Ringraziamo Daniel Veit per l&#39;assistenza tecnica e Pedro Gouveia a Electricidade Em Pò (electricidadeempo.net) per la personalizzazione del software di monitoraggio per le nostre richieste. Ringraziamo anche Tom Retzke per il supporto durante il processo di ripresa. Questo studio è stato sostenuto dalla Max Planck Society.

La costruzione e dettagli tecnici di Flywalk sono state descritte altrove 26 (in caso di eventuali problemi di stabilire questo set up, ulteriori informazioni possono essere ottenute da MK). Qui ci concentriamo su istruzioni dettagliate sulla gestione del paradigma che aiuterà ad ottenere risultati affidabili. 1. Fly Handling <ol><li> Posteriore vola in basso a culture media densità su supporto alimentare 27 sotto una 12 ore: 12 ore di luce: regime buio a 23-25 ​​° C e 70% di umidità relativa. A tal fine, lasciare 20-30 adulto di recente è emerso vola a riprodurre in una grande fiala cibo per 1 settimana, poi scarta mosche adulte e aspettare che la prole di emergere. </li><li> Raccogliere 30-40 nuovi emersi (età &lt;24 ore) mosche adulte e invecchiare in in nuovo un flaconcino contenente mezzo cibo 27 per 3-5 giorni. </li><li> Ventiquattro ore prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento comportamentale: Trasferire tutto 30-40 precedentemente raccolto 3-5 d vecchio (vedi 2.2) vola a un nuovo VIAl contenente un tappo di gomma di schiuma umida o un fazzolettino di carta umida con un aspiratore. NOTA: non anestetizzare le mosche con CO 2. </li></ol> 2. Preparazione del Setup Flywalk <ol><li> Utilizzare bottiglie da 250 ml come umidificatori. Riempire umidificatori con 100 ml di acqua distillata. </li><li> Preparare fiale odore. <ol><li> Preparare 500 microlitri 10 -3 diluizioni del odori puri acetato di etile, butirrato di etile, acetato e 2,3-isopentil butanedione in olio minerale solvente. </li><li> Collegare due valvole di ritegno a sfera per l&#39;odore fiala. Notare che il check valvole consentono solo per il flusso d&#39;aria unidirezionale. Pertanto, collegare valvole di ritegno in modo tale che l&#39;aria possa entrare nel flaconcino da un lato e lasciarla sull&#39;altro lato. </li><li> Rimuovere il coperchio di un tubo di reazione 200 microlitri PCR. Pipetta 100 ml di ogni diluizione odore in un tubo di reazione separata e posizionare i tubi in flaconi odore separati. Anche preparare un flaconcino contenente solo l&#39;odore oi minerali solventel. </li><li> Strettamente sigillare le fiale odore chiudendo utilizzando tasselli in acciaio inox e guarnizioni in gomma. </li><li> Collegare i 5 flaconcini odore (4 contenente odori e 1 contenenti olio minerale) al sistema di erogazione odore. Assicurati di collegarli in direzione del flusso destra. Un collegamento errato non solo compromettere l&#39;esperimento previsto, ma può anche contaminare il sistema di erogazione. </li></ol></li><li> Controllare eventuali perdite sigillando l&#39;uscita della camera di miscelazione del dispositivo stimolo. Assicurarsi che tutti i flussi d&#39;aria prima che il dispositivo di stimolo ora progressivamente scendono a zero. In caso contrario, controllare le perdite che possono ora essere identificati con il sibilo dell&#39;aria in uscita dal sistema. </li><li> Trasferire accuratamente 15 mosche individuali a 15 tubi in vetro individuo che usa un aspiratore e tubi di vetro chiudere su entrambi i lati con le schede corrispondenti. Nota: Poiché il sistema è chiuso ermeticamente per esperimenti di successo, in modo che le schede si adattano tubi di vetro ermeticamentee notare che tubi di vetro può rompersi durante questa fase. Fare attenzione per evitare lesioni indossando guanti e occhiali protettivi. </li><li> Collegare i tubi di vetro al setup Flywalk e, da qui in poi, attendere almeno 15 minuti prima di iniziare l&#39;esperimento per consentire le mosche abituare al nuovo ambiente. </li><li> Dopo aver collegato i tubi di vetro: controllare le letture dei misuratori di portata a valle digitali sul computer 1 se i 16 flussi d&#39;aria dopo i tubi di vetro si sommano al flusso d&#39;aria che entra nel sistema. Verificate anche sul computer 1, se l&#39;umidità è tra il 60% e l&#39;80%. </li><li> Progettazione protocollo stimolo controllare la sequenza e la tempistica di stimoli odore presentati alle mosche. Per ottenere ad esempio i dati descritti, presenti 4 odori e controllo (olio minerale) e singolarmente tutti i possibili ternari e quaternari miscele degli odori contemporaneamente per 40 volte ciascuno. Impostare la durata dell&#39;impulso di 500 ms ad un intervallo di 90 secondi interstimulus e casuale sequenza di stimolo. </li><li> Accendere il lifonte GHT (-cluster LED; λ = 630). Assicurati di fornire abbastanza luce per il monitoraggio efficiente senza aumentare la temperatura all&#39;interno dei tubi di vetro. </li><li> Impostare una regione di interesse del sistema di tracciamento trascinando una cornice all&#39;interno dell&#39;area da monitorare in modo tale che tutti i tubi di vetro 15 sono inclusi e sono esclusi circa 5 mm dei bordi dei tubi. </li><li> Impostare 14 linee di separazione parallele tra singoli tubi del sistema di tracciamento modificando le loro posizioni Y nello script corrispondente per mantenere individuale vola identificabile tutto l&#39;esperimento. Assicurarsi di posizionarli in modo tale che