Gli autori vorrebbero riconoscere il contributo di Meritxell Romeu-Nadal allo studio sui ratti.

1. Procedure di animali <ol><li> Tutti i lavori degli animali deve essere effettuata in conformità con le Home Office Animals (Scientific Procedures) Act (1986). </li><li> Mate ratti Wistar di età compresa tra 10 settimane da allevamento monogama, e confermare la gravidanza dalla comparsa di un tappo vaginale. Registrare questo come il giorno 1 di gestazione, e di iniziare la dieta sperimentale. Per le femmine vergini, ospitare ogni ratto individualmente, e iniziare la dieta sperimentale. </li><li> Dopo l&#39;alimentazione diete sperimentali per 20 giorni euthanize ratti di CO 2 asfissia seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Utilizzare pinze e forbici dissezione per esporre la cavità addominale e asportare il fegato tagliando i legamenti, che collegano il fegato al diaframma, parete anteriore dell&#39;addome, dello stomaco e del duodeno. Lavare il fegato in PBS e congelare in azoto liquido prima della conservazione a -80 ° C. </li></ol> 2. Preparazione di un estratto lipidico totale 9 <ol><li> Aggiungi moleculsetacci AR (per riempire 1/10 del contenitore di solvente) a tutti i solventi per creare solventi &#39;a secco&#39;. Eseguire tutti i lavori di solvente all&#39;interno di una cappa aspirante. </li><li> Tagliare circa 100 mg di fegato congelato e pesare. Collocare il tessuto in un tubo in un secchio di ghiaccio ed aggiungere 0,8 ml di ghiaccio freddo 0,9% NaCl. Omogeneizzare il tessuto. </li><li> Aggiungere standard interni disciolti in 1 ml / mg di cloroformio secco: metanolo (2:1, v / v) contenente idrossitoluene butilato (BHT; 50 mg / l) come antiossidante. Per 100 mg di fegato di ratto aggiungono 100 mg di campione del CE (Cholesteryl heptadecanoate 17:00). Attenzione: Cloroformio e BHT sono pericolosi. </li><li> Aggiungere 5,0 ml di cloroformio: metanolo secco (2:1, v / v) contenente BHT (50 mg / L). </li><li> Aggiungere 1,0 ml di 1 M NaCl, mescolare accuratamente nel vortex fino a quando la miscela appare uniforme. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana. </li><li> Centrifugare a 1000 xg per 10 min, bassa freno a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere più bassofase utilizzando Pasteur vetro pipetta, trasferire al nuovo tubo di vetro tappo a vite e secco sotto azoto a 40 ° C. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana. </li></ol> 3. Separazione delle classi di lipidi mediante estrazione in fase solida (SPE) 10 <ol><li> Collegare il serbatoio SPE ad una pompa da vuoto e posizionare aminopropyl cartuccia SPE silice sul serbatoio. </li><li> Posizionare nuovo tubo di vetro con tappo a vite TAG etichettati e CE nel rack serbatoio sotto la colonna di raccogliere prima frazione. </li><li> Sciogliere l&#39;estratto totale di lipidi in 1,0 ml di cloroformio secco e vortex. </li><li> Applicare il campione alla colonna con una pipetta Pasteur di vetro e far gocciolare attraverso la colonna tappo a vite per gravità. Quando ulteriori gocce cadono, rimuovere il liquido residuo sotto vuoto. </li><li> Eluire la frazione TAG e CE sotto vuoto, lavare la colonna con 2 x 1,0 ml di cloroformio lavaggi a secco. </li><li> Quando viene rimosso tutto il liquido, asciugare il TAG e CE frazionamenton sotto azoto a 40 ° C. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana. </li><li> Posizionare nuovo tappo a vite tubo di vetro PC etichettata nel cassetto serbatoio sotto la colonna. </li><li> Eluire la frazione PC sotto vuoto con l&#39;aggiunta di 2 x 1,0 ml di cloroformio secco: metanolo (60:40, v / v) fino a quando tutto il liquido viene rimosso dalla colonna. </li><li> Rimuovere e frazione PC secco sotto azoto a 40 ° C. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana. </li><li> Collocare un nuovo tappo a vite tubo di vetro PE etichettato nel vassoio serbatoio ed eluire frazione PE con l&#39;aggiunta di 1,0 ml di metanolo secco sotto vuoto. </li><li> Rimuovere e frazione PE secco sotto azoto a 40 ° C. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana. </li><li> Posizionare nuovo tubo di vetro con tappo a vite etichettata NEFA nel vassoio serbatoio ed eluire frazione NEFA sotto vuoto con l&#39;aggiunta di 2 x 1,0 ml di cloroformio lavaggi a secco: metanolo: acido acetico glaciale. (100:2:2, v / v / v) Attenzione: acido acetico glaciale è pericoloso. </li><li> Rimuovere frazione NEFA raccolta e secco sotto azoto a 40 ° C. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana. </li><li> Inserire una nuova cartuccia SPE amminopropil silice sul serbatoio SPE e posizionare un tubo di vetro con tappo a vite nel cassetto serbatoio sotto la cartuccia per la raccolta dei rifiuti. </li><li> Lavare la colonna con 3 lavaggi di esano secco sotto vuoto e poi un lavaggio 1,0 ml finale gravità. Non lasciare la cartuccia a diventare secca (girare i canali colonna a cartuccia in posizione di chiusura quando il livello esano è vicino alla matrice cartuccia) Attenzione. Esano è pericolosa. </li><li> Sostituire il tubo di scarico con il tubo nuovo vetro con tappo a vite marcato CE. </li><li> Sciogliere il TAG e CE frazione secca (preparato nella fase 3.6) in 1,0 ml di esano secco e vortex. Applicare questo alla colonna con una pipetta Pasteur di vetro e lasciare gocciolare attraverso sotto gravity. </li><li> Quando ulteriori gocce cadono, rimuovere il liquido residuo sotto vuoto. </li><li> Sotto vuoto, lavare la colonna con 2 x 1,0 ml di esano lavaggi a secco per eluire CE e frazione raccolta secco sotto azoto a 40 ° C. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana. </li><li> Posizionare nuovo tubo di vetro con tappo a vite TAG marcato nel cassetto serbatoio ed eluire TAG con l&#39;aggiunta di 2 x 1,0 ml di esano lavaggi a secco: metanolo: acetato di etile (100:5:5) sotto vuoto. </li><li> Lavaggio frazione raccolta sotto azoto a 40 ° C. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana. Attenzione: acetato di etile è pericoloso. </li></ol> 4. Preparazione di FAME da CE 10 <ol><li> Aggiungere 0,5 ml di toluene secca alla frazione CE separati (raccolti nella fase 3.19) e vortex. Attenzione: Il toluene è pericoloso. </li><li> Preparare reagente di metilazione (metanolo secco con 2% (v/ V) H 2 SO 4), di cui 1,0 ml è richiesto per campione. Dispensare volume di metanolo asciutto in contenitore di vetro o di plastica adatti con coperchio e aggiungere la quantità di H 2 SO 4 gocce necessaria quindi mescolare per inversione. Attenzione: L&#39;acido solforico è pericoloso. </li><li> Aggiungere 1,0 ml di reattivo metilante ai campioni disciolti in toluene asciutto, tappare i tubi in modo sicuro, e mescolare delicatamente. </li><li> Riscaldare i campioni per 2 ore a 50 ° C. </li><li> Dopo 