We thank Dr. Gilles Dupuis for critical reading of the manuscript. 
Funding
This work was supported by the Canadian Institutes for Health Research, grant # MOP-126173. C.M.D is a member of the Fonds de la Recherche en Sant&#233; (FRSQ)-funded Centre de Recherche Clinique &#201;tienne LeBel.

1. Preparazione di soluzioni per cellulare pH Calibrazione <ol><li> Aggiungere i seguenti composti da cinque tubi 50 ml coniche separati per preparare 5 soluzioni da utilizzare per la calibrazione: <ul><li> NaCl (1 ml di 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0,58 g in 10 ml di H 2 0) </li><li> KCl (6,75 ml di 1 M KCl) (1 M KCl = 0,75 g in 10 ml di H 2 0) </li><li> Glucosio (1 ml di 1 M D-glucosio) (1M D-Glucosio = 1,80 g in 10 ml di H 2 0) </li><li> MgS0 4 (0,05 ml di 1 M MgSO 4) (1 M MgSO 4 = 1,20 g in 10 ml di H 2 0) </li><li> HEPES 20 mM (1 ml di 1M HEPES) (1 M HEPES = 2,38 g in 10 ml di H 2 0) </li><li> CaCl 2 (0,05 ml di 1M CaCl 2) (1 M CaCl 2 = 1,47 g in 10 ml di H 2 0) Preparare tutte le soluzioni a doppia distillata H 2 O (DDH 2 O). </li></ul></li><li> Completare ogni soluzione con 35 ml di DDH 2 O e mescolare con un agitatore magnetico fino a tantoluzione è raggiunto. </li><li> Regolare il pH di ciascuna soluzione con 1 N KOH o 1 N HCl per ottenere valori di pH 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 e 7.5. Poi, regolare il volume con acqua deionizzata fino ad un volume finale di 50 ml. </li><li> Misura 5 mg di nigericin e aggiungerlo a 670 ml di EtOH assoluto per preparare un 10 mM nigericin soluzione stock. Attenzione: nigericin è altamente tossico e deve essere maneggiata con molta cura (guanti, occhiali di protezione e maschera). Miscelare la soluzione per inversione fino a quando il nigericin è completamente sciolto. </li><li> Aggiungere 0,05 ml di nigericin 10 mm (concentrazione finale 10 mM) ad ogni soluzione di taratura. Nigericina è uno ionoforo che aumenta la permeabilità della membrana cellulare e provoca equilibrazione di pH intracellulare ed extracellulare in presenza di una concentrazione depolarizzante di K + extracellulare. </li><li> Soluzioni di taratura possono essere memorizzati fino a 1 mese a 4 ° C </li></ol> 2. Preparazione cellulare <ol><li> Sotto un safet biologicoCappa y, cellule seme in 35 millimetri x 10 millimetri piatti di coltura in 2 ml di terreno di coltura supplementato con 10% di siero fetale bovino e antibiotici. Usare la quantità di cellule necessarie per garantire circa il 50% di confluenza dopo 24 ore. NOTA: Nei nostri esperimenti, usiamo la linea cellulare HT-1080 e la piastra 1 x 10 5 cellule per capsula di Petri. </li><li> Determinare il numero di piatti di coltura necessari per l&#39;esperimento e piastra 5 ulteriori piastre di coltura da utilizzare per la calibrazione. </li><li> Piatti di porre la cultura in un C 5% CO 2 incubatore 37 ° / per almeno 24 ore. </li></ol> 3. Preparazione di sonde pH-sensing <ol><li> Preparare una soluzione madre 1M della sonda pH fluorescente 8-idrossipirene-1, 3,6 acido trisolfonico, sale trisodico (HPTS / pyranine) in DDH 2 0. Questa soluzione deve essere conservato a temperatura ambiente e al riparo dalla luce. </li><li> Preparare una soluzione stock di 1 mM 5 - (e-6)-carbossilico seminaphthorhodafluor acetossimetilico estere acetato (C-SNARF-01:00; chiamato thereaopo SNARF-1) sciogliendo 1 mg di SNARF-1 in 1,76 ml di DMSO. Mescolare accuratamente pipettando ripetuta. SNARF-1 soluzione deve essere conservata a -20 ° C e al riparo dalla luce. </li></ol> 4. Etichettatura cellulare <ol><li> Sedici ore prima del live-cell imaging, aggiungere 2 ml di soluzione stock 1M HPTS (concentrazione finale 1 mm) per ogni piatto di coltura contenente 2 ml di terreno completo. </li><li> Riportare i piatti della cultura per l&#39;incubatore. La sonda HPTS è cell-impermeant, quindi etichetta organelli la sonda deve essere occupato da pinocitosi. Questa condizione richiede che incubazione delle cellule con HPTS vengono eseguite in medium siero supplementato cultura. </li><li> Dopo l&#39;incubazione con HPTS, lavare le cellule due volte con PBS sterile e aggiungere 2 ml di mezzo privo di siero per almeno 2 ore. Incubazione con SNARF-1 deve essere eseguita in terreno privo di siero perché siero può impedire l&#39;assorbimento della sonda. </li><li> Aggiungere 10 ml di un SNARF-1 soluzione stock 1 mm per ottenere afconcentrazione inale su 5 micron e consentono alle cellule di incubare per 20 min a 37 ° C, sotto la luce fioca. C-1-SNARF concentrazione e tempo di incubazione può variare a seconda del tipo cellulare. </li><li> Al termine dell&#39;incubazione, lavare le cellule due volte in PBS sterile e aggiungere 2 ml di mezzo privo di siero. </li></ol> 5. Aggiunta di pH modulatori <ol><li> Per valutare se il metodo può rilevare variazioni di pH nelle cellule, diversi reagenti che modulano pH intracellulare possono essere utilizzati: <ul><li> Bafilomycin A1, un inibitore specifico della V-ATPasi 5 </li><li> Na + / H + scambiatore isoforma 1 (NHE-1) 6 </li><li> NH 4 Cl, una base debole che aumenta intracellulare pH 7 </li></ul><ol><li> Preparare soluzioni madre dei reattivi di cui sopra: <ul><li> Bafilomycin A1: aggiungere 10 mg di bafilomycin A1 a 160 ml di DMSO per ottenere una soluzione stock di 100 micron </li><li> EIPA: aggiungere 25 mg di EIPA a 1.67 ml di metanolo per ottenuna concentrazione finale di 50 mM </li><li> NH 4 Cl: sciogliere 0,53 g di cloruro di ammonio in 10 ml di DDH 2 O per ottenere una concentrazione finale di 1 mM. </li></ul> Nota: Tutte le soluzioni di archivi devono essere conservati a 4 ° C ad eccezione di bafilomycin A1, che deve essere conservato a -20 ° C e al riparo dalla luce. </li><li> In piatti della cultura separati, aggiungere uno dei reagenti come descritto di seguito: <ul><li> 2 ml di 100 mM bafilomycin A1 (concentrazione finale 100 nm) </li><li> 1 ml di 50 mM EIPA (concentrazione finale 25 pm) </li><li> 40 ml di 1M NH 4 Cl (concentrazione finale 20 mM) </li></ul></li><li> Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C. </li></ol></li><li> Procedere alla acquisizione delle immagini. </li></ol> 6. Specifiche tecniche di imaging microscopio live-cell e impostazioni di acquisizione <ol><li> Eseguire live-cell imaging usando un obiettivo 40X montato su una spettrale invertito confocale a scansione microscope dotato di un palco XY motorizzato, una camera che ospita fondo di vetro piatti della cultura in un (temperatura, umidità, CO 2) fase di incubatore ambiente controllato. </li><li> Lo strumento confocale (Olympus FV1000) qui usato è dotato di: <ul><li> Un diodo laser 405 nm </li><li> Un laser ad argon 40 mW (458 nm, 488 nm, 515 nm) </li><li> Un laser elio neon (543 nm) </li><li> Obiettivo Fluorite 10X, NA0.4 </li><li> Un obiettivo LUCPLFLN 40X, NA0.60 </li><li> Un obiettivo olio PLAPONSC PIANO APO 60X, NA1.4 </li><li> Uno specchio dicroico DM 405/458/488/543 </li><li> Un SDM 560 e un SDM 640 filtri dicroici </li><li> Un filtro barriera BA655-755 </li><li> Un BS20/80 divisore di fascio </li><li> Software di analisi dei dati per acquisizione ed elaborazione, </li></ul></li><li> Una volta che l&#39;incubatore fase si è riscaldata fino a 37 ° C e il microscopio è istituito, mettere un piatto di coltura precedentemente incubate con HPTS e SNARF-1 nella camera di imaging fase confocale. </li><li> Laopo l&#39;individuazione di una zona di interesse, regolare le impostazioni di acquisizione del software Figura 1. <ul><li> Impostare due set di canali virtuali. </li><li> Avviare la prima fase che corrisponde al HPTS eccitazione a 405 nm e la raccolta emissione a 505-525 nm e SNARF-1 eccitazione a 543 nm e la raccolta emissione a 570-600 nm. </li><li> Avviare la seconda fase che corrisponde alla HPTS eccitazione a 458 nm e la raccolta emissione a 505-525 nm e SNARF-1 eccitazione a 543 nm e la raccolta emissione a 640-650 nm. </li><li> L&#39;apertura confocale è impostato a 175 micron per default e apertura ottimale deve essere impostata manualmente a 300 micron. </li><li> Prendere Immagine impilando seriali sezioni ottiche orizzontali (800 x 800 pixel) da 0,4 micron di spessore. </li></ul></li></ol> NOTA: Un obiettivo 40X è utile osservare più celle contemporaneamente e funziona bene per la visualizzazione organello. Tuttavia, la risoluzione spaziale e l&#39;intensità del segnale sono better ottenuto utilizzando un obiettivo 60X olio. Inoltre, non c&#39;è eccitazione o di emissione di diafonia tra i due coloranti. 7. Taratura delle sonde di pH-sensing <ol><li> Prima della taratura, rimuovere terreno dalla piastra di coltura precedentemente incubate con HPTS e SNARF-1, lavare due volte con PBS sterile e poi aggiungere 2 ml di una delle cinque soluzioni di taratura. </li><li> Posizionare il piatto cultura nella camera di fase confocale. </li><li> Procedere al time-lapse acquisizione delle immagini secondo le seguenti impostazioni: <ol><li> Impostare il numero di immagini e tempi di durata degli intervalli per l&#39;esperimento. NOTA: Usiamo tipicamente un intervallo di 1 minuto tra le immagini fino a 30 min. </li><li> Programmare l&#39;otturatore per chiudere tra l&#39;acquisizione di ogni immagine. </li></ol></li><li> Registrare l&#39;intensità di fluorescenza per min in un foglio elettronico e determinare il momento in cui l&#39;intensità di fluorescenza è costante. PH intracellulare è generalmente stabile dopo 15 - 20 min. </li><li> Ripetere passaggi 7,1-7,4 utilizzando un nuovo piatto di coltura per ogni soluzione di calibrazione rimanente. </li></ol> 8. Acquisizione dati <ol><li> Una volta che la calibrazione è stato fatto, acquisire dati di esempio 4-5 campi scelti a caso contengono 15-20 cellule per campo. Due immagini sono ottenute per ciascun campo: uno per l&#39;etichettatura HPTS (vescicole) e il secondo per SNARF-1 etichettatura (citosol). </li><li> Fluorescenza di fondo (zona extracellulare) viene digitalmente sottratto dalle immagini fluorescenti di entrambe le sonde. Vescicole etichettati e citoplasma dei rispettivi immagini memorizzate sono state selezionate usando una maschera binaria. Per ogni sonda pH-sensing, intensità di fluorescenza sono misurati su una scala numerica (0-4,095 scala di livelli di grigio). Una intensità medio per tutti i pixel del organello o citoplasma è calcolato ei valori vengono utilizzati per calcolare i rapporti di fluorescenza. </li></ol> 9. Analisi dei dati <ol><li> I vari pacchetti software sono disponibili in commercio per l&#39;analisi dei dati. EsempioFluoView Software. </li><li> In un foglio di calcolo, i valori dei record e calcolare rapporti di fluorescenza come segue: Nel caso di HPTS, R = (F 458 nm / F 405 nm) e, nel caso di SNARF-1, R = (F 644 nm / F 584 nm ). </li><li> Tracciare i dati utilizzando software grafici scientifici come GraphPad Prism. La trama dovrebbe ritrarre rapporti di fluorescenza (asse y) in funzione del pH (asse X). Curva di raccordo è realizzato utilizzando la regressione non lineare. </li><li> Raccogliere intensità di fluorescenza dei campioni come descritto al punto 8.2 e calcolare rapporti di fluorescenza. Usare curve di calibrazione per trasformare i rapporti in valori di pH. </li></ol>