vi sia sempre un tubo di vetro tra due di tali linee di separazione, perché solo uno volare verrà tracciato tra qualsiasi insieme di due linee. </li><li> Assicurarsi di impostare i parametri della telecamera in modo tale che le mosche sono tracciati affidabile durante i tubi di vetro. Se mosche sono persi ai bordi della regione di interesse, aumentare la luminosità o guadagno del monitoraggio software. Evitare vibrazioni meccaniche del sistema di tracciamento. Traccia utilizzando il software commerciale secondo il protocollo del produttore. </li><li> Inizia esperimento avviando il protocollo stimolo. Record flies&#39; XY-coordinate a 20 fps (fotogrammi al secondo) e accedere in combinazione con lo stato della valvola odore in file di testo. </li></ol> Analisi 3. Dati NOTA: Le seguenti operazioni nell&#39;analisi dei dati sono automatizzate utilizza le routine custom scritti programmati in R. Poiché questi passaggi sono fondamentali per ottenere risultati significativi l&#39;analisi sarà comunque presentata in modo step-by-step. I dati grezzi per l&#39;analisi sono CSV-file contenenti informazioni sincronizzate sullo stato della valvola odore, il numero di impulsi nell&#39;esperimento e 15 fly x posizioni in cm su un asse temporale comune per un odore ciclo di stimolazione. Codice personalizzato per l&#39;analisi dei dati può essere fornita su richiesta. <ol><li> Aperto .csv file, trovare il tempo-punto di apertura della valvola significato da un chaESN nella colonna che rappresenta lo stato della valvola. </li><li> Calcolare la funzione lineare della posizione dell&#39;odore della forma f (t) = s * t + i dove t è il tempo nel ciclo di stimolazione, s è la velocità del vento (qui 20 cm / sec) e l&#39;intercetta i può essere calcolata usando il time-point l&#39;odore entra nelle provette a posizione 0 (apertura della valvola più ritardo). </li><li> Trovare il punto in cui l&#39;odore tempo e volare x-position si intersecano per ogni mosca e impostare questo time-point a 0. Nota: In questo modo le posizioni mosca sono allineate ad ogni individual&#39;s incontro con l&#39;odore. </li><li> Escludi mosche seduti ai bordi molto della regione di interesse. </li><li> Calcolare la velocità da X-posizioni dividendo spostamento lungo l&#39;asse x per l&#39;intervallo di tempo (100 msec) e ripetere la procedura per ogni ciclo di stimolazione. </li><li> Per ottenere temporali corsi velocità come mostrato nella Figura 2E calcolare medio di time-course velocità per ogni mosca e odore e da quelle del time-course medio per un determinato odore. </li><li> Per ottenere lo spostamento netto come mostrato in Figura 3C calcolare lo spostamento netto entro 4 secondi dopo l&#39;impulso odori per ogni evento di inseguimento e successivamente lo spostamento netto medio per volo e odore. </li></ol> 4. Procedura di pulizia <ol><li> Clean Glass Tubes <ol><li> Rimuovere le mosche e gli adattatori da tubi di vetro e godersi tubi di vetro con detergente. </li><li> Sciacquare tubi di vetro con acqua corrente distillata e asciugarle con aria compressa. </li><li> Tubi di vetro termico a 200 ° C per 8 ore. </li></ol></li><li> Pulire Odore Delivery System <ol><li> Rimuovere tutti i flaconi di odori e tubi dalla camera di miscelazione centrale. </li><li> Rimuovere adattatori tubi dalla camera di miscelazione. </li><li> Pulire camera di miscelazione con il risciacquo con soluzione detergente laboratorio e solventi (ad esempio etanolo, acetone). Eseguire queste operazioni sotto il cofano di laboratorio. </li><li> Camera di miscelazione a secco con aria pressurizzata e riscaldarlo a 200 ° C per 8 ore. </li></ol></li><li> Pulire Odore Fiale e Valvole <ol><li> Togliere il tappo in acciaio (guarnizione in gomma di scarto) e valvole di non ritorno di fiale di odori e godersi tutti i componenti nella soluzione detergente laboratorio. </li><li> Componenti Sonicare in un bagno a ultrasuoni e sciacquare con acqua distillata. </li><li> Pulire tutti i componenti ad eccezione di valvole di non ritorno con etanolo e acetone. Eseguire queste operazioni sotto il cofano di laboratorio. </li><li> Componenti asciugare con aria compressa e di riscaldare a 200 ° C per 8 ore. </li><li> Valvole di ritegno pulito dentro di loro lavaggio con etanolo e acetone utilizzando una siringa (ritengono direzione del flusso). Eseguire queste operazioni sotto il cofano laboratorio indossare occhiali di laboratorio. Perché acetone attacca parti in gomma, immediatamente valvole di ritegno a secco da vampate di calore con aria compressa. </li><li> Rimuovere odori residui da pulsare aria attraverso le valvole di ritegno per diversi giorni. Utilizzare un incubatore a 60 ° C ed aria 1 sec acceso / 1 sec aria fuori regime per questa fase di pulizia. </li></ol&gt; </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Anche se il sistema Flywalk appare piuttosto sofisticato, a prima vista, una volta istituito e funzionante, è facile da usare e produce risultati molto robusti. Per sottolineare la coerenza dei risultati ottenuti con il saggio biologico si può dire che i risultati rappresentativi riportati sono stati ottenuti quasi 2 anni dopo alcuni dei risultati riportati in un precedente studio 29 con una configurazione modificata utilizzando un nuovo software di monitoraggio e la sorgente luminosa. Tuttavia, le risposte...

