Name: high-resolution quantification of odor-guided behavior in drosophila melanogaster using the flywalk paradigm
Uploaded: 2015-12-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm at JoVE.com

Ringraziamo Daniel Veit per l&#39;assistenza tecnica e Pedro Gouveia a Electricidade Em Pò (electricidadeempo.net) per la personalizzazione del software di monitoraggio per le nostre richieste. Ringraziamo anche Tom Retzke per il supporto durante il processo di ripresa. Questo studio è stato sostenuto dalla Max Planck Society.

La costruzione e dettagli tecnici di Flywalk sono state descritte altrove 26 (in caso di eventuali problemi di stabilire questo set up, ulteriori informazioni possono essere ottenute da MK). Qui ci concentriamo su istruzioni dettagliate sulla gestione del paradigma che aiuterà ad ottenere risultati affidabili. 1. Fly Handling <ol><li> Posteriore vola in basso a culture media densità su supporto alimentare 27 sotto una 12 ore: 12 ore di luce: regime buio a 23-25 ​​° C e 70% di umidità relativa. A tal fine, lasciare 20-30 adulto di recente è emerso vola a riprodurre in una grande fiala cibo per 1 settimana, poi scarta mosche adulte e aspettare che la prole di emergere. </li><li> Raccogliere 30-40 nuovi emersi (età &lt;24 ore) mosche adulte e invecchiare in in nuovo un flaconcino contenente mezzo cibo 27 per 3-5 giorni. </li><li> Ventiquattro ore prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento comportamentale: Trasferire tutto 30-40 precedentemente raccolto 3-5 d vecchio (vedi 2.2) vola a un nuovo VIAl contenente un tappo di gomma di schiuma umida o un fazzolettino di carta umida con un aspiratore. NOTA: non anestetizzare le mosche con CO 2. </li></ol> 2. Preparazione del Setup Flywalk <ol><li> Utilizzare bottiglie da 250 ml come umidificatori. Riempire umidificatori con 100 ml di acqua distillata. </li><li> Preparare fiale odore. <ol><li> Preparare 500 microlitri 10 -3 diluizioni del odori puri acetato di etile, butirrato di etile, acetato e 2,3-isopentil butanedione in olio minerale solvente. </li><li> Collegare due valvole di ritegno a sfera per l&#39;odore fiala. Notare che il check valvole consentono solo per il flusso d&#39;aria unidirezionale. Pertanto, collegare valvole di ritegno in modo tale che l&#39;aria possa entrare nel flaconcino da un lato e lasciarla sull&#39;altro lato. </li><li> Rimuovere il coperchio di un tubo di reazione 200 microlitri PCR. Pipetta 100 ml di ogni diluizione odore in un tubo di reazione separata e posizionare i tubi in flaconi odore separati. Anche preparare un flaconcino contenente solo l&#39;odore oi minerali solventel. </li><li> Strettamente sigillare le fiale odore chiudendo utilizzando tasselli in acciaio inox e guarnizioni in gomma. </li><li> Collegare i 5 flaconcini odore (4 contenente odori e 1 contenenti olio minerale) al sistema di erogazione odore. Assicurati di collegarli in direzione del flusso destra. Un collegamento errato non solo compromettere l&#39;esperimento previsto, ma può anche contaminare il sistema di erogazione. </li></ol></li><li> Controllare eventuali perdite sigillando l&#39;uscita della camera di miscelazione del dispositivo stimolo. Assicurarsi che tutti i flussi d&#39;aria prima che il dispositivo di stimolo ora progressivamente scendono a zero. In caso contrario, controllare le perdite che possono ora essere identificati con il sibilo dell&#39;aria in uscita dal sistema. </li><li> Trasferire accuratamente 15 mosche individuali a 15 tubi in vetro individuo che usa un aspiratore e tubi di vetro chiudere su entrambi i lati con le schede corrispondenti. Nota: Poiché il sistema è chiuso ermeticamente per esperimenti di successo, in modo che le schede si adattano tubi di vetro ermeticamentee notare che tubi di vetro può rompersi durante questa fase. Fare attenzione per evitare lesioni indossando guanti e occhiali protettivi. </li><li> Collegare i tubi di vetro al setup Flywalk e, da qui in poi, attendere almeno 15 minuti prima di iniziare l&#39;esperimento per consentire le mosche abituare al nuovo ambiente. </li><li> Dopo aver collegato i tubi di vetro: controllare le letture dei misuratori di portata a valle digitali sul computer 1 se i 16 flussi d&#39;aria dopo i tubi di vetro si sommano al flusso d&#39;aria che entra nel sistema. Verificate anche sul computer 1, se l&#39;umidità è tra il 60% e l&#39;80%. </li><li> Progettazione protocollo stimolo controllare la sequenza e la tempistica di stimoli odore presentati alle mosche. Per ottenere ad esempio i dati descritti, presenti 4 odori e controllo (olio minerale) e singolarmente tutti i possibili ternari e quaternari miscele degli odori contemporaneamente per 40 volte ciascuno. Impostare la durata dell&#39;impulso di 500 ms ad un intervallo di 90 secondi interstimulus e casuale sequenza di stimolo. </li><li> Accendere il lifonte GHT (-cluster LED; λ = 630). Assicurati di fornire abbastanza luce per il monitoraggio efficiente senza aumentare la temperatura all&#39;interno dei tubi di vetro. </li><li> Impostare una regione di interesse del sistema di tracciamento trascinando una cornice all&#39;interno dell&#39;area da monitorare in modo tale che tutti i tubi di vetro 15 sono inclusi e sono esclusi circa 5 mm dei bordi dei tubi. </li><li> Impostare 14 linee di separazione parallele tra singoli tubi del sistema di tracciamento modificando le loro posizioni Y nello script corrispondente per mantenere