We thank Dr. Gilles Dupuis for critical reading of the manuscript. 
Funding
This work was supported by the Canadian Institutes for Health Research, grant # MOP-126173. C.M.D is a member of the Fonds de la Recherche en Sant&#233; (FRSQ)-funded Centre de Recherche Clinique &#201;tienne LeBel.

1. Preparação das soluções de calibração para pH celular <ol><li> Adicionar os seguintes compostos de cinco tubos cónicos de 50 ml separados para preparar soluções a 5 para ser utilizados para a calibração: <ul><li> De NaCl (1 ml de 1 M de NaCl) (NaCl 1 M = 0,58 g em 10 ml de H 2 0) </li><li> KCl (6,75 ml de 1 M de KCl) (1 M KCl = 0,75 g em 10 ml de H 2 0) </li><li> Glucose (1 ml de 1 M de D-glicose) (1M de D-Glucose = 1,80 g em 10 ml de H 2 0) </li><li> MgS0 4 (0,05 ml de 1 M de MgSO4) (1 M MgSO4 = 1,20 g em 10 ml de H 2 0) </li><li> HEPES 20 mM (1 ml de HEPES 1M) (HEPES 1 M = 2,38 g em 10 ml de H 2 0) </li><li> CaCl2 (0,05 ml de 1M de CaCl2) (1 M CaCl2 = 1,47 g em 10 ml de H 2 0) Prepare todas as soluções em duas vezes destilada H 2 O (DDH 2 O). </li></ul></li><li> Complete cada solução com 35 ml de ddH2O e misturar com um agitador magnético até entãolução é alcançado. </li><li> Ajustar o pH de cada solução com 1 N de KOH ou HCl 1 N para se obter os valores de 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 e 7,5 de pH. Em seguida, ajustar o volume com água desionizada até um volume final de 50 ml. </li><li> Medida 5 mg de nigericina e adicioná-lo ao 670 ul de EtOH absoluto para se preparar uma solução de 10 mM de nigericina estoque. Atenção: nigericina é altamente tóxico e deve ser manuseado com muito cuidado (luvas, óculos de segurança e máscara). Misture a solução por inversão até a nigericina esteja completamente dissolvido. </li><li> Adicionar 0,05 ml de nigericina 10 mM (concentração final 10 uM) a cada solução de calibração. Nigericina é um ionóforo que aumenta a permeabilidade da membrana da célula e causa de equilíbrio do pH intracelular e extracelular, na presença de uma concentração de despolarização de K + extracelular. </li><li> Soluções de calibração podem ser armazenados até 1 mês a 4 ° C </li></ol> 2. Preparação celular <ol><li> Sob um Safet biológicay capuz, as células de semente de 35 milímetros x 10 milímetros em pratos de cultura de 2 ml de meio de crescimento suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibióticos. Utilizar a quantidade de células necessárias para assegurar cerca de 50% de confluência após 24 hr. NOTA: Em nossos experimentos, usamos a linha de células HT-1080 e placa 1 x 10 5 células por placa de cultura. </li><li> Determinar o número de pratos de cultura necessárias para a 5 pratos de cultura adicionais experimento e placa a ser usada para a calibração. </li><li> Pratos de cultura em lugar de um de 37 ° C / 5% de CO2 durante pelo menos 24 horas. </li></ol> 3. Preparação de Sondas de pH sensores <ol><li> Prepare uma solução estoque 1M da sonda fluorescente pH 8 hidroxipireno-1, 3,6 trissulfónico, sal trissódico (HPTS / piranina) em DDH 2 a 0. Esta solução deve ser armazenada à temperatura ambiente e protegida da luz. </li><li> Prepara-se uma solução de reserva de 1 mM de 5 - (e-6)-carboxil seminaphthorhodafluor acetoximetil éster de etilo (C-SNARF-01:00; chamado Thereaepois SNARF-1) através da dissolução de 1 mg de SNARF-1 em 1,76 ml de DMSO. Misture bem por pipetagem repetida. SNARF-1 solução deve ser armazenada a -20 ° C e protegida da luz. </li></ol> 4. Labeling celular <ol><li> Dezasseis horas antes de imagem ao vivo de células, adicionar 2 ml de solução de estoque 1M HPTS (concentração final 1 mM) para cada placa de cultura contendo 2 ml de meio completo. </li><li> Retorne os pratos de cultura para a incubadora. A sonda HPTS é célula-impermeant, portanto, a etiqueta organelas a sonda deve ser tomada por pinocitose. Esta condição implica que as incubações das células com HPTS são realizadas em meio de cultura suplementado com soro. </li><li> Após a incubação com HPTS, lavar as células duas vezes com PBS estéril e adicionar 2 ml de meio isento de soro, durante pelo menos 2 horas. A incubação com SNARF-1 tem de ser realizada em meio isento de soro, porque o soro pode impedir a absorção da sonda. </li><li> Adicionam-se 10 ul de uma SNARF-1 de solução stock a 1 mM para se obter afinal concentração de 5 uM e permitir que as células a incubar durante 20 minutos a 37 ° C, sob luz fraca. C-1-SNARF concentração e tempo de incubação pode variar de acordo com o tipo de célula. </li><li> No final da incubação, lavar as células duas vezes em PBS estéril e adicionar 2 ml de meio isento de soro. </li></ol> 5. Adição de pH moduladores <ol><li> Para avaliar se o método pode detectar alterações de pH nas células, diferentes reagentes que modulam o pH intracelular pode ser usado: <ul><li> Bafilomicina A1, um inibidor específico da V-ATPase 5 </li><li> Isoforma permutador Na + / H + 1 (NHE-1) 6 </li><li> NH4Cl, uma base fraca que aumenta o pH intracelular 7 </li></ul><ol><li> Preparar soluções estoque de reagentes mencionados acima: <ul><li> Bafilomicina A1: acrescentar 10 ug de bafilomicina A1 a 160 ul de DMSO para se obter uma solução stock de 100 uM </li><li> EIPA: adicionar 25 mg de EIPA para 1,67 ml de metanol a obtina concentração final de 50 mM </li><li> NH4Cl: dissolver 0,53 g de cloreto de amónio em 10 ml de ddH2O para obter uma concentração final de 1 mM. </li></ul> Nota: Todas as soluções de reserva deve ser mantida a 4 ° C, excepto