<ol>
	<li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+Homeostasis+of+cellular+organelles.">pH Homeostasis of cellular organelles.</a> News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).</li><li>Hinton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+a+subunit+isoforms+of+the+V-ATPase+in+pH+homeostasis+and+in+vitro+invasion+of+MDA-MB231+human+breast+cancer+cells.">Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells.</a> J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).</li><li>Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+intraorganelle+pH+in+the+endosomal-lysosomal+pathway+in+neurons+by+using+ratiometric+imaging+with+pyranine.">Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).</li><li>Drose, S., Altendorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycins+and+concanamycins+as+inhibitors+of+V-ATPases+and+P-ATPases.">Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases.</a> J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).</li><li>Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHE1+inhibition+by+amiloride-+and+benzoylguanidine-type+compounds.+Inhibitor+binding+loci+deduced+from+chimeras+of+NHE1+homologues+with+endogenous+differences+in+inhibitor+sensitivity.">NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity.</a> J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).</li><li>Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-pH+crosstalks+in+rat+mast+cells:+cytosolic+alkalinization,+but+not+intracellular+calcium+release,+is+a+sufficient+signal+for+degranulation.">Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation.</a> Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).</li><li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+intracellular+pH.">Fluorescent indicators for intracellular pH.</a> Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).</li><li>Giuliano, K. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intracellular+pH+of+BALB/c-3T3+cells+using+the+fluorescence+of+pyranine.">Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine.</a> Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).</li><li>Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intracellular+pH+changes+on+resting+cytosolic+calcium+in+voltage-clamped+snail+neurones.">The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones.</a> J Physiol. 530, 405-416 (2001).</li></ol>