2 ore togliere i tubi dal fuoco. Una volta freddo aggiungere 1,0 ml di soluzione neutralizzante (0,25 M KHCO 3 0.5MK 2 CO 3). Attenzione: bicarbonato di potassio e carbonato di potassio sono pericolosi. </li><li> Aggiungere 1,0 ml di esano asciutto e vortex. </li><li> Centrifugare a 250 xg per 2 minuti, bassa freno a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere fase superiore, che contiene il FAME, e trasferire in un nuovo tappo a vite tubo non monouso in vetro. </li><li> Asciugare il FAME raccolti sottoazoto a 40 ° C. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana. </li></ol> 5. La rimozione del colesterolo libero contaminazione da CE FAME 14 (Colesterolo libero può contaminare il campione, si veda la Figura 1 per tracce esempio cromatografo con e senza rimozione del colesterolo libero). <ol><li> Posizionare un tubo di scarico nel serbatoio SPE e inserire una cartuccia SPE gel di silice sul serbatoio. </li><li> Lavare colonna con 3 x 1 ml di esano lavaggi a secco sotto vuoto e 1 x 1 ml sotto gravità. </li><li> Rimuovere lavaggi rifiuti e aggiungere nuovo tubo di scarico nel serbatoio. </li><li> Sciogliere FAME CE in 1 ml di esano asciutto, vortice. </li><li> Applicare alla colonna con una pipetta Pasteur di vetro e far gocciolare attraverso gravità. </li><li> Lavare colonna con 3 x 1 ml di esano lavaggi sotto vuoto. </li><li> Rimuovere lavaggi rifiuti e collocare nuovi tubi non tappo a vite nel serbatoio del marchio CE FAME. </li><li> Eluire l&#39;FAME CE con 2 x 1 ml di esano a secco: etere etilico (95:5 v / v) lavaggi. </li><li> Essiccare sotto azoto a 40 ° C. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana. Attenzione: Etere etilico è pericoloso. </li></ol> 6. Trasferimento di FAME in GC Auto Sampler Vial <ol><li> Aggiungere 75 ml di esano a secco a campione, vortice, e trasferire ad un campione di GC auto fiala. </li><li> Aggiungere un ulteriore 75 esano microlitri secca a campione, vortice e trasferire alla stessa GC campione auto fiala. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di un mese. </li></ol> 7. Analisi di Utilizzo del gascromatografo 14 <ol><li> Analizzare FAME su un gascromatografo. Esempio istituito: 30 mx 0,25 micron x 0,25 millimetri BPX-70 silice fusa colonna capillare con protocollo temperatura: Temperatura iniziale 115 ° C, premuto 2 min, rampa 10 ° C / min a 200 ° C, tenere 18.5 min, rampa 60 ° C / min a 245 ° C, hvecchio 4 min. Colonna: gas elio, portata 1.0, 14.6 pressione e velocità 29. Injector Temperatura = 300 ° C. Rivelatore: flusso di idrogeno 40.0, aria flusso 184.0, make up elio gas, portata 45,0, temperatura = 300 ° C. </li><li> Imposta rapporto di divisione a seconda dei casi (ad esempio 25:1 per l&#39;analisi FAME CE). </li><li> Determinare l&#39;area sotto ciascun picco utilizzando il software appropriato e identificare FAME rispetto agli standard. Vedere la Figura 2 per esempio i cromatogrammi. </li><li> Utilizzare l&#39;area sotto i dati di picco per calcolare il contributo dei singoli acidi grassi come percentuale di acidi grassi totali. </li><li> Calcolare le concentrazioni assolute di acidi grassi dividendo l&#39;area dello standard interno per l&#39;importo aggiunto. Dividere l&#39;area di ciascun acido grasso da questo risultato avere concentrazioni assolute di ciascun acido grasso entro la quantità di tessuto utilizzato. </li></ol>