para bafilomicina A1, que deve ser armazenada a -20 ° C e protegida da luz. </li><li> Em pratos de cultura separados, adicionar um dos reagentes, tal como descrito abaixo: <ul><li> 2 ul de 100 uM bafilomicina A1 (concentração final 100 nM) </li><li> 1 ul de EIPA 50 mM (concentração final 25 uM) </li><li> 40 ul de 1M de NH 4 Cl (concentração final 20 mM) </li></ul></li><li> Incubar as células durante 30 min a 37 ° C. </li></ol></li><li> Vá para a aquisição de imagem. </li></ol> 6. Especificações do Microscópio de imagem de células vivas e configurações de aquisição <ol><li> Realize imagens ao vivo de células usando uma objetiva de 40X montado em um invertido digitalização microscopia confocal espectralpe equipado com um estágio XY motorizada, uma câmara de vidro que acomoda placas de cultura de fundo em um ambiente controlado (temperatura, umidade, CO 2) fase incubadora. </li><li> O instrumento confocal (Olympus FV1000) usada aqui está equipado com: <ul><li> Um laser de diodo 405 nm </li><li> Um laser de argônio de 40 mW (458 nm, 488 nm, 515 nm) </li><li> Um laser neon hélio (543 nm) </li><li> Objetivo de fluorita de 10x, NA0.4 </li><li> Um objectivo LUCPLFLN 40X, NA0.60 </li><li> Um objectivo óleo PLAPONSC PLANO APO 60X, NA1.4 </li><li> Um espelho dicróico 405/458/488/543 DM </li><li> A SDM 560 e um SDM 640 filtros dicróicas </li><li> Um filtro de barreira BA655-755 </li><li> A BS20/80 divisor de feixe </li><li> O software de análise de dados para a aquisição e análise de imagem, </li></ul></li><li> Uma vez que a incubadora estágio tem aquecido até 37 ° C e o microscópio está configurado, coloque um prato de cultura previamente incubadas com HPTS e SNARF-1 para a câmara de estágio imagem confocal. </li><li> Aepois de localizar uma área de interesse, ajuste as configurações de aquisição de software Figura 1. <ul><li> Configure dois conjuntos de canais virtuais. </li><li> Iniciar a primeira fase que corresponde ao HPTS excitação a 405 nm e coleta de emissão em 505-525 nm e SNARF-1 de excitação em 543 nm e coleta de emissão em 570-600 nm. </li><li> Inicie a segunda fase que corresponde ao HPTS excitação em 458 nm e coleta de emissão em 505-525 nm e SNARF-1 de excitação em 543 nm e coleta de emissão em 640 - 650 nm. </li><li> A abertura confocal está definido para 175 um por padrão e abertura ideal precisa ser configurado manualmente em 300 mm. </li><li> Tome Imagem por empilhamento de série secções ópticas horizontais (800 x 800 pixels) de 0,4 m de espessura. </li></ul></li></ol> NOTA: uma objetiva de 40X é útil para observar várias células simultaneamente e funciona bem para a visão organela. No entanto, a resolução espacial e intensidade do sinal são better conseguido usando uma objetiva de óleo 60X. Além disso, não há excitação ou de emissão de conversa cruzada entre os dois corantes. 7. Calibração de Sondas de pH de sensoriamento <ol><li> Antes da calibração, remover o meio da placa de cultura previamente incubadas com HPTS e SNARF-1, lavar duas vezes com PBS estéril e, em seguida, adicionar 2 ml de uma das cinco soluções de calibração. </li><li> Coloque o prato de cultura na câmara de estágio confocal. </li><li> Vá para a aquisição de imagens de lapso de tempo de acordo com as seguintes definições: <ol><li> Defina o número de imagens e tempo de duração do intervalo para o experimento. NOTA: Normalmente usamos um intervalo de 1 min entre as imagens por até 30 min. </li><li> Programe o obturador para fechar entre a aquisição de cada imagem. </li></ol></li><li> Gravar a intensidade de fluorescência por minuto em um software de folha de cálculo e de determinar o momento em que a intensidade de fluorescência é constante. PH intracelular é geralmente estável depois de 15 - 20 min. </li><li> REPEAT os passos 7.1 a 7.4 usando um novo prato de cultura para cada solução de calibração restante. </li></ol> 8. Aquisição de Dados <ol><li> Uma vez que a calibração foi feito, adquirir dados de amostra 4-5 campos escolhidos aleatoriamente contendo 15-20 células por campo. Duas imagens são obtidas para cada campo: um para rotulagem HPTS (vesículas) e o segundo para SNARF-1 rotulagem (citosol). </li><li> A fluorescência de fundo (zona extracelular) é subtraído digitalmente imagens fluorescentes de ambas as sondas. Vesículas rotulados e citosol de suas respectivas imagens armazenadas são selecionados usando uma máscara binária. Para cada sonda de pH-sensing, intensidades de fluorescência são medidos em uma escala numérica (0-4,095 escala de nível de cinza). A intensidade média de todos os pixels na organelo ou citoplasma é calculada e os valores são utilizados para calcular os rácios de fluorescência. </li></ol> 9. Data Analysis <ol><li> Vários pacotes de software estão comercialmente disponíveis para a análise de dados. IstoSoftware FluoView. </li><li> Em uma planilha, valores de registro e calcular índices de fluorescência da seguinte forma: No caso de HPTS, R = (F 458 nm / F 405 nm) e, no caso de SNARF-1, R = (F 644 nm / F 584 nm ). </li><li> Plotar os dados usando o software de gráficos científica como GraphPad Prism. A trama deve representar proporções de fluorescência (eixo Y) como uma função do pH (eixo X). Ajuste de curva é obtida por meio de regressão não-linear. </li><li> Recolhe intensidades de fluorescência das amostras, conforme descrito no passo 8.2 e calcular rácios de fluorescência. Use as curvas de calibração para transformar proporções em valores de pH. </li></ol>

