Ringraziamo il Dr. S. Stella e Helen Vuong per contributi al protocollo di imaging del calcio. Ringraziamo Fogli Dr. K. per girare le scene di intervista. Ringraziamo il Dr. Arlene Hirano per i suoi commenti sul manoscritto. Questo progetto di ricerca e sviluppo è stata condotta da presso la David Geffen School of Medicine presso la UCLA autori ed è reso possibile da un accordo di contratto che è stato assegnato e gestito dal Medical Research e Materiel Command dell&#39;Esercito degli Stati Uniti (USAMRMC) e la Telemedicina &amp; Advanced Technology Research Center (TATRC), a Fort Detrick, nel Maryland sotto Numero del contratto: W81XWH-10-2-0077. Il supporto per questi studi è arrivato anche dal NIH EY04067 e una recensione Merito VA (NB). BCN è un VA Career Research Scientist.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida per il benessere degli animali da esperimento emesse dalla politica US Public Health Service on Human Care e uso di animali da laboratorio e la University of California-Los Angeles (UCLA) comitato per la ricerca degli animali. Sono stati utilizzati Maschio e femmina adulto ratti Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) tra l&#39;età di 3-5 settimane. 1. animali e tessuti Preparazione Wholemount Retina e Immunoistochimica protocollo <ol><li> Preparare i seguenti materiali e strumenti: un microscopio da dissezione, 2 pinze con punte molto fini, forbici, carta da filtro di cellulosa, pipetta di plastica e un vetrino da microscopio. </li><li> Euthanize il topo in una camera chiusa da anestetizzare profondamente l&#39;animale con il 1-3% isoflurano seguita da decapitazione con una ghigliottina. Rimuovere gli occhi con un paio di forbici iris e posto in una capsula di Petri contenente la soluzione extracellulare. Hibernate A, Ames Mesono raccomandati dium o soluzioni fisiologiche. </li><li> [Passo Facoltativo se riempimento di RGCs con Fluo-4 è desiderato]. Eseguire l&#39;etichettatura Fluo-4 come descritto nei passaggi 2,3-2,4. </li><li> Utilizzando il microscopio da dissezione (intensità della luce: 1,6 x 10 8 fotoni / mm 2 ⋅sec), rimuovere la cornea tagliando la parte anteriore del bulbo oculare. Rimuovere la lente e vitreo dalla superficie retinica interna con una pinza. Per rimuovere il vitreo, stabilizzare il bulbo oculare tenendo la sclera saldamente con una pinza. Rimuovere delicatamente la base del vitreo verso il centro della retina con l&#39;altra pinza. La preparazione in questa fase si chiama oculare, che viene utilizzato per criosezioni. Maggiori informazioni su criosezioni possono essere trovati nei riferimenti 14,15. </li><li> Rimuovere la retina dalla oculare. Quindi, fare quattro tagli per consentire la retina per distesi. Montare delicatamente la retina su un vetrino da microscopio con il fotorecettore livello verso l&#39;alto. Aggiungere una goccia di soluzione alla retina e mettere cecarta da filtro llulose sulla retina. Una volta che la retina si attacca alla carta da filtro, posizionare la retina posteriore in soluzione. Se necessario, appiattire la retina con una spazzola o pinze. </li><li> Posizionare le retine wholemounted in PFA 4% per 10-15 minuti per il fissaggio. </li><li> Lavare le retine wholemounted tre volte per 30 min in tampone fosfato 0,1 M (PB), pH 7.4. Bloccare le retine con il 5% di siero di capra normale o siero asino in 0,1 PB contenente 0,3% Triton X-100 e 0,1% NaN 3 a 4 ° C durante la notte. Si consiglia un volume finale di 500 ml per tutti i passi per salvare le soluzioni di blocco e anticorpi. </li><li> Il giorno dopo, incubare le wholemounts retine con le primarie di anticorpi 5-7 giorni a 4 ° C. Diluizioni ottimali devono essere determinati dall&#39;utente. </li><li> Lavare le retine 3 x 30 min in PB 0.1 M e incubare una notte a 4 ° C nel corrispondente anticorpo secondario fluoroforo coniugato diretto contro le specie del anticorpo primario (concentrazione 1: 1.000). </li><li> Dopo tre lavaggi finali di 30 minuti ciascuno con PB, montare le retine di mezzo di montaggio. Sigillare il coprioggetto con smalto per lo stoccaggio prolungato. Conservare i campioni a 4 ° C e proteggere dalla luce. </li></ol> 2 Etichettatura delle cellule gangliari e degli assoni in Rat Wholemount retine con un