Questo lavoro è stato sostenuto da un Grant-in-Aid per la ricerca scientifica sulle aree innovative &quot;Mesoscopic neurocircuitry&quot; (n. 22.115.002) e &quot;Comprehensive Cervello Network Science&quot; (n. 221S0003) del Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Sport, Scienza, e la tecnologia, il Giappone ad AN e Grant-in-Aid per giovani scienziati (B) (n. 21.700.344) della Società Giapponese per la Promozione della Scienza (JSP) a HK

1. Larve di preparazione <ol><li> Mantenere volare linee di ok6-Gal4, UAS-ChR2 o ok6-Gal4, UAS-NpHR2 in flaconi di plastica contenenti cibo volare standard. </li><li> Diffusione lievito pasta contenente tutto-trans retinico (ATR) a concentrazioni appropriate (1 mm per ChR2, 10 mm per NpHR2 (&quot;NpHR&quot; in breve) su una piastra di agar succo di mela. </li><li> Pick up 2 ° o 3 ° instar larve dai flaconi e metterli sul piatto ATR-contenente. </li><li> Li allevare a 25 ° C al buio per un appropriato periodo di tempo (1 giorno per ChR2, 2 giorni per NpHR.) </li></ol> 2. Setup Microscopio <ol><li> Collegare una telecamera CCD (XCD-V60, Sony) ad un microscopio confocale convenzionale (nel nostro caso, FV1000, Olympus) con attacco C-Mount (ingrandimento 0.35x). </li><li> Se vi è un otturatore lungo il percorso della luce dalla lente obiettivo alla telecamera CCD, che si chiude durante la scansione laser, rimuoverlo con cautela. Come questo passaggio dipende dalla microsgestire la configurazione, contattare il produttore del microscopio per il supporto tecnico, se necessario. </li></ol> 3. Dissection <ol><li> Risciacquare le larve ATR-fed con acqua per rimuovere residui di cibo dal corpo. </li><li> Mettere la larva su un piatto rivestito sylgard, lato dorsale alto (il lato dorsale ha due tubi tracheali esecuzione longitudinalmente, uno ciascun lato della linea mediana dorsale). Lo spessore del sylgard è circa 5mm. </li><li> Inserire un perno di insetto (Austerlitz perni insetti, Φ0.10mm, acciaio) nella coda tra i tubi tracheali con una pinza (# 5 Inox, FST da Dumont, Svizzera). I perni, circa 10mm lunghi, devono essere piegate o tagliate per essere abbastanza breve (~ 2 millimetri lunga) per evitare di colpire e danneggiare la superficie della lente obiettivo. Poi mettere il secondo perno insetto nella testa della larva vicino alla bocca del gancio, nero Struttura artiglio all&#39;estremità anteriore. </li><li> Aggiungi Ca 2 + senza soluzione fisiologica (NaCl 140 mM, KCl 2 mM, MgCl2 6 mm, HEPES-NaOH 5 mM,Saccarosio 36 mm (pH7.1)) per mantenere la larva umido. </li><li> Fai una piccola incisione vicino alla coda con micro forbici (MB-50-7, Napox, Giappone). </li><li> Dall&#39;incisione, fare un taglio longitudinale lungo la linea mediana dorsale verso la testa. Fare attenzione a non danneggiare il cordone nervoso ventrale (VNC) e assoni. </li><li> Fai una piccola incisione alla testa lateralmente. </li><li> Mettere 4 perni ad ogni angolo della bodywall sezionato. La parete del corpo dovrebbe essere allungata sufficiente per visualizzare un modello segmentale della parete del corpo, ma non troppo per ostacolare movimento peristaltico. </li><li> Rimuovere gli organi interni tranne il cervello e la VNC e sciacquare il campione con Ca 2 + senza soluzione fisiologica. </li><li> Regolare l&#39;orientamento del cordone nervoso ventrale essere bilateralmente simmetrica modificando la posizione e l&#39;orientamento dei perni insetti sulle parete del corpo. Per fissare la posizione del cordone nervoso ventrale, inserire un ago attraverso il tessuto tra il cervello e la bocca agganciare giù al sylgard. </li> &lt;li&gt; Sostituire il tampone con 2 mM Ca 2 + Ringer (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 2 mM, HEPES-NaOH 5 mM, saccarosio 36 mm (pH7.3)). </li></ol> 4. Imaging con laser illuminazione <ol><li> Fissare un obiettivo obiettivo secco 4x (UPlanSApo 4x, NA 0,16, Olympus, Giappone) nel microscopio confocale e impostare la preparazione larva sul palco. </li><li> Ottenere un&#39;immagine trasmissione della preparazione sezionato con un laser rosso (633nm) per individuare il cordone nervoso ventrale da microscopio confocale. Per questo la scansione, accertarsi di non utilizzare un laser di 488nm o 559nm, che induce una stimolazione indesiderata di ChR2 o NpHR, rispettivamente. </li><li> Definire la regione di interesse (ROI) l&#39;immagine in trasmissione. Modalità zoom potrebbe essere utile per la determinazione dettagliata del ROI. </li><li> Modificare il set di filtri del microscopio di illuminare con la luce 488nm o 559nm. </li><li> Illuminare la preparazione con una lampada alogena per visualizzare la parete del corpo. Thpreparazione e può essere controllato con una telecamera CCD collegata al microscopio confocale. </li><li> Registrare il movimento della parete del corpo e passare il raggio laser e disattivata durante il monitoraggio del movimento. </li></ol>

