Questo lavoro è stato sostenuto da NSF concedere MCB-0817827.

Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è una tecnica ben consolidata in grado di determinare tutti i parametri termodinamici (affinità, entalpia e stechiometria) di una interazione vincolante in un esperimento. ITC 1 opere per titolazione di un reagente in un secondo reagente in condizioni isoterme. Il segnale misurato è il calore rilasciato o assorbito in seguito all&#39;interazione (vincolante) dei due reagenti. Una serie di iniezioni vengono eseguite e il segnale di calore si avvicinerà allo zero come il reagente limitante si satura. Montaggio della isoterma dà i parametri termodinamici. Sono disponibili diverse recensioni che descrivono la strumentazione e la matematica di raccolta dati e analisi. Calorimetri 2,3 Mentre gli altri sono disponibili (in particolare l&#39;ITC 200 con piccoli volumi), qui descriviamo un protocollo generale per la VP-ITC fabbricati da MicroCal (ora parte di GE Healthcare). 1. Preparazione Campioni <ol><li> Per preparare la macromolecola e ligando nel buffer, alcune potenziali problematiche devono essere affrontate. Si adatta accurato richiedono concentrazione corretta della macromolecola, la specie che va di solito nella cella campione del ITC, e ligando, specie nella siringa. Perché alcune proteine ​​aggregate alle concentrazioni elevate necessarie per la specie nella siringa per iniezione, il più delle volte la proteina viene caricato nella cella campione. La concentrazione ottimale macromolecola è determinato da &quot;c&quot;, il prodotto della affinità previsto del sistema, che può essere stimato con metodi ortogonali prima di utilizzare ITC, e la concentrazione macromolecola totale, dove c = K a * [M]. Valori ottimali del campo c 10-1000, 1 se è possibile ottenere dati precisi per deboli nel legame sistemi in specifiche condizioni sperimentali con c-valori al di sotto del limite inferiore. 4 Così, la concentrazione macromolecola deve essere determinata con questa gamma di valori di c in mente (ad esempio, per un K a di 10 6 M -1, concentrazioni macromolecola da 10 a 1000 mM dovrebbe essere usato). Conoscenza preliminare della affinità di legame del sistema può aiutare a minimizzare la proteina usata per ITC attraverso una migliore progettazione dell&#39;esperimento ITC. La concentrazione del ligando deve essere sufficientemente grande (7-25 volte più concentrato di quello d K per il sito di legame più debole) in modo che la saturazione si verifica entro il primo terzo alla metà della titolazione. Montaggio accurato dei dati richiede anche la saturazione del segnale. Per i sistemi con una maggiore affinità di legame, una concentrazione di ligando minore deve essere usato per evitare la saturazione troppo presto nella titolazione, che darà adatta imprecisi. Una volta che il calore di diluizione del controllo (ad esempio la titolazione del ligando nel buffer) è stato sottratto dal titolazione, l&#39;entalpia di saturazione dovrebbe avvicinarsi allo zero. </li><li> Perché impurità piccola molecola può dare origine a segnali artefatta nelle misure ITC, è meglio, se possibile, che la macromolecola e ligando essere esaustivo dializzati contro buffer. In alternativa, cromatografia su colonna, dissalazione colonne di rotazione, o tampone filtri scambio centrifugo (per esempio, Centricons) può essere utilizzato per modificare il buffer della macromolecola. Se il legante è una piccola molecola, che può essere preparato utilizzando il buffer di dialisi dopo la macromolecola è stato dializzati o con dialisi contro membrane da dialisi con cut-off adatto per piccole molecole (ad esempio 100-500 Da un Spectra / Por Float-A-Lyzer ). Le differenze nella composizione cuscinetto tra il ligando e soluzioni macromolecola può portare ad artefatti segnale dal calore della diluizione delle impurità nei campioni. Dopo la preparazione, controllare che il pH della partita buffer, macromolecola e ligando (± 0,05 unità di pH) come artefatti nel entalpia possono sorgere a causa del buffer effetti protonazione. 