individuale vola identificabile tutto l&#39;esperimento. Assicurarsi di posizionarli in modo tale che vi sia sempre un tubo di vetro tra due di tali linee di separazione, perché solo uno volare verrà tracciato tra qualsiasi insieme di due linee. </li><li> Assicurarsi di impostare i parametri della telecamera in modo tale che le mosche sono tracciati affidabile durante i tubi di vetro. Se mosche sono persi ai bordi della regione di interesse, aumentare la luminosità o guadagno del monitoraggio software. Evitare vibrazioni meccaniche del sistema di tracciamento. Traccia utilizzando il software commerciale secondo il protocollo del produttore. </li><li> Inizia esperimento avviando il protocollo stimolo. Record flies&#39; XY-coordinate a 20 fps (fotogrammi al secondo) e accedere in combinazione con lo stato della valvola odore in file di testo. </li></ol> Analisi 3. Dati NOTA: Le seguenti operazioni nell&#39;analisi dei dati sono automatizzate utilizza le routine custom scritti programmati in R. Poiché questi passaggi sono fondamentali per ottenere risultati significativi l&#39;analisi sarà comunque presentata in modo step-by-step. I dati grezzi per l&#39;analisi sono CSV-file contenenti informazioni sincronizzate sullo stato della valvola odore, il numero di impulsi nell&#39;esperimento e 15 fly x posizioni in cm su un asse temporale comune per un odore ciclo di stimolazione. Codice personalizzato per l&#39;analisi dei dati può essere fornita su richiesta. <ol><li> Aperto .csv file, trovare il tempo-punto di apertura della valvola significato da un chaESN nella colonna che rappresenta lo stato della valvola. </li><li> Calcolare la funzione lineare della posizione dell&#39;odore della forma f (t) = s * t + i dove t è il tempo nel ciclo di stimolazione, s è la velocità del vento (qui 20 cm / sec) e l&#39;intercetta i può essere calcolata usando il time-point l&#39;odore entra nelle provette a posizione 0 (apertura della valvola più ritardo). </li><li> Trovare il punto in cui l&#39;odore tempo e volare x-position si intersecano per ogni mosca e impostare questo time-point a 0. Nota: In questo modo le posizioni mosca sono allineate ad ogni individual&#39;s incontro con l&#39;odore. </li><li> Escludi mosche seduti ai bordi molto della regione di interesse. </li><li> Calcolare la velocità da X-posizioni dividendo spostamento lungo l&#39;asse x per l&#39;intervallo di tempo (100 msec) e ripetere la procedura per ogni ciclo di stimolazione. </li><li> Per ottenere temporali corsi velocità come mostrato nella Figura 2E calcolare medio di time-course velocità per ogni mosca e odore e da quelle del time-course medio per un determinato odore. </li><li> Per ottenere lo spostamento netto come mostrato in Figura 3C calcolare lo spostamento netto entro 4 secondi dopo l&#39;impulso odori per ogni evento di inseguimento e successivamente lo spostamento netto medio per volo e odore. </li></ol> 4. Procedura di pulizia <ol><li> Clean Glass Tubes <ol><li> Rimuovere le mosche e gli adattatori da tubi di vetro e godersi tubi di vetro con detergente. </li><li> Sciacquare tubi di vetro con acqua corrente distillata e asciugarle con aria compressa. </li><li> Tubi di vetro termico a 200 ° C per 8 ore. </li></ol></li><li> Pulire Odore Delivery System <ol><li> Rimuovere tutti i flaconi di odori e tubi dalla camera di miscelazione centrale. </li><li> Rimuovere adattatori tubi dalla camera di miscelazione. </li><li> Pulire camera di miscelazione con il risciacquo con soluzione detergente laboratorio e solventi (ad esempio etanolo, acetone). Eseguire queste operazioni sotto il cofano di laboratorio. </li><li> Camera di miscelazione a secco con aria pressurizzata e riscaldarlo a 200 ° C per 8 ore. </li></ol></li><li> Pulire Odore Fiale e Valvole <ol><li> Togliere il tappo in acciaio (guarnizione in gomma di scarto) e valvole di non ritorno di fiale di odori e godersi tutti i componenti nella soluzione detergente laboratorio. </li><li> Componenti Sonicare in un bagno a ultrasuoni e sciacquare con acqua distillata. </li><li> Pulire tutti i componenti ad eccezione di valvole di non ritorno con etanolo e acetone. Eseguire queste operazioni sotto il cofano di laboratorio. </li><li> Componenti asciugare con aria compressa e di riscaldare a 200 ° C per 8 ore. </li><li> Valvole di ritegno pulito dentro di loro lavaggio con etanolo e acetone utilizzando una siringa (ritengono direzione del flusso). Eseguire queste operazioni sotto il cofano laboratorio indossare occhiali di laboratorio. Perché acetone attacca parti in gomma, immediatamente valvole di ritegno a secco da vampate di calore con aria compressa. </li><li> Rimuovere odori residui da pulsare aria attraverso le valvole di ritegno per diversi giorni. Utilizzare un incubatore a 60 ° C ed aria 1 sec acceso / 1 sec aria fuori regime per questa fase di pulizia. </li></ol&gt; </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Anche se il sistema Flywalk appare piuttosto sofisticato, a prima vista, una volta istituito e funzionante, è facile da usare e produce risultati molto robusti. Per sottolineare la coerenza dei risultati ottenuti con il saggio biologico si può dire che i risultati rappresentativi riportati sono stati ottenuti quasi 2 anni dopo alcuni dei risultati riportati in un precedente studio 29 con una configurazione modificata utilizzando un nuovo software di monitoraggio e la sorgente luminosa. Tuttavia, le risposte...