<ol>
	<li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+Homeostasis+of+cellular+organelles.">pH Homeostasis of cellular organelles.</a> News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).</li><li>Hinton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+a+subunit+isoforms+of+the+V-ATPase+in+pH+homeostasis+and+in+vitro+invasion+of+MDA-MB231+human+breast+cancer+cells.">Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells.</a> J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).</li><li>Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+intraorganelle+pH+in+the+endosomal-lysosomal+pathway+in+neurons+by+using+ratiometric+imaging+with+pyranine.">Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).</li><li>Drose, S., Altendorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycins+and+concanamycins+as+inhibitors+of+V-ATPases+and+P-ATPases.">Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases.</a> J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).</li><li>Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHE1+inhibition+by+amiloride-+and+benzoylguanidine-type+compounds.+Inhibitor+binding+loci+deduced+from+chimeras+of+NHE1+homologues+with+endogenous+differences+in+inhibitor+sensitivity.">NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity.</a> J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).</li><li>Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-pH+crosstalks+in+rat+mast+cells:+cytosolic+alkalinization,+but+not+intracellular+calcium+release,+is+a+sufficient+signal+for+degranulation.">Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation.</a> Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).</li><li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+intracellular+pH.">Fluorescent indicators for intracellular pH.</a> Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).</li><li>Giuliano, K. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intracellular+pH+of+BALB/c-3T3+cells+using+the+fluorescence+of+pyranine.">Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine.</a> Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).</li><li>Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intracellular+pH+changes+on+resting+cytosolic+calcium+in+voltage-clamped+snail+neurones.">The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones.</a> J Physiol. 530, 405-416 (2001).</li></ol>