5 Assicurarsi di preparare abbastanza di ogni specie. Per esperimenti in triplo e un controllo di diluizione, la quantità di materiale necessario dipende dalla ITC utilizzati. Ma, per la maggior parte degli strumenti ITC che sono circa 2 ml di cellule campione di volume, almeno 6-7 ml di soluzione macromolecola saranno necessari, e possono essere comodamente preparato in 15 ml tubi falco. Per 300 siringhe da iniezione microlitri, 1-2 ml di soluzione devono essere adeguati, e può essere preparato in entrambi i tubi di falco o tubi microcentrifuga. </li><li> Polvere e altre particelle, possono causare artefatti in linea di base del termogramma ITC. E &#39;imperativo che siano rimossi prima di eseguire l&#39;esperimento. Dopo la preparazione delle soluzioni madre del campione, i campioni devono essere centrifugati in tubi microcentrifuga per cinque minuti a 8000 a 14.000 RPM pellet particelle in soluzione. Rimuovere il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet, e metterlo in un falco / microcentrifuga nuovo tubo. Se riducenti sono necessarie per mantenere cisteine ​​ridotte, l&#39;uso basse concentrazioni e le scorte fresco di β-mercaptoethanol, TCEP (tris (2-carbossi) fosfina) o ditiotreitolo per ridurre al minimo qualsiasi artefatto dovuto all&#39;ossidazione riducente. Inoltre, la presenza di solventi organici nel buffer (comune per alcuni ligandi piccola molecola che potrebbe essere necessario metanolo o DMSO per essere solubile) può causare artefatti del segnale. Se solventi organici necessari per il ligando, allora la soluzione macromolecola deve contenere anche la stessa concentrazione per evitare qualsiasi segnale derivante dal calore di diluizione del solvente organico. Lievi differenze nella composizione cuscinetto tra il ligando e macromolecola a causa di cosolventi, sali o pH sono possibili durante la preparazione dei campioni. E &#39;meglio verificare la diluizione del ligando nel buffer del campione o del tampone campione nella macromolecola per assicurare che i segnali di calore derivanti dalle differenze di contenuto del buffer non causano dati derivante esclusivamente dagli artefatti. </li><li> Controllare la concentrazione della macromolecola e ligando accuratamente con tecniche adatte al vostro sistema (come ad esempio le misure di assorbanza, HPLC, test colorimetrici, saggi BCA per le proteine, ecc) per registrare il loro concentrazione esatta. Differenze nella concentrazione effettiva e la concentrazione utilizzati per adattare l&#39;isoterma causerà errori nella stechiometria, entalpia e affinità di legame determinati dall&#39;esperimento. E &#39;comune a Degas i campioni al fine di evitare artefatti del segnale a causa di bolle d&#39;aria o il rilascio di gas disciolti nel corso della titolazione, in particolare a temperature più elevate. </li></ol> 2. Configurazione del test <ol><li> Assicurarsi che la cella campione e la siringa per iniezione sono puliti secondo il protocollo del produttore prima di caricare la macromolecola e ligando. Risciacquare la cella del campione due o tre volte con 1,8 ml di acqua distillata usando la siringa Hamilton (fare attenzione con la siringa Hamilton come la canna è facilmente rotto o piegato il ago). Avanti sciacquare la cella campione più volte con 1,8 ml di buffer. Caricare il cellulare del campione con 1,8 ml di soluzione macromolecola, facendo attenzione ad evitare la formazione di bolle. </li><li> Riempire la cella di riferimento con acqua distillata. Per la maggior parte tamponi, acqua distillata va bene da utilizzare come soluzione di riferimento. Tuttavia, per i buffer di forza ionica particolarmente elevate o di osmolalità, è meglio utilizzare il buffer come riferimento. </li><li> Rimuovere le bolle d&#39;aria dalle cellule e del campione con la siringa Hamilton. Delicatamente spostare l&#39;ago della siringa su e giù i lati della cellula bussare eventuali bolle che possono essere alla base della cellula e attaccato al bene alla parte superiore della cella. Rimuovere qualsiasi volume in eccesso dal campione e le cellule di riferimento. </li><li> Attaccare una siringa di plastica alla porta di riempimento della siringa utilizzando un tubo. Sciacquare la siringa con acqua distillata. Seguite da un buffer di risciacquo. Assicurarsi che la siringa è completamente evacuato disegnando l&#39;aria attraverso il sistema. Posizionare l&#39;ago della siringa nella soluzione ligando e disegnare la soluzione legante nella siringa di iniezione fino a quando la siringa è piena. Continuare a disegnare un piccolo volume in eccesso (circa 50 microlitri o più) nella porta e il tubo attaccato. Si chiude subito la porta di riempimento