L&#39;obiettivo primario di ogni ricerca neuroethological è di stabilire un nesso di causalità tra gli stati di attività dei singoli neuroni o circuiti neuronali e il comportamento di un organismo. Per raggiungere questo obiettivo l&#39;attività neuronale e comportamento devono essere monitorati in condizioni di stimolo identiche e queste condizioni di stimolo dovrebbe idealmente essere simili a quelle del sistema nervoso sotto controllo evoluto per dare un senso. Soprattutto quando si tratta di saggi biologici comportamentali, questi requisiti hanno storicamente dimostrato abbastanza esigente in Drosophila melanogaster neuroetologia olfattiva. Una volta liberato dalla fonte, pennacchi odore rapidamente si disgregano in filamenti sottili con diffusione turbolenta causato dal movimento dell&#39;aria è il principale determinante della distribuzione odori 1. Come risultato, un insetto navigazione verso una fonte di odore sperimenta stimolazione intermittente con pacchetti odore intervallati da intervalli variabili di aria pulita. Entrambe le particamminare e insetti volanti - tra Drosophila - sono stati dimostrati per sfruttare questo regime stimolazione intermittente per la navigazione da aumento di bolina su incontro pennacchio e prevalentemente in movimento vento di traverso, in assenza di odori 2 - 5. Considerando che le procedure di stimolazione negli esperimenti fisiologici ampiamente imitare quelli di un insetto che si verifichi nel suo ambiente naturale dovendo provvedere a singoli sbuffi di odori intervallati da lunghi periodi di aria pulita o sequenze di stimolazione dinamiche 6 - 11, molti test biologici comportamentali utilizzate in Drosophila neuroetologia quali test trappola , arene campo aperto o T-labirinto si affidano a odori-gradienti di 12 - 15. Tuttavia, perché gradienti odore per definizione sono variabili in concentrazione in funzione della distanza dalla sorgente di odore, un particolare comportamento non può essere attribuito ad una concentrazione di odore preciso usando questi paradigmi. Inoltre, la pendenzaun gradiente di odore dipende in modo critico sulle proprietà fisico-chimiche del odorizzante. Un gradiente di un composto altamente volatile sarà meno profonda di quella generata da un composto meno volatile e quindi anche più difficile da monitorare per un organismo basandosi sulla misurazione differenze di concentrazione nello spazio come unico mezzo di navigazione 16 - 20, che può portare ad una errata interpretazione delle preferenze olfattive particolarmente nei saggi di scelta. Questo effetto è anche molto dannoso nell&#39;ambito delle indagini comportamento verso miscele odore perché porta a rapporti dei componenti si fondono diverse in ogni punto dello spazio e quindi di nuovo preclude una chiara correlazione tra fisiologia e del comportamento. Mentre le mosche aceto tendono ad aggregarsi in fermentazione di frutta, che sono solitari nella loro navigazione verso fonti di cibo e siti deposizione delle uova. Tuttavia, invece di test singoli animali molti paradigmi comportamentali utilizzati in Drosophila neuroethology esaminare il comportamento di odore-guidata delle coorti di mosche e di attrazione è segnato come la frazione di mosche che scelgono l&#39;odore su uno stimolo di controllo. Questi esperimenti di coorte hanno contribuito notevolmente alla comprensione della mosca neuroetologia e molte delle osservazioni fatte con il loro impiego potrebbe essere confermato in esperimenti di singolo-fly. Tuttavia, è stato osservato che vola può influenzare ogni decisione other&#39;s 21 e in casi estremi la valutazione di un odore può passare da indifferenza all&#39;annullamento seconda densità di popolazione 22. Inoltre, i risultati di questi tipi di esperimenti spesso