<ol>
	<li>Cattaert, D., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+the+central+generator+of+locomotor+rhythm+by+noncompetitive+NMDA+receptor+antagonists+in+Drosophila+larvae.">Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 48, 58-73 (2001).</li><li>Fox, L. E., Soll, D. R., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+and+modulation+of+locomotion+pattern+generators+in+Drosophila+larvae:+effects+of+altered+biogenic+amine+levels+by+the+tyramine+beta+hydroxlyase+mutation.">Coordination and modulation of locomotion pattern generators in Drosophila larvae: effects of altered biogenic amine levels by the tyramine beta hydroxlyase mutation.</a> J. 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Neurobiol. , (2011).</li><li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation.">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nat. Methods. , (2012).</li><li>Suster, M. L., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+assembly+of+a+central+pattern+generator+without+sensory+input.">Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input.</a> Nature. 416, 174-178 (2002).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. 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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Perturbazione temporale e locale di attività neurale è una tecnica preziosa per analizzare le dinamiche di rete dei circuiti neurali. In questo protocollo, vi presentiamo un metodo per manipolare l&#39;attività neurale da optogenetics utilizzando un laser. Elevata direzionalità del laser permette una stimolazione optogenetic più localizzata di stimolazione campo largo con mercurio o una lampada allo xeno. Anche se illuminazioni laser sono già state applicate ai optogenetics in studi precedenti, configurazioni particolari come la fibra di vetro, micromanipolatore e sorgente laser, sono necessari studi più precedenti. In questo protocollo, usiamo un microscopio confocale convenzionale per l&#39;illuminazione locale. Dal momento che il sistema di microscopia confocale è ampiamente usato, questo metodo si aprirà la possibilità di applicare optogenetics risoluzione più elevata in molti laboratori. Il protocollo ha due punti critici: dissezione larvale e la potenza del laser. In primo luogo, se il cervello, il cordone nervoso ventrale o un nervo motore sono danneggiati duridissezione ng, le larve esporrà meno o movimento peristaltico spontanea. La precisione è quindi indispensabile, soprattutto quando si effettua una incisione sul lato dorsale con le forbici a molla e la rimozione degli organi interni con una pinza. Dettagli sulla dissezione sono stati riportati in precedenza 21. In secondo luogo, se la stimolazione è sufficiente da raggiungere, una potenza laser di circa 0,1 ~ 1 mW / mm 2 per ChR2 o 1 è richiesto ~ 10 mW / mm 2 per NpHR. Abbiamo valutato la potenza del laser come potenza luminosa totale sotto una lente obiettivo diviso per una superficie stimata di illuminazione. Abbiamo misurato la potenza totale della luce utilizzando un misuratore di potenza (Mobiken, Sanwa MI Technos, Giappone). Abbiamo stimato la zona di illuminazione come tempi costanti circolari il quadrato della lunghezza d&#39;onda del laser, che dà approssimativamente area illuminata in limite di diffrazione. Effettiva potenza di illuminazione sul campione può essere regolata non solo dalla potenza di uscita del laser, ma anche modificando la velocità di scansione e insensibileer di ripetizioni. Abbiamo analizzato laser con 20-100 msec / pixel per 63 volte. Inoltre, il livello di espressione della proteina optogenetics e la quantità di ATR sono anche critico per l&#39;efficienza stimolazione. Di conseguenza, se le larve non ha mostrato alcuna risposta optogenetic, i seguenti punti dovrebbero essere controllati e corretti: 1) potenza del laser (attraverso l&#39;ottimizzazione del sistema microscopio), 2) livello di espressione della proteina optogenetics (controllando genotipo e temperatura di allevamento), e 3) quantità di ATR (regolando la concentrazione di ATR e periodo di alimentazione). NpHR richiede maggiore concentrazione di ATR di ChR2 fa da motivi sconosciuti 13. ChR2 funziona bene in larve allevate in alimenti contenenti meno ATR (ad esempio 0,1 mm) rispetto a qui descritto (1 mm). Come nutrire le larve di 1 mM ATR è sufficiente per rendere ChR2 foto-reattivo, si consiglia di questa concentrazione per la prima prova in ChR2 esperimenti. La concentrazione di ATR può successivamente essere titolato giù da 1 mM. Quanto alla durata dell&#39;esposizione per ATR, si consiglia dila durata qui descritta per il controllo optogenetic robusto. Spesso non avrebbe osservato la risposta optogenetic durante l&#39;alimentazione delle larve di ATR per la durata più breve. In questo protocollo, illuminazione laser e l&#39;acquisizione delle immagini sono gestite da un computer separato. Quindi, chiara individuazione del modello di spazio-temporale di illuminazione laser per telecamera CCD è fondamentale per l&#39;analisi dei dati. Se il punto laser o la linea è scarsa immagine del CCD, si dovrebbe ottimizzare la potenza della lampada alogena e valore di guadagno della camera CCD per visualizzare l&#39;illuminazione laser, mantenendo muro corpo visibile. Illuminazione spazio-temporale mostrato in questo protocollo fornisce informazioni sui circuiti motore larvali, tuttavia, il metodo ha alcune limitazioni. Per quanto riguarda l&#39;aspetto &quot;spaziale&quot;, la posizione della illuminazione viene registrato immagine CCD a basso ingrandimento utilizzato per filmare i movimenti della parete del corpo di. Pertanto, area di illuminazione può essere assegnato a livello di segmento, ma non a livello cellulare. Quanto alla &quot;temporal &quot;aspetto, il tempo che intercorre tra l&#39;accensione del laser a scansione al microscopio confocale e l&#39;illuminazione con laser dipende dal sistema di microscopia confocale e la condizione di scansione. Pertanto, è necessario un po &#39;di prove per tentativi ed errori per regolare i tempi di illuminazione. Dal momento che i tempi di illuminazione può essere determinato in CCD film immagine utilizzando il software adeguato come ImageJ, il fattore critico nella risoluzione temporale è il frame rate della telecamera CCD imaging. Siamo in genere impostare il frame rate per 7,5-15 fotogrammi al secondo. Advances in strumenti optogenetic ci offrono la possibilità di modificare il presente protocollo. Abbiamo usato 3 ° larve instar possesso ok6-Gal4 e UAS-ChR2 [H134R] o UAS-NpHR2. Altri strumenti optogenetic invece di ChR2 [H134R] o NpHR2 come ChR2 [T159C/E123T], NpHR3 o Arch può aumentare l&#39;efficienza del controllo di attività 22. Inoltre, utilizzando altri Gal4 linee o analizzare in altri stadi di sviluppo in grado di fornire ulteriori informazioni sul ciruito motorets. In questo protocollo, attività motoria è stata monitorata mediante immagini di trasmissione della contrazione bodywall con una telecamera CCD. L&#39;attività dei motoneuroni con molecole fluorescenti calcio-sensibili (ad es GCaMP) può anche essere monitorato direttamente durante la manipolazione attività neurale con ChR2 o NpHR. In questo caso, blu illuminazione luce in un&#39;area ampia e una camera CCD altamente sensibile (es. telecamera EMCCD) sono utilizzati al posto di una lampada alogena e la camera CCD normale precedentemente descritto. Per migliorare la risoluzione spaziale di stimolazione mentre il monitoraggio bodywall movimento, utilizzando una lente obiettivo supplementare può essere un metodo più avanzato: illuminazione del cordone nervoso ventrale da una lente obiettivo alto ingrandimento (es 40x) da sopra il campione e monitoraggio bodywall partire da lente di ingrandimento (ad esempio 4x) sotto il campione. Questo sistema a doppia lente può permetterci di stimolare il sistema nervoso in maggiore risoluzione spaziale. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Il protocollo qui riportate può essere applicato ad altri circuiti neurali, forniti strumenti optogenetic possono essere espressi nel sistema nervoso e preparato in cui luce sufficiente può essere spedito nel tessuto neurale può essere stabilita.