della siringa e staccare la siringa e tubi in plastica. Purge e riempire la siringa d&#39;iniezione due volte per rimuovere eventuali bolle dalla siringa. Rimuovere la siringa dalla soluzione legante e pulire il lato con un kimwipe per rimuovere eventuali cadute, facendo attenzione a non toccare la punta della siringa al kimwipe in quanto ciò potrebbe togliere il volume della siringa. Inoltre, fare attenzione a non urtare o barattolo la siringa in quanto ciò può causare anche perdita di volume dalla punta della siringa. Posizionare la siringa nella cella del campione. </li><li> Impostare i parametri per l&#39;esecuzione del ITC. Per i sistemi di rilegatura con segnali forte calore, un elevato numero di iniezioni a basso volume darà punti più dati per il montaggio (es. 75 iniezioni di 3 ml). Per i sistemi che hanno i segnali deboli di calore, un piccolo numero di iniezioni di grandi volumi sono da preferire (per esempio 33 iniezioni di 8 microlitri). Più comunemente, un minor numero di iniezioni con volumi di iniezione maggiore sono in uso. Si può richiedere diverse titolazioni per ottimizzare le condizioni che sono i migliori per il vostro sistema. E &#39;importante notare che l&#39;entalpia vincolante può essere esotermica o endotermica, a seconda del sistema in fase di studio. Purtroppo, alcuni sistemi hanno segnali a fuoco basso, rendendo il calore di reazione difficile da determinare. Problemi con tali sistemi possono potenzialmente essere superato aumentando la concentrazione della macromolecola, modificare la temperatura dell&#39;esperimento (a seconda della capacità termica del sistema di rilegatura), e / o alterare il pH o forza ionica del tampone. </li><li> Anche prendere in considerazione la distanza di tempo tra ogni iniezione. E &#39;imperativo che dopo ogni iniezione di ligando, il sistema è dato il tempo di equilibrare e il segnale di calore ritorna al basale prima dell&#39;iniezione successiva verifica. Per la maggior parte dei sistemi, 04:57 minutes dovrebbe essere adeguato. Il tempo tra le iniezioni devono essere aumentate sistemi in cui l&#39;equilibrio non si verifica entro cinque minuti. </li><li> Perché ci sarà qualche miscelazione tra la macromolecola e soluzioni ligando nella siringa una volta che è inserita nella cella del campione, la prima iniezione darà risultati spuri. E &#39;meglio usare piccoli volumi (ad esempio 2 microlitri) per i primi uno o due iniezioni (in modo che possano poi essere scartato) e mantenere le iniezioni successive ai valori desiderati. </li><li> Scegliere la temperatura della sperimentazione (con 25 ° C rappresenta la più comune, anche se le temperature tra i 2 ei 80 ° C può essere utilizzato). E &#39;meglio scegliere una temperatura che corrisponde altri esperimenti (vincolante, cinetica, ecc) eseguite sul sistema ligando-macromolecola. L&#39;ITC può essere impostata per equilibrare ad una temperatura diversa dalla temperatura dell&#39;esperimento. Se l&#39;esperimento sta per essere eseguita ad una temperatura di oltre 10 ° C al riparo dalla temperatura ambiente, quindi è meglio impostare la temperatura di equilibrio per lo strumento entro 5 ° C della temperatura sperimentale. Ciò diminuisce il tempo lo strumento necessario per raggiungere la temperatura di questo esperimento. La velocità di agitazione della siringa deve anche essere considerato. Agitazione è necessario per un&#39;adeguata miscelazione del legante e macromolecola nel corso della titolazione, ma alcune proteine ​​sono destabilizzate da agitarla rapidamente. Per questi casi, la velocità di agitazione dovrebbe essere fissata a un tasso relativamente basso. Una volta che tutti i parametri sperimentali sono stati istituiti, allora l&#39;esperimento può essere avviato. </li><li> Una volta che l&#39;esperimento è finito, l&#39;ITC può essere pulito secondo il protocollo del produttore. La soluzione nella cella del campione, alla fine di questo esperimento può essere mantenuta se ulteriori esperimenti sulla macromolecola-ligando miscela complessa sono volute. </li><li> Ripetere la titolazione almeno una o due volte di più per ottenere dati riproducibili. Eseguire un controllo in cui è titolato ligando nel buffer nella cella del campione per determinare il calore di diluizione per il ligando. Per alcuni sistemi dove c&#39;è cooperativa vincolante, ulteriori informazioni sul