forniscono solo il punto finale di una sequenza di decisioni comportamentali piuttosto che osservando ciò al volo sta facendo mentre lo fa, che sarebbe desiderabile quando si tenta di correlare comportamento con attività neuronale. Questi esperimenti di coorte piuttosto bassa risoluzione si contrappongono ad alta risoluzione metodi single-fly, come arene dei voli frenati e tapis roulant che permettonoper l&#39;osservazione diretta delle risposte comportamentali al momento lo stimolo viene presentato 20,23,24. Tuttavia, gli esperimenti di coorte sono ancora popolari, perché sono molto efficienti e di risultati solidi anche a dimensioni comparabile bassa del campione perché la variabilità inter-individuale e inter-trial sono parzialmente in media a causa all&#39;osservazione delle popolazioni per lunghi periodi di tempo prolungati. Mentre volo tethered e tapis roulant probabilmente offrono il gold standard per quanto riguarda la presentazione dello stimolo e risoluzione temporale, arene utilizzati sono progettati per singoli animali ed è quindi in termini di tempo per ottenere le dimensioni necessarie campione per un&#39;analisi statistica. Molti altri approcci sono stati recentemente sviluppato che permettono una efficiente acquisizione di dati comportamentali ad alta risoluzione in combinazione con un regime di stimolo ben definita. Questi includono non supervisionato tracking 3D di più mosche di aceto in una galleria del vento in combinazione con un accurato modello 3D del pennacchio odore di 5 </sup&gt;, il monitoraggio di più mosche singoli nelle camere a scelta in dotazione con correnti d&#39;aria da entrambi i lati 25 e il paradigma Flywalk 26. In Flywalk, 15 mosche individuali si trovano in tubi di vetro di piccole e costantemente monitorate da una telecamera dall&#39;alto in condizioni a luci rosse. Gli odori vengono aggiunti ad un flusso d&#39;aria continuo di 20 cm / sec e viaggiano attraverso i tubi di vetro ad una velocità costante. Il flusso d&#39;aria viene umidificata mediante passaggio 250 ml bottiglie contenenti acqua distillata (umidificatori) prima di entrare nel sistema di erogazione odore. Le posizioni flies&#39; vengono registrati all&#39;interno di una regione quadrata di interesse (ROI) comprendente la maggior parte della lunghezza dei tubi di odore (esclusi i bordi esterni dei tubi (circa 5 mm su ciascun lato) dove le mosche non possono muoversi ulteriormente alto o sottovento) intorno al momento della presentazione dell&#39;odore (Figura 1A, B). Fly identità sono mantenuti costanti dal sistema di tracciamento tel corso l&#39;esperimento sulla base delle loro posizioni Y (vale a dire i loro limiti tubo di vetro). Stimolazione odore si ottiene utilizzando un dispositivo di stimolo multi-componente che permette la presentazione di fino a 8 singoli odori e tutte le possibili miscele 26,29 (Figura 1B). Il corso di un esperimento è controllato da un computer regolando il sistema di erogazione odore e raccolta di temperatura e umidità informazioni (computer 1, Figura 1C). Questo computer controlla anche un datalogger (avvio / arresto della registrazione) su un secondo computer, che registra continuamente posizioni mosca a 20 fotogrammi al secondo (computer 2). Vola posizioni, stato della valvola odore (cioè il tempo-punto di apertura della valvola), ID odore, temperatura e umidità intorno cicli di stimolazione odore è registrato sul computer 2. In questo modo le informazioni su odore e volare posizioni sono sincronizzati ed esportati come file .csv-che possono essere ulteriormente elaborati e analizzati utilizzando routine di analisi-custom scritta. Perchél&#39;intero sistema è controllato da computer, è necessario alcun intervento umano durante una sessione sperimentale.