Locomozione avanti peristaltica in larve di Drosophila avviene per la propagazione della contrazione muscolare da posteriore a segmenti anteriori. Questo movimento è realizzato da attivazione sequenziale di motoneuroni all&#39;interno del cordone nervoso ventrale lungo l&#39;asse longitudinale del corpo. Per esaminare il circuito dietro a questa attività di moltiplicazione di fantasia, perturbazione locale di attività neurale potrebbe essere un approccio informativo. Sebbene saggio farmacologico può controllare sostanza specifica, come neurotrasmettitori, in tessuto neurale, l&#39;effetto dei farmaci farmacologici può essere simile tra quasi tutti i segmenti perché il cordone nervoso ventrale larvale struttura ripetitiva è composta neuromeres simili lungo l&#39;asse longitudinale. Alternativamente, si potrebbe esprimere optogenetic o molecole sonda termosensibili in un piccolo numero di segmenti. Tuttavia, tali specifiche GAL4 linee sono molto difficili da generare. Qui vi presentiamo un metodo per manipolare i neuroni in alcuni segmentimenti che utilizzano illuminazione laser. Approfittando della illuminazione spazialmente confinate in microscopia confocale, si può perturbare l&#39;attività dei neuroni in un&#39;area locale. Combinata con il modello di espressione della sonda di sottoinsiemi di neurone-specifici GAL4 linee, questo metodo di illuminazione laser migliora notevolmente risoluzione spaziale per perturbazione. E poiché questo metodo richiede solo un microscopio confocale convenzionale, l&#39;acquisto di attrezzature di laboratorio supplementare non è in genere necessario. Usando questa tecnica, abbiamo esaminato il ruolo dell&#39;attività neuronale motore durante la propagazione di uscita del motore 13. Bloccando le attività dei motoneuroni entro pochi segmenti durante il movimento peristaltico, siamo stati in grado di verificare se l&#39;attività dei motoneuroni stessi è necessaria per la propagazione del segnale di uscita del motore. Blocco locale e transitoria dei motoneuroni arrestato la propagazione del movimento peristaltico. Dopo che il blocco è stato rimosso, propagation apparso al segmento in cui l&#39;onda era stato arrestato. Questo fenomeno suggerisce che senza attivazione neuronale motoria, l&#39;onda di propagazione non può progredire lungo il cordone nervoso ventrale ulteriormente, e quindi l&#39;attivazione dei neuroni motore è necessaria per il movimento peristaltico. Abbiamo precedentemente riportato dati dettagliati e discussioni su questo fenomeno in Inada et al. (2011) 13. Qui, descriviamo il metodo per perturbare attività neurale interattivamente durante il monitoraggio del movimento delle larve sezionato. Utilizzando varie Gal4 linee e serie di modelli spazio-temporali per la manipolazione di attività, si può indagare la logica circuiti attraverso proprietà di risposta perturbazione del circuito del motore.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td >Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BX61WI Microscope</td>
 <td>Olympus Corporation</td>
 <td>BX61WI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluoview FV1000 confocal system</td>
 <td>Olympus Corporation</td>
 <td>FV1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CCD camera</td>
 <td>Sony</td>
 <td>XCD-V60</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>all-trans retinal</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>R2500-500MG</td>
 <td>200 mM stock in 95% EtOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silpot184</td>
 <td>Dow Corning Toray</td>
 <td>3255981</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