L&#39;obiettivo primario di ogni ricerca neuroethological è di stabilire un nesso di causalità tra gli stati di attività dei singoli neuroni o circuiti neuronali e il comportamento di un organismo. Per raggiungere questo obiettivo l&#39;attività neuronale e comportamento devono essere monitorati in condizioni di stimolo identiche e queste condizioni di stimolo dovrebbe idealmente essere simili a quelle del sistema nervoso sotto controllo evoluto per dare un senso. Soprattutto quando si tratta di saggi biologici comportamentali, questi requisiti hanno storicamente dimostrato abbastanza esigente in Drosophila melanogaster neuroetologia olfattiva. Una volta liberato dalla fonte, pennacchi odore rapidamente si disgregano in filamenti sottili con diffusione turbolenta causato dal movimento dell&#39;aria è il principale determinante della distribuzione odori 1. Come risultato, un insetto navigazione verso una fonte di odore sperimenta stimolazione intermittente con pacchetti odore intervallati da intervalli variabili di aria pulita. Entrambe le particamminare e insetti volanti - tra Drosophila - sono stati dimostrati per sfruttare questo regime stimolazione intermittente per la navigazione da aumento di bolina su incontro pennacchio e prevalentemente in movimento vento di traverso, in assenza di odori 2 - 5. Considerando che le procedure di stimolazione negli esperimenti fisiologici ampiamente imitare quelli di un insetto che si verifichi nel suo ambiente naturale dovendo provvedere a singoli sbuffi di odori intervallati da lunghi periodi di aria pulita o sequenze di stimolazione dinamiche 6 - 11, molti test biologici comportamentali utilizzate in Drosophila neuroetologia quali test trappola , arene campo aperto o T-labirinto si affidano a odori-gradienti di 12 - 15. Tuttavia, perché gradienti odore per definizione sono variabili in concentrazione in funzione della distanza dalla sorgente di odore, un particolare comportamento non può essere attribuito ad una concentrazione di odore preciso usando questi paradigmi. Inoltre, la pendenzaun gradiente di odore dipende in modo critico sulle proprietà fisico-chimiche del odorizzante. Un gradiente di un composto altamente volatile sarà meno profonda di quella generata da un composto meno volatile e quindi anche più difficile da monitorare per un organismo basandosi sulla misurazione differenze di concentrazione nello spazio come unico mezzo di navigazione 16 - 20, che può portare ad una errata interpretazione delle preferenze olfattive particolarmente nei saggi di scelta. Questo effetto è anche molto dannoso nell&#39;ambito delle indagini comportamento verso miscele odore perché porta a rapporti dei componenti si fondono diverse in ogni punto dello spazio e quindi di nuovo preclude una chiara correlazione tra fisiologia e del comportamento. Mentre le mosche aceto tendono ad aggregarsi in fermentazione di frutta, che sono solitari nella loro navigazione verso fonti di cibo e siti deposizione delle uova. Tuttavia, invece di test singoli animali molti paradigmi comportamentali utilizzati in Drosophila neuroethology esaminare il comportamento di odore-guidata delle coorti di mosche e di attrazione è segnato come la frazione di mosche che scelgono l&#39;odore su uno stimolo di controllo. Questi esperimenti di coorte hanno contribuito notevolmente alla comprensione della mosca neuroetologia e molte delle osservazioni fatte con il loro impiego potrebbe essere confermato in esperimenti di singolo-fly. Tuttavia, è stato osservato che vola può influenzare ogni decisione other&#39;s 21 e in casi estremi la valutazione di un odore può passare da indifferenza all&#39;annullamento seconda densità di popolazione 22. Inoltre, i risultati di questi tipi di esperimenti spesso forniscono solo il punto finale di una sequenza di decisioni comportamentali piuttosto che osservando ciò al volo sta facendo mentre lo fa, che sarebbe desiderabile quando si tenta di correlare comportamento con attività neuronale. Questi esperimenti di coorte piuttosto bassa risoluzione si contrappongono ad alta risoluzione metodi single-fly, come arene dei voli frenati e tapis roulant che permettonoper l&#39;osservazione diretta delle risposte comportamentali al momento lo stimolo viene presentato 20,23,24. Tuttavia, gli esperimenti di coorte sono ancora popolari, perché sono molto efficienti e di risultati solidi anche a dimensioni comparabile bassa del campione perché la variabilità inter-individuale e inter-trial sono parzialmente in media a causa all&#39;osservazione delle popolazioni per lunghi periodi di tempo prolungati. Mentre volo tethered e tapis roulant probabilmente offrono il gold standard per