calcio colorante indicatore <ol><li> Preparare 1.000 ml di mammiferi Ringer contenente (in mM) 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 1 MgCl2, 25 NaHCO3 e 10 glucosio bolliti con 95% O 2/5% di CO &#173; 2. </li><li> Eseguire la dissezione, come descritto nella procedura 1.2-1.4. </li><li> Per caricare le cellule gangliari retiniche (RGC) e dei loro assoni con un indicatore di calcio colorante, iniettare 0,5 ml di Fluo-4 sale pentapotassico (40 mM magazzino in H 2 O) nel moncone del nervo ottico di circa 1 mm posteriormente al bulbo oculare con una siringa . Per misurare gli aumenti dinamici in cellule gangliari [Ca 2 + </sup&gt;] ho un indicatore con alta affinità, come Fluo-4 con il suo K d di 345 nm, è ottimale. Fluo-4 offre l&#39;ulteriore vantaggio di avere una altissima efficienza quantica con un conseguente aumento delle emissioni di&gt; 100 volte quando si lega al calcio. </li><li> Mettere il paraocchi in mammiferi di Ringer bollito con il 95% O 2/5% di CO &#173; 2 per 1 ora a temperatura ambiente al buio. </li></ol> 3. Imaging di calcio Protocollo per cellule gangliari retiniche e assoni. <ol><li> Rimuovere l&#39;occhio, cristallino e vitreo come descritto nei passaggi 1,1-1,4. Isolare la retina dalla oculare e dividere in quadranti. Mount lato cellule gangliari un quadrante su un vetrino e utilizzare una griglia fetta arpa per stabilizzarlo. Mantenere gli altri pezzi dark-adattato in mammiferi di Ringer bollito con il 95% O 2/5% di CO &#173; 2 su ghiaccio per un uso successivo. </li><li> Superfuse camera di registrazione con la soluzione di Ringer e mammiferimantenere la soluzione ribolle continuamente con il 95% O 2/5% di CO 2. </li><li> Immagine il tessuto al microscopio. Condurre esperimenti a temperatura ambiente (~ 23 ° C) o raggiungono temperature fisiologiche riscaldando il palco, riscaldando il bagno d&#39;acqua sotto il campione o l&#39;applicazione di aria calda sulla superficie del campione. Nota: E &#39;importante notare che molte funzioni cellulari sono regolate dalla temperatura, che svolge un ruolo chiave nel mantenimento dell&#39;omeostasi intracellulare 16. Tuttavia, l&#39;introduzione di misure di riscaldamento può aumentare il tasso di photobleaching, evaporazione della deriva medio e fuoco causata dall&#39;espansione termica 17. L&#39;uso della temperatura ambiente diminuisce intracellulare compartimentalizzazione di Fluo-4 18. </li><li> Eseguire un controllo di due K + impulsi alti appaiati in assenza di farmaci. Depolarizzare RGCs e assoni RGC aumentando la [K +] o da 3 mm a 60 mm per 33 secondi durante ogni impulso per attivareVGCCs con un sistema di superfusione guidato otto gravità canale. Ridurre Na + da 57 mm per mantenere isosmolarity nella soluzione di elevata K +. </li><li> Valutare il contributo delle diverse VGCCs al segnale di calcio con l&#39;uso di bloccanti generali o specifici del canale Ca. Ad esempio, la riduzione del segnale calcio dopo la somministrazione di un non-specifico bloccante dei canali del calcio, cobalto, purché una misura semi-quantitativa del contributo dei VGCCs all&#39;alta K + segnale calcio -evoked. </li><li> Acquisire i valori di intensità di fluorescenza posizionando una regione di interesse (ROI) intorno alle RGC di interesse (Figura 2). </li><li> Normalizza la variazione di intensità di fluorescenza prodotta dal secondo alta K + picco alla variazione prodotta dalla prima alta K + picco. Poi, per la sperimentazione di specifici bloccanti dei canali del calcio, farmaci applicare solo nel corso del secondo alto K + impulso di una coppia e normalizzare questo picco controil primo valore di picco. Per misurare l&#39;effetto del farmaco in alto K + picco, dividere l&#39;ampiezza del secondo picco K + da quella del primo. L&#39;analisi deve essere eseguita su questi valori rispetto ai loro controlli corrispondenti derivati ​​dal accoppiato alta K + picchi misurata in assenza di farmaco. </li><li> Acquisire immagini a intervalli di 5 sec. Per evitare foto-sbiancamento, mantenere l&#39;eccitazione laser più basso possibile. Fornire eccitazione dalla linea 488 nm del laser argon, mentre il tubo fotomoltiplicatore raccoglie l&#39;emissione fluorescente attraverso un filtro LP 505 nm. </li></ol>

