We thank Dr. Gilles Dupuis for critical reading of the manuscript. 
Funding
This work was supported by the Canadian Institutes for Health Research, grant # MOP-126173. C.M.D is a member of the Fonds de la Recherche en Sant&#233; (FRSQ)-funded Centre de Recherche Clinique &#201;tienne LeBel.

Hücresel pH Kalibrasyon Çözümleri 1. Hazırlanması <ol><li> Kalibrasyon için kullanılmak üzere 5 çözümler hazırlamak için beş ayrı 50 ml konik tüplere aşağıdaki bileşikler ekleyin: <ul><li> NaCl (1 M NaCl 1 mi) (1 M NaCl, 10 ml H = 2 0 içinde 0.58 g) </li><li> KCl (6.75 1 M KCI mi) (1 M KCl, 10 ml H 2 0 içinde 0.75 g =) </li><li> Glikoz (1 M D-Glikoz 1 mi) (1 M D-Glucose = H 10 ml 1.80 g 2 0) </li><li> MgS0 4 (0.05 1 M MgSO 4 ml) (1 M, 10 ml MgSO H 2 0 içinde 4 = 1.20 g) </li><li> 20 mM HEPES (1 M HEPES 1 mi) (10 mi H 2 0 içinde 1 M HEPES = 2.38 g) </li><li> CaCl2 (1 M CaCI2 ve 0.05 mi) (10 mi H 1 M CaCl2 = 1.47 g 2 0) Çift distile H 2 O (GKD 2 O) tüm çözümler hazırlayın. </li></ul></li><li> GKD 2 O 35 ml solüsyonu ile, her tamamlamak ve böylece kadar bir manyetik karıştırıcı ile karıştırındevrim sisi elde edilir. </li><li> 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 ve 7.5 pH değeri elde etmek üzere 1 N KOH ya da 1 N HCI ile, her çözeltinin pH&#39;ı ayarlayın. Daha sonra, 50 ml lik bir son hacme kadar deiyonize su ile hacim ayarlayın. </li><li> Tedbir 5 nigerisin mg ve stok çözeltisi nigericin 10 mm hazırlamak için mutlak EtOH 670 ul ekleyin. Dikkat: nigericin son derece toksik ve büyük bir dikkatle (eldiven, gözlük ve maske) ile ele alınması gerekir. Nigericin tamamen eriyene kadar inversiyon yolu ile çözüm karıştırın. </li><li> Her bir ayar çözeltiye 10 mM nigerisin (nihai konsantrasyon 10 uM) ve 0.05 ml ilave edilir. Nigericin hücre zar geçirgenliğini artırır ve hücre dışı K + kutuplaşma giderici bir konsantrasyonunun mevcudiyetinde hücre-içi ve hücre dışı pH&#39;ın dengede neden olan bir iyonofor olduğunu. </li><li> Kalibrasyon çözümleri 4 ° C&#39;de 1 ay kadar saklanabilir </li></ol> 2.. Hücre Hazırlanması <ol><li> Biyolojik bir Safet altında35 mm y kapağı, tohum hücreleri x 10 mm kültür tabakları,% 10 fetal sığır serumu ve antibiyotikler ile desteklenmiş büyüme ortamı içinde 2 ml. 24 saat sonra yaklaşık olarak% 50 izdiham sağlamak için gerekli hücre miktarı kullanın. Not: Deneylerde, biz HT-1080 hücre çizgisi ve plaka kültür kabı başına 1 x 10 5 hücre kullanın. </li><li> Kalibrasyon için kullanılacak deney ve plaka 5 ek kültür tabakları için gereken kültür kaplarına sayısını belirler. </li><li> En az 24 saat boyunca 37 ° C /% 5 CO2 inkübatörü içinde yer kültür tabakları. </li></ol> PH-algılama Sondalar 3. Hazırlanması <ol><li> GKD 2 0 floresan prob pH 8-hydroxypyrene-1 ,3,6-trisülfonik asit, trisodyum tuzu (HPTS / pyranine) bir 1 M stok çözelti hazırlayın. Bu çözelti, oda sıcaklığında saklanan ve ışıktan korunmalıdır. </li><li> Thereâ adlandırılan (and-6)-karboksil seminaphthorhodafluor asetoksimetil ester asetat (C-SNARF-01:00 - 1 mM 5 &#39;lik bir stok çözelti hazırlayınfter SNARF-1) DMSO 1.76 ml Snarf-1, 1 mg çözülmesiyle. Iyice tekrarlanan pipetleme karıştırın. SNARF-1 çözeltisi, -20 ° C&#39;de saklanan ve ışıktan korunmalıdır. </li></ol> 4. Hücre Etiketleme <ol><li> Onaltı saat canlı hücre görüntüleme önce, tam ortam 2 ml içeren her kültür tabağına 1M HPTS stok solüsyonu 2 ul (nihai konsantrasyon 1 mM) ekleyin. </li><li> Inkübatör kültür yemekleri dönün. HPTS prob nedenle etiket prob pinositoza tarafından alınmalıdır organeller, hücre-laktobionat olduğunu. Bu durum HPTS hücre inkübasyonlar serum-takviyeli kültür ortamında gerçekleştirilir gerektirir. </li><li> HPTS ile inkübasyondan sonra, steril PBS ile iki kez Hücreleri yıkamak ve en az 2 saat boyunca serumsuz ortamda 2 ml ekleyin. SNARF-1 ile inkübasyon serum prob ortaya çıkmasını önlemek, çünkü serum içermeyen ortam içinde yapılması gerekmektedir. </li><li> AF elde etmek üzere bir 1 mM SNARF-1 ihtiyat çözeltisinden 10 ul ekleinal 5 uM arasında konsantrasyon ve hücreler loş ışık altında, 37 ° C&#39;de 20 dakika boyunca inkübasyona izin verin. C-SNARF-1 konsantrasyon ve kuluçkalama süresi, hücre tipine bağlı olarak