quanto riguarda la presentazione dello stimolo e risoluzione temporale, arene utilizzati sono progettati per singoli animali ed è quindi in termini di tempo per ottenere le dimensioni necessarie campione per un&#39;analisi statistica. Molti altri approcci sono stati recentemente sviluppato che permettono una efficiente acquisizione di dati comportamentali ad alta risoluzione in combinazione con un regime di stimolo ben definita. Questi includono non supervisionato tracking 3D di più mosche di aceto in una galleria del vento in combinazione con un accurato modello 3D del pennacchio odore di 5 </sup&gt;, il monitoraggio di più mosche singoli nelle camere a scelta in dotazione con correnti d&#39;aria da entrambi i lati 25 e il paradigma Flywalk 26. In Flywalk, 15 mosche individuali si trovano in tubi di vetro di piccole e costantemente monitorate da una telecamera dall&#39;alto in condizioni a luci rosse. Gli odori vengono aggiunti ad un flusso d&#39;aria continuo di 20 cm / sec e viaggiano attraverso i tubi di vetro ad una velocità costante. Il flusso d&#39;aria viene umidificata mediante passaggio 250 ml bottiglie contenenti acqua distillata (umidificatori) prima di entrare nel sistema di erogazione odore. Le posizioni flies&#39; vengono registrati all&#39;interno di una regione quadrata di interesse (ROI) comprendente la maggior parte della lunghezza dei tubi di odore (esclusi i bordi esterni dei tubi (circa 5 mm su ciascun lato) dove le mosche non possono muoversi ulteriormente alto o sottovento) intorno al momento della presentazione dell&#39;odore (Figura 1A, B). Fly identità sono mantenuti costanti dal sistema di tracciamento tel corso l&#39;esperimento sulla base delle loro posizioni Y (vale a dire i loro limiti tubo di vetro). Stimolazione odore si ottiene utilizzando un dispositivo di stimolo multi-componente che permette la presentazione di fino a 8 singoli odori e tutte le possibili miscele 26,29 (Figura 1B). Il corso di un esperimento è controllato da un computer regolando il sistema di erogazione odore e raccolta di temperatura e umidità informazioni (computer 1, Figura 1C). Questo computer controlla anche un datalogger (avvio / arresto della registrazione) su un secondo computer, che registra continuamente posizioni mosca a 20 fotogrammi al secondo (computer 2). Vola posizioni, stato della valvola odore (cioè il tempo-punto di apertura della valvola), ID odore, temperatura e umidità intorno cicli di stimolazione odore è registrato sul computer 2. In questo modo le informazioni su odore e volare posizioni sono sincronizzati ed esportati come file .csv-che possono essere ulteriormente elaborati e analizzati utilizzando routine di analisi-custom scritta. Perchél&#39;intero sistema è controllato da computer, è necessario alcun intervento umano durante una sessione sperimentale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="866">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flywalk setup</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:207px;">details available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">stimulus device</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>details available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LED cluster</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>details available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HD Pro Webcam C920</td>
			<td style="width:325px;">Logitech, Lausanne, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 Computers</td>
			<td style="width:325px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:216px;">Flywalk Reloaded v1.0 software</td>
			<td style="width:325px;">Electricidade Em P&#243; (electricidadeempo.net)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Labview 11.0 software</td>
			<td style="width:325px;">National Instruments, Austin, TX</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Standard fly food</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:216px;">Standard fly vials</td>
			<td style="width:325px;">Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Standard fly vials</td>
			<td style="width:325px;">Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">aspirator</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mineral oil</td>
			<td style="width:325px;">Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">odors</td>
			<td style="width:325px;">Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:216px;">200 &#181;l PCR reaction tubes</td>
			<td style="width:325px;">Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution quantification of odor-guided behavior in drosophila melanogaster using the flywalk paradigm

