimetri. Sovrapporre molto delicatamente altri 0,8 millilitri di mezzi di placcatura sul tessuto. Posizionare il piatto di sei centimetri contenente i frammenti muscolari all'interno della camera umida e restituirlo a un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 48 ore.
Preparare e prewarm mezzi di mioblasto, tripina e PBS-gentamicina in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Per rivestire un pallone T25 per ogni gruppo muscolare, aggiungere due millilitri di soluzione di rivestimento sulla superficie del pallone, agitare delicatamente per creare un mantello uniforme sulla superficie e incubare il pallone a quattro gradi Celsius per un'ora. Ora, con una pipetta, rimuovere il supporto di placcatura dalle espianto muscolari e sciacquare delicatamente le estipie muscolari con due millilitri di PBS-gentamicina.
Rimuovere rapidamente il PBS e non lasciare che la piastra si sieda nel PBS. Quindi aggiungere delicatamente un millilitro di PBS-gentamicina e posizionare la piastra nell'incubatore Celsius di 37 gradi per un minuto. Utilizzare una pipetta P1000 per raccogliere il PBS con le celle in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.
Quindi, aggiungere un millilitro di tripina al piatto e restituirlo all'incubatore Celsius di 37 gradi per tre minuti. Toccare delicatamente le piastre per rimuovere i mioblasti. Raccogliere la tripina con le celle e combinarle con la raccolta PBS.
Aggiungere otto millilitri di mezzi di mioblasto al tubo di centrifuga e invertire delicatamente per mescolare. Sovrapporre delicatamente due millilitri di soluzione di placcatura sulle piastre muscolari e riportare le piastre all'incubatore di 37 gradi Celsius. Ruotare i tubi di centrifuga contenenti cellule in una centrifuga per tre minuti a 200 volte g.
Aspirare il supernatante e tenere circa un millilitro nel tubo. Aggiungere delicatamente i mezzi di mioblasto, trasferire le cellule nel pallone pre-rivestito e posizionare il pallone nell'incubatore di 37 gradi Celsius. Aspirare il supporto dai contenitori P0 myoblast T25.
Risciacquare brevemente le cellule con due millilitri di PBS-gentamicina calda, quindi aspirare il PBS dal pallone. Pipettare due millilitri di PBS caldo in ogni pallone contenente mioblasti. Posizionare i contenitori con PBS nell'incubatore di 37 gradi Celsius per tre minuti.
Quindi toccare saldamente il lato del pallone per spostare le cellule. Controllare al microscopio luminoso la presenza di mioblasti che galleggiano liberamente. Posizionare i contenitori in posizione verticale in un cappuccio di coltura tissutale e sciacquare il fondo dei contenitori con 10 millilitri di mezzi di mioblasto due o tre volte per assicurarsi che tutte le cellule vengano spodesate.
Raccogliere la miscela di mezzi cellulari in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Centrifuga per tre minuti a 200 volte g. Aspirare il supporto a lasciare circa un millilitro nel tubo facendo attenzione ad evitare il pellet cellulare.
Aggiungere delicatamente un volume appropriato di mezzi di mioblasto al tubo di centrifuga e mescolare delicatamente. Distribuire la miscela cellulare ai nuovi contenitori T75 sei millilitri ciascuno. Aggiungere 10 millilitri di mezzi di mioblasto a ogni nuovo pallone T75.
Agitare delicatamente i contenitori orizzontalmente per distribuire le cellule e posizionarle nell'incubatrice a 37 gradi Celsius durante la notte. In questo protocollo, le cellule primarie emersero dalle espianto sono state osservate al microscopio a luce standard. I primi raccolti di mioblasti apparvero come piccole sfere rotonde e luminose.
La differenziazione dei mioblasti ha richiesto da quattro a sei giorni durante i quali la morfologia delle cellule è cambiata da singole sfere rotonde a lunghe fibre multi-nucleate fuse allungate. Sono stati prodotti miotubi completamente differenziati, pronti per la misurazione dei tassi di consumo di ossigeno. Queste celle possono essere utilizzate per una serie di applicazioni downstream.
Ad esempio, li usiamo spesso per studiare il flusso di substrato negli strumenti Seahorse.