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Gli autori non hanno informativa.

In questo articolo, abbiamo descritto due diverse tecniche: 1) L&#39;immunoistochimica per mostrare Fluo-4 localizzazione delle cellule gangliari della retina in wholemounts, e 2) Calcio Imaging per analizzare le dinamiche del calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni. Immunoistochimica utilizzando wholemounts è stato utilizzato per rivelare la localizzazione delle proteine ​​nei roditori retina 20-23. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni. La qualità della c...

Cellule gangliari retiniche (RGC) esprimono L, N-, P / Q e T-tipo VGCC come determinato attraverso il blocco farmacologico di queste componenti della cellula intera Ca canale corrente 1,2. VGCC sono proteine ​​transmembrana multimerici che sono coinvolte nel rilascio del trasmettitore, la trascrizione del gene, regolazione cellulare e sinaptica plasticità 3,4,5. VGCCs funzionali sono costituiti da almeno tre classi distinte di subunità: grandi, transmembrana α 1 formano pori subunità che stabiliscono proprietà biofisiche e farmacologiche del canale, α ausiliario principalmente extracellulare 2 subunità δ e subunità β intracellulari. Gli ultimi due complessi di forma eteromerici con diverse subunità α 1 e alterano la cinetica gating e il traffico dei canali alla membrana plasmatica 6. Negli ultimi decenni, molte tecniche sono state impiegate per lo studio delle proteine ​​espresfissione, come la immunoistochimica, enzyme-linked test immunoenzimatico, analisi occidentale e citometria a flusso. Queste tecniche richiedono l&#39;uso di anticorpi specifici per l&#39;individuazione di una data proteina di interesse e forniscono strumenti potenti per la localizzazione e la distribuzione di proteine ​​specifiche nei diversi tessuti. Le tecniche utilizzate per rilevare e quantificare i livelli di espressione di mRNA di una particolare proteina come l&#39;analisi Northern blot, RT-PCR, real-time RT-PCR, ibridazione in situ, cDNA microarray e analisi di protezione della ribonucleasi forniscono un approccio alternativo quando gli anticorpi non sono facilmente livelli di espressione disponibile o se di una particolare proteina sono bassi 7. Tuttavia, una limitazione all&#39;uso di tali tecniche molecolari è l&#39;identificazione desiderata della sequenza genica. Per localizzare proteine ​​nella retina, immunoistochimica può essere eseguita su retine wholemount. A causa della accessibilità dei RGCs, la wholemountpreparazione fornisce una piattaforma eccellente per studiare la localizzazione di specifiche proteine ​​al somata RGC e dei loro assoni. Oltre alla loro localizzazione, alcune proprietà funzionali dei VGCCs in RGC sono evidenziabili attraverso l&#39;uso di tecniche di imaging calcio. Descriviamo un protocollo di imaging del calcio di etichettare selettivamente RGCs con un indicatore di calcio colorante per misurare la dinamica del calcio intracellulare. Il contributo di diversi VGCCs al segnale calcio in differenti compartimenti cellulari può essere isolata con l&#39;uso di specifici del sottotipo Ca bloccanti dei canali. Forse uno degli aspetti più positivi della tecnica di imaging del calcio qui descritta è la capacità di registrare simultaneamente e indipendentemente da più RGCs e dei loro assoni. Anche se molte tecniche fisiologiche, come ad esempio intera registrazione patch clamp cellulare, forniscono ad alta risoluzione temporale registrazioni delle correnti di membrana, il somatico o fonte assonale di thesE le correnti registrate non possono essere discriminati e registrazioni possono essere effettuate solo da un singolo neurone alla volta. Array multielettrodico (MEA) sono in grado di registrare simultaneamente punte da molte cellule, ma possono né rilevare né discriminare l&#39;attivazione di, ad esempio, diversi sottotipi di canali del calcio. MEAS preferenzialmente registrare da cellule