değişebilir. </li><li> İnkübasyonun sonunda, steril PBS içerisinde iki kez yıkama ve hücreler serum içermeyen ortam 2 ml ekleyin. </li></ol> PH Modülatörler 5. Ilavesi <ol><li> Yöntem hücrelerde pH değişiklikleri tespit edebilir olup olmadığını değerlendirmek için, hücre içi pH&#39;ın modüle farklı reaktif de kullanılabilir: <ul><li> Bafilomisin A1, V-ATPaz 5 spesifik bir önleyicisi </li><li> Na + / H + değiştirici izoformu 1 (NHE-1) 6 </li><li> NH4CI, hücre içi pH 7 arttıran bir zayıf baz </li></ul><ol><li> Yukarıda bahsedilen reaktiflerin stok çözelti hazırlayın: <ul><li> Bafilomisin A1: 100 uM&#39;lik bir stok çözeltisi elde etmek üzere, DMSO ile 160 ul bafilomycin A1 10 ug eklemek </li><li> EIPA: obtai metanolün 1.67 ml EIPA 25 mg eklemek50 mM&#39;lik nihai konsantrasyon na </li><li> NH4CI: 1 mM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere GKD 2 O 10 ml amonyum klorürün 0.53 g çözülür. </li></ul> Not: Tüm stok solüsyonları -20 ° C sıcaklıkta saklanan ve ışıktan korunmalıdır bafilomycin A1 dışında 4 ° C&#39;de tutulmalıdır. </li><li> Ayrı bir kültür tabaklarında, aşağıda tarif edildiği gibi reaktifler ekleyin: <ul><li> 100 uM bafilomycin A1 2 ul (son konsantrasyon 100 nM) </li><li> 50 mM EIPA 1 ul (nihai konsantrasyon 25 uM) </li><li> 1 M NH4CI (nihai konsantrasyon 20 mM), 40 ul </li></ul></li><li> 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca inkübe hücreleri </li></ol></li><li> Görüntü alma geçin. </li></ol> 6.. Canlı hücre Görüntüleme Mikroskop Özellikleri ve Toplama Ayarlar <ol><li> Kullanarak canlı hücre görüntüleme gerçekleştirmek 40X objektif bir spektral ters tarama konfokal microsco üzerine montepe motorize XY aşamada, çevre kontrollü (sıcaklık, nem, CO 2) evre inkübatör cam alt kültür yemekleri barındıran bir bölme ile donatılmıştır. </li><li> Burada kullanılan konfokal alet (Olympus FV1000) ile donatılmıştır: <ul><li> Bir diyot lazer 405 nm </li><li> A 40 mW argon lazer (458 nm, 488 nm, 515 nm) </li><li> Bir helyum neon lazer (543 nm) </li><li> Florit 10X objektif, NA0.4 </li><li> Bir LUCPLFLN 40X objektif, NA0.60 </li><li> Bir PLAPONSC PLANI APO 60X yağ objektif, NA1.4 </li><li> Dikroik ayna DM 405/458/488/543 </li><li> Bir SDM 560 ve SDM 640 dikroik filtreleri </li><li> A BA655-755 bariyer filtre </li><li> Bir ışın ayırıcı BS20/80 </li><li> Görüntü elde etme ve analiz için veri analizi yazılımı, </li></ul></li><li> Sahne inkübatör 37 ° C&#39;ye kadar ısıtılır ve mikroskop kurulduktan sonra, önce konfokal sahne görüntüleme odasına HPTS ve Snarf-1 ile inkübe bir kültür çanak yerleştirin. </li><li> Ailgi alanı bulma ürkiye&#39;de, yazılım satın alma ayarları Şekil 1 ayarlayın. <ul><li> İki sanal kanal set kurmak. </li><li> 525 nm ve 570 nm 543 ve emisyon toplama SNARF-1 uyarım - - 600 nm 505 405 nm ve emisyon toplama HPTS uyarma karşılık ilk aşamasını başlatın. </li><li> 525 nm ve 640 de 543 nm ve emisyon toplama SNARF-1 uyarım - - 650 nm 505 458 nm ve emisyon toplama HPTS uyarma karşılık ikinci aşamasına. </li><li> Konfokal açıklık varsayılan olarak 175 um ayarlanır ve optimal diyafram elle 300 mikron ayarlanmış olması gerekiyor. </li><li> 0,4 mikron kalınlığında seri yatay optik bölümleri (800 x 800 piksel) istifleme Resmi atın. </li></ul></li></ol> NOT: 40X objektif aynı anda birkaç hücreleri gözlemlemek için yararlıdır ve organel görüntüleme için iyi çalışır. Ancak, uzaysal çözünürlüğü ve sinyal yoğunluğu Bette vardırR, bir 60X objektif kullanılarak yağ elde. Buna ek olarak, iki boyalar arasında bir uyarım veya emisyon cross-talk bulunmaktadır. PH-algılama Problar 7. Kalibrasyon <ol><li> Kalibrasyon önce, daha önce HPTS ve Snarf-1 ile inkübe kültür çanak orta kaldırmak steril PBS ile iki kez yıkama ve daha sonra, beş kalibrasyon çözümlerden biri 2 ml ekleyin. </li><li> Konfokal aşama odasına kültür tabağına yerleştirin. </li><li> Aşağıdaki ayarlara göre zaman atlamalı görüntü elde geçin: <ol><li> Deney için görüntülerin ve aralık süresi sayısını ayarlayın. NOT: tipik olarak 30 dakika ila görüntüleri arasında, 1 dakika süre aralığı kullanınız. </li><li> Her görüntünün edinimi arasındaki kapatmak için deklanşörü programlayın. </li></ol></li><li> Bir elektronik tablo yazılımı dakika başına floresan yoğunluğunu kaydedin ve floresan yoğunluğu sabit olduğu zaman belirler. 