No conflict of interest declared.

Misura di pH quantitativa in live-cell imaging di diversi compartimenti cellulari è necessaria per misurare con precisione le variazioni di pH nelle risposte cellulari alle sfide esterne. Tuttavia, uno dei principali ostacoli che rimane è facile e specificamente i compartimenti cellulari. A questo proposito, alcuni studi hanno evidenziato l&#39;uso di HPTS come indicatore di pH intracellulare introdotto in cellule mediante elettroporazione o microiniezione 8-10. Queste tecniche soffrono di gravi inconvenien...

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">Solutions for calibration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">L-11621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">M-12445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">D-Glucose (dextrose)</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">HEPES</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">M-1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Deionized water</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Nigericin</td>
			<td style="width:136px;">Calbiochem</td>
			<td align="right" style="width:119px;">481990</td>
			<td>Toxic by inhalation or in contact with skin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:315px;">Keep protected from the light at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Culture dishes &#8709; 35mm</td>
			<td style="width:136px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">354456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">pH-sensing probes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:303px;">8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS)</td>
			<td style="width:136px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">H-348</td>
			<td>Keep away from the light at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:303px;">5-(and-6)-Carboxy SNARF&#174;-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate</td>
			<td style="width:136px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">C-1271</td>
			<td>Keep away from the light and humidity at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Dimethyl Sufoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">BP231-1&#160;</td>
			<td>Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">Phosphate buffered saline (PBS) 100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">M-12445</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">S369-1</td>
			<td>115 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:136px;">J.T Baker</td>
			<td style="width:119px;">3246-01</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Deionized water</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Autoclave and adjust pH to 7.4</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">Phosphate buffered saline (PBS) 1X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">PBS 100X</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">L-11621</td>
			<td>40,5 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Deoinized water</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Bring to 5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">pH modulators</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">&#160;Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B-1793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA)</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Ammonium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">A649-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous ph measurement in endocytic and cytosolic compartments in living cells using confocal microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Per la misura simultanea di pH sia intracellulare e compartimenti cellulari endosomal / lisosomiali, sono stati usati i fluorescenti sonde pH-sensing raziometrici Snarf-1 e HPTS. SNARF-1 è limitata al compartimento citosolico che HPTS permette di misurare raziometrica pH del vano endosomale / lisosomiale. Carico delle cellule con HPTS per 16 ore permette la sua localizzazione selettiva negli endosomi / lisosomi 4. Un tipico esempio di fluorescenza registrata da cellule HT-1080 caricato con le sonde pH-sensib...

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Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

La misurazione simultanea di pH in endocitosi e citosoliche scomparti nelle cellule viventi usando Microscopia confocale

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

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Biology

14.9K Views.  Université de Sherbrooke. Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells. 