<table><tbody><tr><td>Flywalk setup</td><td>Custom</td><td></td><td>details available upon request</td></tr><tr><td>stimulus device</td><td>Custom</td><td></td><td>details available upon request</td></tr><tr><td>LED cluster</td><td>Custom</td><td></td><td>details available upon request</td></tr><tr><td>HD Pro Webcam C920</td><td>Logitech, Lausanne, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 Computers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flywalk Reloaded v1.0 software</td><td>Electricidade Em P&amp;oacute; (electricidadeempo.net)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labview 11.0 software</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard fly food</td><td>Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard fly vials</td><td>Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard fly vials</td><td>Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aspirator</td><td>Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>odors</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l PCR reaction tubes</td><td>Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution quantification of odor-guided behavior in drosophila melanogaster using the flywalk paradigm

Nel loro ambiente naturale, insetti come l&#39;aceto mosca Drosophila melanogaster sono bombardati da una quantità enorme di odoranti chimicamente distinti. Per complicare ulteriormente le cose, gli odori rilevati dal sistema nervoso degli insetti non sono solitamente composti singoli ma miscele la cui composizione e rapporti di concentrazione variare. Questo porta ad una quantità quasi infinita di diversi stimoli olfattivi che devono essere valutata dal sistema nervoso. Per capire quali aspetti di uno stimolo odore determinano la sua valutazione da parte del volo, è pertanto auspicabile esaminare in modo efficiente il comportamento odore-guidati verso molte odoranti e miscele odore. Per correlare direttamente comportamento da attività neuronale, comportamento dovrebbe essere quantificato in un lasso di tempo comparabile e in condizioni di stimolo identiche in esperimenti neurofisiologici. Tuttavia, molti test biologici olfattivi attualmente utilizzati in Drosophila neuroetologia sono piuttosto speciazato sia verso l&#39;efficienza e verso la risoluzione. Flywalk, un sistema di erogazione di odore e automatizzato di monitoraggio, colma il divario tra efficienza e risoluzione. Esso permette di determinare esattamente quando un pacchetto odore stimolato una mosca liberamente a piedi, ea quali per animali da reazione dinamica comportamentale.