Nel loro ambiente naturale, insetti come l&#39;aceto mosca Drosophila melanogaster sono bombardati da una quantità enorme di odoranti chimicamente distinti. Per complicare ulteriormente le cose, gli odori rilevati dal sistema nervoso degli insetti non sono solitamente composti singoli ma miscele la cui composizione e rapporti di concentrazione variare. Questo porta ad una quantità quasi infinita di diversi stimoli olfattivi che devono essere valutata dal sistema nervoso. Per capire quali aspetti di uno stimolo odore determinano la sua valutazione da parte del volo, è pertanto auspicabile esaminare in modo efficiente il comportamento odore-guidati verso molte odoranti e miscele odore. Per correlare direttamente comportamento da attività neuronale, comportamento dovrebbe essere quantificato in un lasso di tempo comparabile e in condizioni di stimolo identiche in esperimenti neurofisiologici. Tuttavia, molti test biologici olfattivi attualmente utilizzati in Drosophila neuroetologia sono piuttosto speciazato sia verso l&#39;efficienza e verso la risoluzione. Flywalk, un sistema di erogazione di odore e automatizzato di monitoraggio, colma il divario tra efficienza e risoluzione. Esso permette di determinare esattamente quando un pacchetto odore stimolato una mosca liberamente a piedi, ea quali per animali da reazione dinamica comportamentale.