che si trovano in prossimità di un dato elettrodo 8 e registrare da cellule che generano grandi picchi 9. Metodi di imaging ottici forniscono una strategia alternativa per consentire le registrazioni simultanee e indipendenti di intere popolazioni di cellule che possono essere integrate con le informazioni ottenute da microelettrodo singola cellula e la registrazione patch clamp e la registrazione MEA. Sebbene le tecniche di imaging del calcio qui descritti sono stati impiegati per studiare la dinamica del calcio di RGCs, patch clamp e MEA può essere utilizzato anche in parallelo per chiarire ulteriormente le correnti ioniche e spiking proprietà dei RGCs. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Dato che le cellule amacrine sfollati costituiscono circa il 60% della popolazione neuronale nello strato di cellule gangliari della retina di topo 10, il nostro obiettivo era quello di utilizzare una tecnica di carico che etichette selettivamente RGCs con un indicatore di calcio sintetico colorante in un preparazione wholemount. Sebbene coloranti sintetici indicatori di calcio offrono una piattaforma eccellente per lo studio della dinamica del calcio intracellulare, la sua diffusione è stata ostacolata dall&#39;incapacità di caricare efficacemente specifiche popolazioni di neuroni all&#39;interno di una data rete. Molte tecniche come la massa di carico 11 ed elettroporazione 8,12 sono stati eseguiti per caricare intere popolazioni di cellule, tuttavia, tali tecniche non discriminano tra i tipi cellulari specifici. Geneticamente codificati indicatori di calcio offrono la possibilità di etichettare selettivamente specifiche popolazioni di cellule, tuttavia, tali metodi richiedono la generazione di animali transgenici 13. La nostra tecnica descrive un metod di etichettare selettivamente RGCs nella preparazione wholemount tramite ottico iniezione moncone del nervo di un indicatore di calcio colorante. Nel loro insieme, le tecniche strutturali e fisiologiche descritte in questo articolo fornire una piattaforma per studiare la localizzazione e il contributo delle VGCCs al segnale calcio nel RGCs e dei loro assoni.

<table><tbody><tr><td>Straight scissors</td><td>WPI</td><td>14124-G</td><td>dissecting tools</td></tr><tr><td>Straight Forceps</td><td>WPI</td><td>501985</td><td>dissecting tools</td></tr><tr><td>curved iris scissors</td><td>WPI</td><td>504487</td><td>dissecting tools</td></tr><tr><td>Cellulose filter paper</td><td>Millipore</td><td>HABP04700</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate A</td><td>Invitrogen</td><td>&lt;a href=&quot;http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;amp;productID=A1247501&quot;&gt;A12475-01&lt;/a&gt;</td><td>Media</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.google.com/url?sa=t&amp;amp;rct=j&amp;amp;q=&amp;amp;esrc=s&amp;amp;source=web&amp;amp;cd=1&amp;amp;cad=rja&amp;amp;sqi=2&amp;amp;ved=0CC0QFjAA&amp;amp;url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx%3FcatID%3D279&amp;amp;ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw&amp;amp;usg=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA&amp;amp;sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg&amp;amp;bvm=bv.48705608,d.cGE&quot;&gt;Mounting Media for Fluorescence&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Fluo-4 pentapotassium</td><td>Invitrogen</td><td>F-14200</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Laboratories</td><td>05260-05</td><td>anesthesia</td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-178-277</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 5 Pascal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11034</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>ProSci, Poway, CA</td><td></td><td>A rabbit polyclonal antibody&amp;nbsp;was generated against the N-terminus of the RBPMS&amp;nbsp;polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).</td></tr></tbody></table>