processo di associazione può essere ottenuto iniettando il macromolecola nel ligando. Gli orientamenti diversi di iniezione può fornire ulteriori informazioni, che può essere utile per il montaggio globale 6. </li></ol> 3. Analizzando i dati <ol><li> Montaggio dei dati può essere facilmente effettuata utilizzando le macro in qualsiasi programma di raccordo dei dati (generalmente fornito dal produttore insieme con lo strumento). Caricare il primo file di dati. Controllare il termogramma prime per eventuali segni di bolle d&#39;aria o altri artefatti nel segnale. Se ci sono artefatti (come i picchi nella linea di base o picchi di quando non c&#39;era l&#39;iniezione a quella data), quindi annotare questi dati come dovrebbero essere rimossi. Quindi, caricare i dati di diluizione controllo ligando, e sottrarre i dati di diluizione ligando dal legame isoterma. A questo punto, rimuovere tutti i punti dati spuri, tra i primi uno o due punti dati della titolazione in cui si verificano artefatti diluizione (vedi punto 7). </li><li> Selezionare il modello di raccordo dei dati (un sito di legame, due / più siti di legame, legame cooperativo, ecc) da utilizzare per adattarsi ai dati. I dati possono essere in forma con ipotesi iniziali dei parametri di montaggio, stechiometria (n), entalpia (ΔH) e affinità di legame (K a). Se la conoscenza preventiva del affinità di legame, o altri parametri, è noto da esperimenti ortogonali, allora questi valori possono essere inseriti. Questo consente di evitare l&#39;adattamento rimanere intrappolati in minimi locali durante il montaggio. Una volta che i dati sono stati in forma per la prima titolazione, ripetere i passaggi 15 e 16 per il resto le isoterme. In alternativa, i dati possono essere in forma a livello globale utilizzando programmi come SEDPHAT 6. SEDPHAT può essere particolarmente utile nel montaggio globale del binario set di dati complessi (cioè molecole A + B) in combinazione con il set di dati complessi ternari (molecole di A + B + C). Ad esempio, nel legame della molecola C per un complesso AB, non è sempre chiaro se ci possa essere alcun segnale dovuto al legame di C alla A o di B ad A (se A non è completamente saturo). </li><li> Per garantire che i dati ITC non sono artefatta, l&#39;affinità di legame e stechiometrie ottenuti da ITC deve essere confrontato con un metodo ortogonale. 7,8 Inoltre, il valore entalpia ITC può essere paragonato al entalpia da un complotto van&#39;t Hoff 9. Può anche rivelarsi utile per utilizzare diverse concentrazioni del ligando o macromolecola come valore assoluto del segnale di calore dovrebbe aumentare con l&#39;aumentare della concentrazione di macromolecole. Gli artefatti sono più probabilità di verificarsi se i buffer nella cella e siringa non corrispondono. Un&#39;altra possibilità per i manufatti nasce da campioni impuri. </li><li> Si raccomanda che l&#39;utente inizia con semplici titolazioni binario complessi per i quali ci sono informazioni disponibili sulla precedente K d e stoichiometry. Poi, se ligandi si legano aggiuntivi, l&#39;utente può provare più complicato titolazioni complesso ternario, variando le concentrazioni di ligando, e forse il passaggio della siringa e componenti cellulari. Un confronto tra entalpie per entrambi i percorsi di formazione ternario complesso dovrebbe essere come additivo entalpia è una funzione di stato. 10 Ancora una volta, SEDPHAT 6 è probabile che sia molto utile qui. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2796/2796fig1.jpg" /> Figura 1. Un esempio rappresentativo di una ben educato titolazione per il legame del cofattore NADPH a E. coli cromosomiche diidrofolato reduttasi (ecDHFR). Pannello (A) mostra il termogramma prime; (B), l&#39;isoterma vincolante dal fit termogramma integrato con il modello di un sito nel software di origine, e (C) l&#39;adattamento del isoterma utilizzando il modello di sito di legame da SEDPHAT lungo con residui in forma. Dal software di origine, utilizzando il modello di sito di legame, n = 1,09 ± 0,02, K d = 0,194 ± 0,001 micron, ΔH = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13,1 ± 0,4 kcal / mol, e DeltaG = - 9,16 ± 0,01 kcal / mol. Adatto dei dati utilizzando Sedphat permettersi una n di 0,94 ± 0,01, una d K di 0,195 ± 0,013 ΔM, un ΔH di -22,5 ± 0,2 kcal / mol, TΔS di -13,39 kcal / mol e DeltaG di -9,15 kcal / mol.