Poiché mosche possono distribuire liberamente all&#39;interno dei tubi di vetro tra impulsi odore e l&#39;impulso odore viaggia attraverso i tubi di vetro ad una velocità costante mosche incontrano l&#39;odore in tempi diversi a seconda della loro posizione x al momento della stimolazione. Come risultato, le esacerbazioni delle traiettorie controvento evocati da un impulso di 500 msec di un attraente 10 -3 diluizione di acetato di etile sono ritardate di circa 1 sec per mosche alla fine sottovento loro tubi...

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High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Il Flywalk sistema automatizzato di monitoraggio è utilizzato per ad alta risoluzione quantificazione del comportamento odore guidati in Drosophila melanogaster.

Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilizzo della<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

high-resolution-quantification-odor-guided-behavior-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

9.2K Views.  Max Planck Institute for Chemical Ecology.  Il Flywalk sistema automatizzato di monitoraggio è utilizzato per ad alta risoluzione quantificazione del comportamento odore guidati in Drosophila melanogaster. 

Video: High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Registrazioni Sensillum singolo in Insetti Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Ricerca

Neuroscienze

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Stimolazione Optogenetic del comportamento in Fuga<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinazione del locomotore attività spontanea in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

Assay Semplice per la quantificazione della Social Prevenzione in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Un modo semplice per misurare alterazioni in ricompensa il comportamento di ricerca Utilizzando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

Il capillare alimentatore Assay Misure assunzione di cibo in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

Quantificazione del comportamento del grooming di Drosophila

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), Huntington&#39;s disease (HD), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Protein aggregates are closely associated with neuropathology in these diseases, although the exact mechanism by which aberrant protein aggregation disrupts normal cellular homeostasis is not known. Emerging data provide strong support for the hypothesis that pathogenic aggregates in AD, PD, HD, and ALS have many similarities to prions, which are protein-only infectious agents responsible for the transmissible spongiform encephalopathies. Prions self-replicate by templating the conversion of natively-folded versions of the same protein, causing spread of the aggregation phenotype. How prions and prion-like proteins in AD, PD, HD, and ALS move from one cell to another is currently an area of intense investigation. Here, a Drosophila melanogaster model that permits monitoring of prion-like, cell-to-cell transmission of mutant huntingtin (Htt) aggregates associated with HD is described. This model takes advantage of powerful tools for manipulating transgene expression in many different Drosophila tissues and utilizes a fluorescently-tagged cytoplasmic protein to directly report prion-like transfer of mutant Htt aggregates. Importantly, the approach we describe here can be used to identify novel genes and pathways that mediate spreading of protein aggregates between diverse cell types in vivo. Information gained from these studies will expand the limited understanding of the pathogenic mechanisms that underlie neurodegenerative diseases and reveal new opportunities for therapeutic intervention.

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Accumulating evidence supports the idea that pathogenic protein aggregates associated with neurodegenerative diseases spread between cells with prion-like properties. Here, we describe a method that enables visualization of cell-to-cell spreading of prion-like aggregates in the model organism, Drosophila melanogaster.