20 dk - Hücre içi pH 15 sonra genellikle kararlı. </li><li> REPEAT kalan her kalibrasyon çözümü için yeni bir kültür çanak kullanarak 7,1-7,4 adımları. </li></ol> 8. Veri Toplama <ol><li> Kalibrasyon yapıldıktan sonra, alan başına 15-20 hücreleri içeren 4-5 rastgele seçtikleri alanlarda örnek verileri kazanır. İki görüntüleri her alan için elde edilir: HPTS etiketleme (kesecikler) ve SNARF-1 etiketleme (Sitosol) için saniye biri. </li><li> Eşiğe (hücre dışı bir bölge) dijital hem de sondaların floresan görüntülerden çıkarılır. Ilgili saklanan görüntülerden Etiketli veziküller ve sitosol bir ikili maske kullanılarak seçilir. Her pH-algılama probu için, floresan yoğunlukları sayısal bir ölçek (0-4,095 gri seviye ölçeği) ölçülür. Organel ya da sitoplazmada tüm pikseller için bir ortalama yoğunluğu hesaplanır ve değerler floresan oranlarının hesaplanması için kullanılmaktadır. </li></ol> 9. Veri Analizi <ol><li> Çeşitli yazılım paketleri veri analizi için piyasada mevcuttur. YaniFluoview Yazılım. </li><li> Aşağıdaki gibi, bir tablo, kayıt değerleri içinde ve floresan oranları hesaplanır: HPTS durumunda, R = (F 458 nm / F 405 nm), ve SNARF-1, R = (F 644 nm / F 584 nm durumunda .) </li><li> Böyle GraphPadPrizmasındaki gibi bilimsel grafik yazılımı kullanarak veri çiziniz. Plot pH (X ekseni) bir fonksiyonu olarak floresans oranı (Y-ekseni) tasvir gerekir. Eğri uydurma, lineer olmayan regresyon kullanılarak elde edilir. </li><li> Adım 8.2 &#39;de tarif edildiği gibi örneklerin floresan şiddetlerini toplamak ve floresan oranları hesaplar. PH değerleri içine oranlarını dönüştürmek için kalibrasyon eğrileri kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+Homeostasis+of+cellular+organelles.">pH Homeostasis of cellular organelles.</a> News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).</li><li>Hinton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+a+subunit+isoforms+of+the+V-ATPase+in+pH+homeostasis+and+in+vitro+invasion+of+MDA-MB231+human+breast+cancer+cells.">Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells.</a> J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).</li><li>Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+intraorganelle+pH+in+the+endosomal-lysosomal+pathway+in+neurons+by+using+ratiometric+imaging+with+pyranine.">Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).</li><li>Drose, S., Altendorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycins+and+concanamycins+as+inhibitors+of+V-ATPases+and+P-ATPases.">Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases.</a> J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).</li><li>Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHE1+inhibition+by+amiloride-+and+benzoylguanidine-type+compounds.+Inhibitor+binding+loci+deduced+from+chimeras+of+NHE1+homologues+with+endogenous+differences+in+inhibitor+sensitivity.">NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity.</a> J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).</li><li>Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-pH+crosstalks+in+rat+mast+cells:+cytosolic+alkalinization,+but+not+intracellular+calcium+release,+is+a+sufficient+signal+for+degranulation.">Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation.</a> Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).</li><li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+intracellular+pH.">Fluorescent indicators for intracellular pH.</a> Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).</li><li>Giuliano, K. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intracellular+pH+of+BALB/c-3T3+cells+using+the+fluorescence+of+pyranine.">Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine.</a> Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).</li><li>Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intracellular+pH+changes+on+resting+cytosolic+calcium+in+voltage-clamped+snail+neurones.">The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones.</a> J Physiol. 530, 405-416 (2001).</li></ol>