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantitative chromatographic analysis. , (2000).</li><li>Bartle, K. D., Myers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+gas+chromatography.">History of gas chromatography.</a> Trends Anal. Chem. 21 (9), 9-10 (2002).</li><li>Childs, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The effect of gender, pregnancy and diet upon rat tissue fatty acid composition and immune function. , 378 (2008).</li><li>Harris, S. W., Pottala, J. V., Ramachandran, S. V., Larson, M. G., Robins, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+erythrocyte+membrane+Trans+and+marine+fatty+acids+between+1999+and+2006+in+older+Americans.">Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans.</a> J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).</li><li>Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+matter+of+fat:+An+introduction+to+lipidomic+profiling+method.">A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method.</a> J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).</li></ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Gascromatografia è una tecnica accurata da utilizzare per l&#39;analisi degli acidi grassi, e la sua elevata riproducibilità ritenga tecnica adatta per analisi cliniche. Colonne GC appropriate devono essere utilizzati per consentire l&#39;identificazione di acidi grassi di interesse, con colonne disponibili avere variazioni nella polarità della fase stazionaria, lunghezza della colonna e il diametro interno. L&#39;uso di una colonna capillare di silice fusa in questo metodo di analisi fornisce una buona stabilità te...

Gas cromatografia (GC) è una tecnica ben consolidata utilizzato per identificare e quantificare l&#39;incorporazione degli acidi grassi in pool di lipidi e le membrane cellulari 1,2 durante la supplementazione o fisiologiche condizioni come l&#39;obesità (e le malattie correlate come il diabete) o la gravidanza 3 - 5. E &#39;adatto per analizzare i tipi e le quantità di grassi negli alimenti anche. Questo è utile quando caratterizzare diete sperimentali, nonché di assicurare che l&#39;industria alimentare è conforme alle normative. Ad esempio, GC può essere utilizzata per confermare l&#39;identità e la quantità di acidi grassi di un prodotto come integratore alimentare per garantire che l&#39;etichettatura è corretta e disposizioni sono rispettate 6,7. Analisi di acidi grassi in grado di fornire preziose intuizioni metabolismo dei lipidi nella salute e nella malattia, l&#39;impatto del cambiamento di dieta, e l&#39;effetto delle variazioni di stato fisiologico 8. Uso di GC per studiare campioni durante la gravidanza ha fornito importanteinformazioni sui cambiamenti in acidi grassi e complesso lipidico omeostasi 3. Prima della separazione cromatografica, lipidi sono generalmente estratti dal campione usando la solubilità dei lipidi in miscele di solventi di cloroformio e metanolo. Viene aggiunto cloruro di sodio per facilitare la separazione della miscela in lipidi acquosa e organica contenente 9,10 fasi. Classi di lipidi complessi di interesse possono essere separati dall&#39;estratto totale di lipidi mediante estrazione in fase solida (SPE). Questa tecnica di separazione eluisce classi di lipidi in base alla loro polarità o di affinità di legame. Triacyglycerols (TAG) ed esteri del colesterolo (CE) vengono eluiti prima come frazione combinata, altre classi, fosfatidilcolina (PC), Fosfatidiletanolamina (PE), e acidi grassi non esterificati (NEFA) sono eluiti aumentando la polarità del solvente di eluizione . La separazione di TAG da CE sfrutta il legame di TAG solo ad una SPE cartri frescodge, permettendo CE da eluito. TAG può essere eluito aumentando la polarità del solvente eluizione 9,10. Questo metodo consente a più campioni da separare simultaneamente con una resa superiore è realizzato con cromatografia su strato sottile, il che significa che i campioni di dimensioni relativamente piccole (per esempio &lt;100 microlitri di plasma o siero, &lt;100 mg di tessuto) possono essere analizzati 11,12. GC è una tecnica ben consolidata prima descritto nel 1950, è stato suggerito che la fase mobile nei sistemi liquido-liquido poi potrebbe essere sostituito con il vapore. Inizialmente è stato utilizzato per l&#39;analisi del petrolio, ma rapidamente esteso anche ad altri settori quali l&#39;analisi degli aminoacidi e biochimica dei lipidi, che è ancora di grande interesse. Progressi nelle apparecchiature GC e tecnologie come lo sviluppo di colonne capillari dalle colonne impaccate utilizzati in precedenza ha portato alle nostre attuali tecniche in cui gli acidi grassi sono in grado di essereseparati più efficiente a temperature più basse con conseguente GC essendo ordinariamente usato per identificare e quantificare gli acidi grassi in una vasta gamma di indagini 13. GC richiede acidi grassi per essere derivatizzati in modo che essi possono diventare sufficientemente volatile per essere eluito a temperature ragionevoli senza decomposizione termica. Questo di solito comporta la sostituzione di un gruppo funzionale contenente idrogeno per formare esteri, tioesteri o ammidi per analisi. Esteri metilici vengono comunemente studiate derivati, che sono prodotti da metilazione. In questo metodo i legami estere in lipidi complessi vengono idrolizzati a rilasciare gli acidi grassi liberi, che sono transmethylated a formare esteri metilici degli acidi grassi (FAME). Il profilo risultante di FAME, determinato mediante GC, viene indicato come la composizione in acidi grassi e può essere facilmente confrontata tra diversi gruppi sperimentali 9,10. La tecnica consente entrambe le proporzioni di indiviacidi grassi goli e della loro concentrazione da misurare. Oltre all&#39;uso di GC per l&#39;analisi di acidi grassi in studi nutrizionali e all&#39;interno del settore alimentare, la tecnica può essere utilizzata in un&#39;ampia gamma di settori analitici. Ad esempio, analisi ambientali mediante GC includono la misurazione della contaminazione