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Medição de pH quantitativa em imagens ao vivo de células de diferentes compartimentos celulares é necessário para medir com precisão as variações de pH em respostas das células aos desafios externos. No entanto, um dos principais obstáculos que resta é fácil e visam especificamente compartimentos celulares. A este respeito, alguns estudos puseram em evidência o uso de HPTS como um indicador de pH intracelular introduzido nas células por electroporação ou microinjecção 8-10. Estas técnicas s...

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">Solutions for calibration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">L-11621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">M-12445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">D-Glucose (dextrose)</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">HEPES</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">M-1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Deionized water</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Nigericin</td>
			<td style="width:136px;">Calbiochem</td>
			<td align="right" style="width:119px;">481990</td>
			<td>Toxic by inhalation or in contact with skin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:315px;">Keep protected from the light at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Culture dishes &#8709; 35mm</td>
			<td style="width:136px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">354456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">pH-sensing probes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:303px;">8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS)</td>
			<td style="width:136px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">H-348</td>
			<td>Keep away from the light at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:303px;">5-(and-6)-Carboxy SNARF&#174;-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate</td>
			<td style="width:136px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">C-1271</td>
			<td>Keep away from the light and humidity at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Dimethyl Sufoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">BP231-1&#160;</td>
			<td>Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">Phosphate buffered saline (PBS) 100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">M-12445</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">S369-1</td>
			<td>115 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:136px;">J.T Baker</td>
			<td style="width:119px;">3246-01</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Deionized water</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Autoclave and adjust pH to 7.4</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">Phosphate buffered saline (PBS) 1X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">PBS 100X</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">L-11621</td>
			<td>40,5 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Deoinized water</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Bring to 5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">pH modulators</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">&#160;Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B-1793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA)</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Ammonium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">A649-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous ph measurement in endocytic and cytosolic compartments in living cells using confocal microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Para a medição simultânea de pH em ambos os compartimentos da célula intracelular e endossomal / lisossomal, foram usadas as sondas de pH de detecção fluorescente raciométrica Snarf-1 e HPTS. SNARF-1 é restrita ao compartimento citosólico enquanto HPTS permite a medição de o compartimento endossomal / lisossomal raciométrica pH. Carregamento celular com HPTS para 16 horas permite a sua localização seletiva em endossomas / 4 lisossomos. Um exemplo típico de fluorescência registada a partir de c...

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Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

Medição simultânea em pH endocítica e citossólicos Compartimentos em células vivas usando microscopia confocal

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.9K visualizações.  Université de Sherbrooke. Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells. 