No conflict of interest declared.

Farklı hücre bölümlerinde canlı hücre görüntüleme Sayısal pH ölçümü doğru dış zorluklara hücre yanıtlarında pH değişimleri ölçmek için gereklidir. Bununla birlikte, hala önemli engellerden biri kolayca ve özel hücre bölmeleri hedef etmektir. Bu bağlamda, bir kaç çalışmada, elektroporasyon ya da mikroenjeksiyon ile 8-10 hücrelere katılan bir hücre içi pH göstergesi olarak HPTS kullanımını sermiştir. Bu teknikler yani elektro hücrelere geniş zararlara yol açar, ve m...

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">Solutions for calibration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">L-11621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">M-12445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">D-Glucose (dextrose)</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">HEPES</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">M-1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Deionized water</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Nigericin</td>
			<td style="width:136px;">Calbiochem</td>
			<td align="right" style="width:119px;">481990</td>
			<td>Toxic by inhalation or in contact with skin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:315px;">Keep protected from the light at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Culture dishes &#8709; 35mm</td>
			<td style="width:136px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">354456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">pH-sensing probes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:303px;">8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS)</td>
			<td style="width:136px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">H-348</td>
			<td>Keep away from the light at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:303px;">5-(and-6)-Carboxy SNARF&#174;-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate</td>
			<td style="width:136px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">C-1271</td>
			<td>Keep away from the light and humidity at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Dimethyl Sufoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">BP231-1&#160;</td>
			<td>Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">Phosphate buffered saline (PBS) 100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">M-12445</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">S369-1</td>
			<td>115 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:136px;">J.T Baker</td>
			<td style="width:119px;">3246-01</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Deionized water</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Autoclave and adjust pH to 7.4</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">Phosphate buffered saline (PBS) 1X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">PBS 100X</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">L-11621</td>
			<td>40,5 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Deoinized water</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Bring to 5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">pH modulators</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">&#160;Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B-1793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA)</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Ammonium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">A649-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous ph measurement in endocytic and cytosolic compartments in living cells using confocal microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Hücre içi ve endozomal / lızozomal hücre bölmelerine hem de pH değerinin ölçümü için aynı anda, rasyometrik floresan pH algılama Snarf-1 problar ve HPTS kullanılmıştır. HPTS endozomal / lizozom oran ölçer pH&#39;ı ölçümünü sağlar, oysa SNARF-1 sitosolik bölmesi ile sınırlandırılmıştır. 16 saat HPTS ile hücre yükleme endozomlar / lizozomlarında 4 seçici yerelleştirme sağlar. PH algılama probları ile yüklü HT-1080 hücreleri kaydedilen floresans tipik bir örneği, <s...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy at JoVE.com

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

Konfokal mikroskopi kullanılarak Yaşayan hücreler içinde endositik ve Sitosolik Bölümleri eşzamanlı pH Ölçümü

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

simultaneous-ph-measurement-endocytic-cytosolic-compartments-living

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K Görüntüleme.  Université de Sherbrooke. Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells. 