delle acque da insetticidi e analisi del suolo misurare il contenuto di clorobenzene. In tossicologia, GC è stato utilizzato anche per identificare le sostanze illegali in campioni di sangue di individui urine e, una tale stimolatori sport 12 e la capacità di separare miscele complesse di idrocarburi rende questa tecnica popolare nell&#39;industria petrolifera per l&#39;analisi petrolchimica 12. La gravidanza è associata a cambiamenti significativi nella composizione in acidi grassi dei tessuti materni in particolare, nel contenuto di omega-3 (n-3) e omega-6 (n-6) polinsaturi aci grassids (PUFA) 3. In questo studio, abbiamo esemplificare l&#39;uso di GC nella misura di acidi grassi descrivendo il suo uso nell&#39;analisi della composizione in acidi grassi del tessuto epatico prelevato da ratti vergini e gravidanza alimentati diete a basso ed alto contenuto di grassi con differenti fonti di petrolio. Le diete sperimentali forniti qui sono stati un olio a base di dieta a basso contenuto di grassi di soia, una dieta ricca di grassi a base di olio di soia (130,9 g di grassi totali / kg di grasso totale) o una dieta a base di olio di lino alto contenuto di grassi (130.9 g di grassi totali / kg dieta), disponibile per 20 giorni. La composizione in acidi pieno di nutrienti e grassi di queste diete sono state descritte in precedenza 14. Le diete olio di soia sono ricchi di acido linoleico (18:02 n-6) e contengono alcuni acido α-linolenico (18:03 n-3) mentre la dieta olio di lino è ricco di acido α-linolenico. Queste diete ad alto contenuto di grassi rappresentano diverse razioni di linoleico di α-linolenico acidi (razioni di 08:01 e 01:01, rispettivamente). Il metodo per l&#39;isolamento delle singole classi di lipidi e analisi mediante GC siamo noill stabilito e convalidato, ed è stato pubblicato in precedenza 10, ma senza la descrizione tecnica dettagliata trovata qui.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Methanol:</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M/4056/17</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Fumes - HPLC Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform:</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C/4966/17</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Fumes - HPLC Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHT:</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>W218405</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Dust fumes - Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H/0406/17</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Fumes - HPLC Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>695084</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Burns - 99.85%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Burns - 99.999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium carbonate</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>209619</td>
			<td>99% ACS Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>237205</td>
			<td>99.7% ACS Reasgent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10204340</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Fumes - 99+% GLC SpeciFied</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T/2300/15</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Fumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>309966</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Fumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen (oxygen free) cylinder</td>
			<td>BOC</td>
			<td>44-w</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Compressed gas - explosion risk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminopropyl silica SPE cartridges</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>12102014</td>
			<td>Cartridge - Bead mass 100mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel SPE cartidges</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>14102010</td>
			<td>Cartridge - Bead mass 100mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular seives</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>334324</td>
			<td>Pellets, AW-300, 1.6mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass test tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB59527</td>
			<td>Non-screw cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw thread glass test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB59555</td>
			<td>13mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps for screw thread test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB51353</td>
			<td>To fit 13mm tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solida phase extraction (SPE) tank</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>VacElut 20 Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stopcocks for SPE tank</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>12131005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>2656-194GB-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC vials</td>
			<td>Kinesis</td>
			<td>STV 12-03TS</td>
			<td>Short thread 9mm, TPX 0.2ml fused glass insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC vial lids</td>
			<td>Kinesis</td>
			<td>SCC09-0.2B</td>
			<td>Short thread 9mm blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC inlet liners</td>
			<td>SGE Analytical science</td>
			<td>092002</td>
			<td>Split/splitless Focus liner ID 4mm, OD 6.3mm length 78.5mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC septa</td>
			<td>SGE Analytical science</td>
			<td>041856</td>
			<td>11mm, MN material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC column</td>
			<td>SGE Analytical science</td>
			<td>054612</td>
			<td>Length 30m, ID 0.22mm, Film thickness 0.25&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatograph</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HP 6890 series</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of gas chromatography to analyze compositional changes of fatty acids in rat liver tissue during pregnancy