immunohistochemical and calcium imaging methods in wholemount rat retina

In questo documento si descrivono gli strumenti, reagenti, e le misure pratiche che sono necessarie per: 1) preparazione di successo di retine wholemount per immunoistochimica e, 2) Calcio Imaging per lo studio di tensione gated canali del calcio (VGCC) mediata segnalazione di calcio in retina cellule gangliari. Il metodo di imaging del calcio descriviamo questioni aggira in materia di non-specifico carico di cellule amacrine sfollati nello strato di cellule gangliari.

Immunomarcatura con anticorpi specifici fornisce una piattaforma per studiare la localizzazione di particolari proteine ​​di interesse nella retina e la tecnica di imaging calcio permette lo studio del contributo dei VGCCs verso le dinamiche di calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni. Utilizzando un anticorpo contro le RBPMS proteine ​​delle cellule gangliari (RNA binding protein con splicing multipla) che identifica selettivamente RGCs 19, siamo stati i...

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Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Immunoistochimica protocolli sono utilizzati per studiare la localizzazione di una specifica proteina nella retina. Tecniche di imaging di calcio sono impiegate per studiare le dinamiche del calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni.

Metodi di imaging immunoistochimici e di calcio in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

immunohistochemical-calcium-imaging-methods-wholemount-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.4K Views.  University of California, Los Angeles.  Immunoistochimica protocolli sono utilizzati per studiare la localizzazione di una specifica proteina nella retina. Tecniche di imaging di calcio sono impiegate per studiare le dinamiche del calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni. 

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Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mappatura ottico dei potenziali d&#39;azione e transitori Calcio nel Cuore mouse

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Ricerca

Bioingegneria

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dinamica a cono fotorecettore Axon Terminali della retina di topo

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Neuroscienze

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Risoluzione alta analisi quantitativa Immunogold di Recettori di membrana a retina nastro Sinapsi

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Biologia

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imaging del calcio nell'oliva inferiore del topo

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Imaging a due fotoni e calcio ad ampio campo nel collicolo superiore

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Autore in primo piano: Svelare la codifica neurale e i meccanismi di elaborazione visiva nel collicolo superiore 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Valutazione dell'attività del calcio nello strato di cellule gangliari retiniche

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the impaired light-sensing photoreceptor cells in the degenerated retina, aiming to partially restore vision by inducing visual percepts. One common avenue of investigation involves the design and production of implantable devices with a flexible physical structure, housing a high number of electrodes. This enables the efficient and precise generation of visual percepts. However, with each technological advancement, there arises a need for a reliable and manageable ex vivo method to verify the functionality of the device before progressing to in vivo experiments, where factors beyond the device's performance come into play. This article presents a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer (GCL) following electrical stimulation. Specifically, the following steps are outlined: (1) fluorescently labeling the rat retina using genetically encoded calcium indicators, (2) capturing the fluorescence signal using an inverted fluorescence microscope while applying distinct patterns of electrical stimulation, and (3) extracting and analyzing the calcium traces from individual cells within the GCL. By following this procedure, researchers can efficiently test new stimulation protocols prior to conducting in vivo experiments.

Autore in primo piano: Un approccio innovativo alla stimolazione elettrica neurale utilizzando l'imaging del calcio 

Retinal prostheses have the ability to generate visual perceptions. To advance the development of new prostheses, ex vivo methods are needed to test devices before implantation. This article provides a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer when subjected to electrical stimulation.

Imaging del calcio nelle retine piatte stimolate elettricamente

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

Metodi di imaging immunoistochimici e di calcio in Wholemount Rat Retina

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Mappatura ottico dei potenziali d'azione e transitori Calcio nel Cuore mouse

Imaging Ca

Risoluzione alta analisi quantitativa Immunogold di Recettori di membrana a retina nastro Sinapsi

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

In vivo Imaging del calcio nell'oliva inferiore del topo

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo

Imaging del calcio nelle retine piatte stimolate elettricamente