optogenetic perturbation of neural activity with laser illumination in semi-intact drosophila larvae in motion

Drosophila larvale locomozione è un sistema modello splendido in sviluppo e fisiologici delle neuroscienze, in virtù della accessibilità genetica dei componenti neuronali sottostanti nei circuiti 1-6. Applicazione di optogenetics 7,8 nel circuito neurale larvale ci permette di manipolare l&#39;attività neuronale in modi e nello spazio fantasia 9-13. Tipicamente, i campioni sono ampiamente illuminate con una lampada a mercurio o LED, così specificità dei neuroni bersaglio è controllata da sistemi di espressione genica binarie come il sistema GAL4-UAS 14,15. In questo lavoro, per migliorare la risoluzione spaziale di &quot;risoluzione sub-genetica&quot;, abbiamo illuminato localmente un sottoinsieme di neuroni nel cordone nervoso ventrale utilizzando laser implementati in un microscopio confocale convenzionale. Monitorando il movimento della parete del corpo delle larve semi-intatte, abbiamo interattivamente attivato o inibito l&#39;attività neurale con channelrhodopsin 16,17 Or halorhodopsin 18-20, rispettivamente. Da spazialmente e temporalmente illuminazione ristretta del tessuto neurale, possiamo manipolare l&#39;attività dei neuroni specifici nel circuito ad una specifica fase di comportamento. Questo metodo è utile per studiare il rapporto tra le attività di un gruppo neurale locale nel cordone nervoso ventrale e il pattern spazio-temporale di uscita del motore.