Gas cromatografia (GC) è un metodo altamente sensibile utilizzato per identificare e quantificare il contenuto di acidi grassi dei lipidi dai tessuti, cellule e plasma / siero, ottenendo risultati con elevata precisione e alta riproducibilità. Negli studi metabolici e della nutrizione GC permette la valutazione delle variazioni nelle concentrazioni di acidi grassi seguenti interventi o durante cambiamenti di stato fisiologico come la gravidanza. Estrazione in fase solida (SPE) utilizzando amminopropil cartucce di silice permette la separazione delle principali classi di lipidi, tra cui trigliceridi, diversi fosfolipidi e esteri del colesterolo (CE). GC combinato con SPE è stato utilizzato per analizzare i cambiamenti nella composizione in acidi grassi della frazione CE nel fegato dei ratti vergini e gravide che erano stati alimentati con varie diete ad alto e basso contenuto di grassi. Ci sono significativi effetti di interazione di dieta / gravidanza al momento il contenuto di acido omega-3 e omega-6 acidi grassi del fegato CE, che indica che le donne incinte hanno una risposta diversa a manipulat alimentareione che si vede tra le femmine vergini.

Il successo di questo metodo dipende seguendo il protocollo preciso e sull&#39;utilizzo di solventi puliti e reagenti per ridurre &#39;rumore&#39; e contaminazione che può apparire su un cromatogramma. Campioni contaminati sono più difficili da analizzare, abbassando la precisione dell&#39;area sotto i calcoli della curva. Se il protocollo è seguito con successo un cromatogramma con chiare simmetriche, picchi ben definiti e con il minimo rumore di fondo dovrebbe essere ottenuto come illustrato nella Figura 3....

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The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

La gravidanza porta a cambiamenti significativi alla composizione in acidi grassi dei tessuti materni. Profili lipidici possono essere ottenuti tramite gascromatografia per consentire l&#39;identificazione e la quantificazione degli acidi grassi nelle singole classi di lipidi tra i ratti alimentati con varie diete ad alto e basso contenuto di grassi durante la gravidanza.

L&#39;uso di gas cromatografia per analizzare compositivo Variazioni degli acidi grassi nel fegato di ratto tessuto durante la gravidanza

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

29.9K Views.  University of Southampton.  La gravidanza porta a cambiamenti significativi alla composizione in acidi grassi dei tessuti materni. Profili lipidici possono essere ottenuti tramite gascromatografia per consentire l'identificazione e la quantificazione degli acidi grassi nelle singole classi di lipidi tra i ratti alimentati con varie diete ad alto e basso contenuto di grassi durante la gravidanza. 

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Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue located at or near the N-terminus of a helix is often more acidic than that at or near the C-terminus 1-6. Although extensive experimental studies on the acid-base properties of peptides have been carried out in the condensed phase, in particular in aqueous solutions 6-8, the results are often complicated by solvent effects 7. In fact, most of the active sites in proteins are located near the interior region where solvent effects have been minimized 9,10. In order to understand intrinsic acid-base properties of peptides and proteins, it is important to perform the studies in a solvent-free environment.
We present a method to measure the acidities of oligopeptides in the gas-phase. We use a cysteine-containing oligopeptide, Ala3CysNH2 (A3CH), as the model compound. The measurements are based on the well-established extended Cooks kinetic method (Figure 1) 11-16. The experiments are carried out using a triple-quadrupole mass spectrometer interfaced with an electrospray ionization (ESI) ion source (Figure 2). For each peptide sample, several reference acids are selected. The reference acids are structurally similar organic compounds with known gas-phase acidities. A solution of the mixture of the peptide and a reference acid is introduced into the mass spectrometer, and a gas-phase proton-bound anionic cluster of peptide-reference acid is formed. The proton-bound cluster is mass isolated and subsequently fragmented via collision-induced dissociation (CID) experiments. The resulting fragment ion abundances are analyzed using a relationship between the acidities and the cluster ion dissociation kinetics. The gas-phase acidity of the peptide is then obtained by linear regression of the thermo-kinetic plots 17,18.
The method can be applied to a variety of molecular systems, including organic compounds, amino acids and their derivatives, oligonucleotides, and oligopeptides. By comparing the gas-phase acidities measured experimentally with those values calculated for different conformers, conformational effects on the acidities can be evaluated.

The determination of the gas-phase acidities of cysteine-containing oligopeptides is described. The experiments are performed using a triple quadrupole mass spectrometer. The relative acidities of the peptides are measured using collision-induced dissociation experiments, and the quantitative acidities are determined using the extended Cooks kinetic method.

Determinazione delle acidità in fase gassosa di oligopeptidi

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

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Chimica

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

Isolamento e preparazione delle pareti cellulari batteriche per l'analisi compositia mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Quantitative Detection of Trace Explosive Vapors by Programmed Temperature Desorption Gas Chromatography-Electron Capture Detector

The direct liquid deposition of solution standards onto sorbent-filled thermal desorption tubes is used for the quantitative analysis of trace explosive vapor samples. The direct liquid deposition method yields a higher fidelity between the analysis of vapor samples and the analysis of solution standards than using separate injection methods for vapors and solutions, i.e., samples collected on vapor collection tubes and standards prepared in solution vials. Additionally, the method can account for instrumentation losses, which makes it ideal for minimizing variability and quantitative trace chemical detection. Gas chromatography with an electron capture detector is an instrumentation configuration sensitive to nitro-energetics, such as TNT and RDX, due to their relatively high electron affinity. However, vapor quantitation of these compounds is difficult without viable vapor standards. Thus, we eliminate the requirement for vapor standards by combining the sensitivity of the instrumentation with a direct liquid deposition protocol to analyze trace explosive vapor samples.