Poiché mosche possono distribuire liberamente all&#39;interno dei tubi di vetro tra impulsi odore e l&#39;impulso odore viaggia attraverso i tubi di vetro ad una velocità costante mosche incontrano l&#39;odore in tempi diversi a seconda della loro posizione x al momento della stimolazione. Come risultato, le esacerbazioni delle traiettorie controvento evocati da un impulso di 500 msec di un attraente 10 -3 diluizione di acetato di etile sono ritardate di circa 1 sec per mosche alla fine sottovento loro tubi...

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High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Il Flywalk sistema automatizzato di monitoraggio è utilizzato per ad alta risoluzione quantificazione del comportamento odore guidati in Drosophila melanogaster.

Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilizzo della<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

high-resolution-quantification-odor-guided-behavior-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

9.3K Views.  Max Planck Institute for Chemical Ecology.  Il Flywalk sistema automatizzato di monitoraggio è utilizzato per ad alta risoluzione quantificazione del comportamento odore guidati in Drosophila melanogaster. 

Video: High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Ricerca

Biologia

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Neuroscienze

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Monitoraggio ad alta risoluzione video di locomozione per adulti in Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Visivamente monitoraggio Odore mediata durante il volo in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

A Single-fly saggio per comportamento alimentare in<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay

Detecting signals from the environment is essential for animals to ensure their survival. To this aim, they use environmental cues such as vision, mechanoreception, hearing, and chemoperception through taste, via direct contact or through olfaction, which represents the response to a volatile molecule acting at longer range. Volatile chemical molecules are very important signals for most animals in the detection of danger, a source of food, or to communicate between individuals. Drosophila melanogaster is one of the most common biological models for scientists to explore the cellular and molecular basis of olfaction. In order to highlight olfactory abilities of this small insect, we describe a modified choice protocol based on the Y-maze test classically used with mice. Data obtained with Y-mazes give valuable information to better understand how animals deal with their perpetually changing environment. We introduce a step-by-step protocol to study the impact of odorants on fly exploratory response using this Y-maze assay.

Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay

We present a choice test to reveal the influence of odorants on Drosophila behavior using a Y-maze assay.

Test<em&gt; Drosophila</em&gt; Olfatto con un test Y-maze

Detecting signals from the environment is essential for animals to ensure their survival. To this aim, they use environmental cues such as vision, ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinazione del locomotore attività spontanea in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Comportamenti olfattive analizzati da Computer di monitoraggio di<em&gt; Drosophila</em&gt; In un Olfattometro quattro quadranti

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi di rilevamento

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Tracking Freely Walking Flies: A Method to Assess Locomotion in Drosophila

Source: Sun, M. and Chen, L. L. <a href="https://www.jove.com/video/55602/" target="_blank">A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila</a>. J. Vis. Exp. (2017).
This video describes how to track freely walking flies to assess their general locomotion ability. The featured protocol demonstrates the assay&#39;s setup and data analysis using video tracking software.

Tracciare le mosche che camminano liberamente: un metodo per valutare la locomozione in Drosophila

Source: Sun, M. and Chen, L. L. A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).
This video describes how to ...

Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

Monitoraggio ad alta risoluzione video di locomozione per adulti in Drosophila melanogaster

Visivamente monitoraggio Odore mediata durante il volo in Drosophila

A Single-fly saggio per comportamento alimentare in

Test

Determinazione del locomotore attività spontanea in

Comportamenti olfattive analizzati da Computer di monitoraggio di

Il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi di rilevamento

Tracciare le mosche che camminano liberamente: un metodo per valutare la locomozione in Drosophila