<html> Attivazione locale e transitoria dei motoneuroni con ChR2. Abbiamo espresso ChR2 nei motoneuroni. Gli assoni dei neuroni motori emergono da ciascun segmento progetto VNC ad un corrispondente segmento della parete del corpo. Quando abbiamo stimolato una o due segmenti del VNC con un laser blu, muscoli nei segmenti corrispondenti esposte contrazioni (Figura 1). Inibizione locale e transitoria dei motoneuroni con NpHR. Abbiamo espresso NpHR nei motoneuroni. Quando abbiamo stimolato qualche (1 ~ 2) segmenti di VNC con un laser giallo durante le contrazioni muscolari peristaltiche, l&#39;onda di propagazione è stato arrestato presso i corrispondenti segmenti della parete del corpo (Figura 2). Poi l&#39;onda riavviato dai segmenti arrestati quando abbiamo spento l&#39;illuminazione laser 13. 50513fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;fo: contenuti-width =&quot; 5.5in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Attivazione locale dei motoneuroni con ChR2. A. Schema di attivazione locale di preparazione in filetti. Con l&#39;illuminazione blu-luce di alcuni segmenti del cordone nervoso ventrale esprimono ChR2 nei motoneuroni, muscoli nei corrispondenti segmenti sono contratte (testa di freccia). B. immagini trasmissione di una larva sezionato. Illuminazione locale del cordone nervoso ventrale (freccia teste) induce la contrazione segmentale dei muscoli della parete del corpo (frecce). <img src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2highres.jpg"/> Figura 2. Inibizione locale dei motoneuroni con NpHR. A. Schema di inibizione locale della preparazione in filetti. Di colore giallo-lilluminazione ight di alcuni segmenti del cordone nervoso ventrale esprimono NpHR nei motoneuroni, muscoli contrazione durante spontaneamente-verificato movimento peristaltico (testa di freccia in alto) sono rilassati (testa di freccia in basso.) B. immagini trasmissione di una larva sezionato . Illuminazione locale del cordone nervoso ventrale (punte di freccia) rilassato i segmenti della parete del corpo spontaneamente-contratto (frecce).

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Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Qui si descrive un protocollo per optogenetic manipolazione delle attività dei motoneuroni, mentre il monitoraggio dei cambiamenti in uscita del motore (contrazione muscolare) in semi-intatte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve utilizzando laser all&#39;interno di un microscopio confocale convenzionale. Questa tecnica consente ai ricercatori di ottenere perturbazione locale dell&#39;attività neurale in pochi neuromeres per chiarire la dinamica di circuiti motore.

Optogenetic Perturbazione di attività neurale con illuminazione laser in semi-intatte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

11.5K Views.  The University of Tokyo. Qui si descrive un protocollo per optogenetic manipolazione delle attività dei motoneuroni, mentre il monitoraggio dei cambiamenti in uscita del motore (contrazione muscolare) in semi-intatte Drosophila Larve utilizzando laser all'interno di un microscopio confocale convenzionale. Questa tecnica consente ai ricercatori di ottenere perturbazione locale dell'attività neurale in pochi neuromeres per chiarire la dinamica di circuiti motore.

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In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In vivo Laser assotomia in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Ricerca

Neuroscienze

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Metodi locale e globale valutazione nocicezione termica in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualizzazione dei Propriorecettori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e pupe

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appetitivo apprendimento associativo olfattiva in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unit Metodi di registrazione per caratterizzare l&#39;attività neurale nel Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuiti olfattive

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Stimolazione Optogenetic del comportamento in Fuga<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

Neural Activity Propagazione in ippocampale preparazione piegato con un penetrante Micro-elettrodo Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Extracellulare La registrazione di un neurone attività combinata con Microiontophoretic applicazione di sostanze neuroattivi nei topi Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Nuovo metodo di analisi per Cold nocicezione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.