Trace explosive vapors of TNT and RDX collected on sorbent-filled thermal desorption tubes were analyzed using a programmed temperature desorption system coupled to GC with an electron capture detector. The instrumental analysis is combined with direct liquid deposition method to reduce sample variability and account for instrumentation drift and losses.

Quantitativa Rilevamento di Trace vapori esplosivi di temperatura programmata Desorption Gas Detector cattura cromatografia-Electron

The direct liquid deposition of solution standards onto sorbent-filled thermal desorption tubes is used for the quantitative analysis of trace explosive ...

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. Kinesins display differences across the superfamily both in ATP turnover and in microtubule interaction. These differences tailor specific kinesins to various functions such as cargo transport, microtubule sliding, microtubule depolymerization and microtubule stabilization. To understand the mechanism of action of a kinesin it is important to understand how the chemical cycle of ATP turnover is coupled to the mechanical cycle of microtubule interaction. To dissect the ATP turnover cycle, one approach is to utilize fluorescently labeled nucleotides to visualize individual steps in the cycle. Determining the kinetics of each nucleotide transition in the ATP turnover cycle allows the rate-limiting step or steps for the complete cycle to be identified. For a kinesin, it is important to know the rate-limiting step, in the absence of microtubules, as this step is generally accelerated several thousand fold when the kinesin interacts with microtubules. The cycle in the absence of microtubules is then compared to that in the presence of microtubules to fully understand a kinesin&#8217;s ATP turnover cycle. The kinetics of individual nucleotide transitions are generally too fast to observe by manually mixing reactants, particularly in the presence of microtubules. A rapid mixing device, such as a stopped-flow fluorimeter, which allows kinetics to be observed on timescales of as little as a few milliseconds, can be used to monitor such transitions. Here, we describe protocols in which rapid mixing of reagents by stopped-flow is used in conjunction with fluorescently labeled nucleotides to dissect the ATP turnover cycle of a kinesin.

Kinesins are characterized by nucleotide-dependent interaction with microtubules: a cycle of ATP turnover coupled to a cycle of microtubule interaction. Here, we describe protocols to analyze the kinetics of individual nucleotide transitions in the ATP turnover cycle of a kinesin using fluorescently labeled nucleotides and stopped-flow fluorescence.

L&#39;uso di stopped-flow fluorescenza ed etichettati nucleotidi di analizzare il ciclo Fatturato ATP di kinesine

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarcatura e quantificazione dei livelli cellulari di fosfoinositidi da alte prestazioni cromatografia liquida accoppiata flusso scintillazione

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Facile Preparation of 4-Substituted Quinazoline Derivatives

Reported in this paper is a very simple method for direct preparation of 4-substituted quinazoline derivatives from a reaction between substituted 2-aminobenzophenones and thiourea in the presence of dimethyl sulfoxide (DMSO). This is a unique complementary reaction system in which thiourea undergoes thermal decomposition to form carbodiimide and hydrogen sulfide, where the former reacts with 2-aminobenzophenone to form 4-phenylquinazolin-2(1H)-imine intermediate, whilst hydrogen sulfide reacts with DMSO to give methanethiol or other sulfur-containing molecule which then functions as a complementary reducing agent to reduce 4-phenylquinazolin-2(1H)-imine intermediate into 4-phenyl-1,2-dihydroquinazolin-2-amine. Subsequently, the elimination of ammonia from 4-phenyl-1,2-dihydroquinazolin-2-amine affords substituted quinazoline derivative. This reaction usually gives quinazoline derivative as a single product arising from 2-aminobenzophenone as monitored by GC/MS analysis, along with small amount of sulfur-containing molecules such as dimethyl disulfide, dimethyl trisulfide, etc. The reaction usually completes in 4-6 hr at 160 &#186;C in small scale but may last over 24 hr when carried out in large scale. The reaction product can be easily purified by means of washing off DMSO with water followed by column chromatography or thin layer chromatography.

A protocol for facile preparation of 4-substituted quinazoline derivatives from 2-aminobenzophenones, thiourea and dimethyl sulfoxide is presented.

Preparazione facile dei derivati ​​quinazoline 4-sostituito

Reported in this paper is a very simple method for direct preparation of 4-substituted quinazoline derivatives from a reaction between substituted ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Usando elettroforesi capillare per quantificare Acidi organici da tessuti vegetali: un banco di prova d&#39;esame<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Semi

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Raman and IR Spectroelectrochemical Methods as Tools to Analyze Conjugated Organic Compounds

In the presented work, two spectroelectrochemical techniques are discussed as tools for the analysis of the structural changes occurring in the molecule on the vibrational level of energy. Raman and IR spectroelectrochemistry can be used for advanced characterization of the structural changes in the organic electroactive compounds. Here, the step-by-step analysis by means of Raman and IR spectroelectrochemistry is shown. Raman and IR spectroelectrochemical techniques provide complementary information about structural changes occurring during an electrochemical process, i.e. allows for the investigation of redox processes and their products. The examples of IR and Raman spectroelectrochemical analysis are presented, in which the products of the redox reactions, both in solution and solid state, are identified.

A protocol of step-by-step Raman and IR spectroelectrochemical analysis is presented.

Raman e IR Spettroelettrochimica metodi come strumenti per analizzare composti organici coniugati

In the presented work, two spectroelectrochemical techniques are discussed as tools for the analysis of the structural changes occurring in the molecule ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. In this method for two-step pyrolysis online coupled to gas chromatography mass spectrometry (py-GC-MS) volatile compounds are analyzed during a first desorption run. In the second run, the same dried sample is pyrolyzed for analysis of non-volatile compounds such as pigments and polymers. These can be identified by their specific decomposition patterns. Additionally, this method can be used to differentiate original from counterfeit inks. Easy screening methods for data evaluation using the average mass spectra and self-made pyrolysis libraries are applied to speed up substance identification. Using specialized evaluation software for pyrolysis GS-MS data, a fast and reliable comparison of the full chromatogram can be achieved. Since GC-MS is used as separation technique, the method is limited to volatile substances upon desorption and after pyrolysis of the sample. The method can be applied for quick substance screening in market control surveys since it requires no sample preparation steps.

This method for two-step pyrolysis online coupled to gas chromatography with mass spectrometric detection and data evaluation protocol can be used for multi-component analysis of tattoo inks and discrimination of counterfeit products.

Un metodo di cromatografia a gas pirolisi a due fasi con rilevamento spettrometrico di massa per l'identificazione di ingredienti di inchiostro del tatuaggio e prodotti contraffatti

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

Nitrogen Compound Characterization in Fuels by Multidimensional Gas Chromatography

Certain nitrogen-containing compounds can contribute to fuel instability during storage. Hence, detection and characterization of these compounds is crucial. There are significant challenges to overcome when measuring trace compounds in a complex matrix such as fuels. Background interferences and matrix effects can create limitations to routine analytical instrumentation, such as GC-MS. In order to facilitate specific and quantitative measurements of trace nitrogen compounds in fuels, a nitrogen-specific detector is ideal. In this method, a nitrogen chemiluminescence detector (NCD) is used to detect nitrogen compounds in fuels. NCD utilizes a nitrogen-specific reaction that does not involve the hydrocarbon background. Two-dimensional (GCxGC) gas chromatography is a powerful characterization technique as it provides superior separation capabilities to one-dimensional gas chromatography methods. When GCxGC is paired with a NCD, the problematic nitrogen compounds found in fuels can be extensively characterized without background interference. The method presented in this manuscript details the process for measuring different nitrogen-containing compound classes in fuels with little sample preparation. Overall, this GCxGC-NCD method has been shown to be a valuable tool to enhance the understanding of the chemical composition of nitrogen-containing compounds in fuels and their impact on fuel stability. The % RSD for this method is &#60;5% for intraday and &#60;10% for interday analyses; the LOD is 1.7 ppm and the LOQ is 5.5 ppm.

Here, we present a method utilizing two-dimensional gas chromatography and nitrogen chemiluminescence detection (GCxGC-NCD) to extensively characterize the different classes of nitrogen-containing compounds in diesel and jet fuels.

Caratterizzazione composta azoto nei combustibili mediante cromatografia multidimensionale dei gas

Certain nitrogen-containing compounds can contribute to fuel instability during storage. Hence, detection and characterization of these compounds is ...