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+linked+protonation+effects+in+protein+binding+reactions+using+isothermal+titration+calorimetry.">Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry.</a> Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

ITC è stato ampiamente utilizzato per lo studio delle interazioni macromolecola ligando, 11 con studi sui proteina-ligando, 12 DNA-ligando 13 e RNA-macromolecola 14 studi. ITC può anche essere eseguito con materiali solidi, come nanoparticelle, che formano sospensioni uniforme. 15 Inoltre, i sistemi ternario, dove si ligando è già legato alla macromolecola e un legante secondo è titolato, può essere usato per determinare la termodinamica, ad esempio, il legame del substrato di un enzima-cofattore sistema. 7 studi può essere eseguita anche per molecole con affinità di legame molto alta che normalmente superare il limite di rilevazione del ITC eseguendo saggi di concorrenza vincolante con leganti deboli vincolanti. 16 Informazioni sul debolmente vincolante ligandi possono essere ottenuti anche saggi di concorrenza. 17 Il ruolo dell&#39;acqua nel binding può essere esplorato da ITC, 18 con la dipendenza della entalpia sulla riorganizzazione solvente. 19 Di recente, la termodinamica del cambiamento conformazionale di varianti DNAK sono stati misurati dal legame del ADP e ATP. 20 Proteina-proteina associazione può essere studiato da ITC, ottenendo informazioni sui complessi etero 21 nonché homo-associazione. 22 Effetti della temperatura sulla entalpia vincolante darà la capacità termica della manifestazione vincolanti. 2 Il numero di protoni assorbito o rilasciato dal legame può essere determinata anche da esperimenti eseguiti in buffer con diverse entalpie di ionizzazione. ITC 5 Se studi supplementari sono fatto a valori di pH differenti, allora il pKa del gruppo coinvolti possono potenzialmente essere determinato. 23 Per riassumere, misure accurate della concentrazione della macromolecola e ligando sono indispensabili per un esperimento ITC bene. Concentrazioni del campione devono anche essere in un range corretto per ottenere dati affidabili. Si deve prestare attenzione con il buffer come impurità di piccole molecole e gli squilibri del pH causerà artefatti nel termogramma.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Microprovette 1,7 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 ml provette Falcon </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49B </td></tr><tr><td> 2,5 ml siringa Hamilton </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity

Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è uno strumento utile per comprendere il quadro completo termodinamico di una reazione vincolante. Nelle scienze biologiche, le interazioni macromolecolari sono essenziali per comprendere il meccanismo della cellula. Condizioni sperimentali, come il tampone e la temperatura, può essere adattato al particolare sistema di rilegatura in fase di studio. Tuttavia, un&#39;attenta pianificazione è necessaria in quanto ligando alcuni intervalli di concentrazione macromolecola sono necessari per ottenere dati utili. Concentrazione della macromolecola e ligando devono essere accuratamente determinato per risultati affidabili. Cura deve anche essere presa durante la preparazione dei campioni come impurità possono influenzare significativamente l&#39;esperimento. Quando gli esperimenti ITC, insieme ai controlli, vengono eseguite correttamente, utili informazioni vincolanti, come l&#39;affinità stechiometria e entalpia, si ottengono. L&#39;esecuzione di ulteriori esperimenti con tampone differenti o condizioni di temperatura, informazioni più dettagliate si possono ottenere informazioni sul sistema. Un protocollo per la configurazione di base di un esperimento ITC è dato.

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Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Un protocollo generale per l&#39;uso di calorimetria isotermica di titolazione per monitorare la termodinamica vincolante per i sistemi biologici con moderata affinità di legame è presentato.

Calorimetria isotermica di titolazione di misura macromolecola-ligando di affinità

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

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52.5K Views.  University of Tennessee. Un protocollo generale per l'uso di calorimetria isotermica di titolazione per monitorare la termodinamica vincolante per i sistemi biologici con moderata affinità di legame è presentato.

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Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.

In this video, we demonstrate an alternative method for detection and titering of viruses using an enzymatic antigen detection technique known as an immunoperoxidase assay. Here, we will show you how to collect your viral samples, prepare the cells for testing, and finally the immunoperoxidase assay using serial dilutions to determine the viral titer.

Titolazione del coronavirus umani utilizzando un test immunoperossidasi

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

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Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host macromolecule. ITC has some advantages over common spectroscopic approaches for studying host/ligand interactions. For example, the heat released or absorbed when the two components interact is directly measured and does not require any exogenous reporters. Thus the binding enthalpy and the association constant (Ka) are directly obtained from ITC data, and can be used to compute the entropic contribution. Moreover, the shape of the isotherm is dependent on the c-value and the mechanistic model involved. The c-value is defined as c = n[P]tKa, where [P]t is the protein concentration, and n is the number of ligand binding sites within the host. In many cases, multiple binding sites for a given ligand are non-equivalent and ITC allows the characterization of the thermodynamic binding parameters for each individual binding site. This however requires that the correct binding model be used. This choice can be problematic if different models can fit the same experimental data. We have previously shown that this problem can be circumvented by performing experiments at several c-values. The multiple isotherms obtained at different c-values are fit simultaneously to separate models. The correct model is next identified based on the goodness of fit across the entire variable-c dataset. This process is applied here to the aminoglycoside resistance-causing enzyme aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii). Although our methodology is applicable to any system, the necessity of this strategy is better demonstrated with a macromolecule-ligand system showing allostery or cooperativity, and when different binding models provide essentially identical fits to the same data. To our knowledge, there are no such systems commercially available. AAC(6')-Ii, is a homo-dimer containing two active sites, showing cooperativity between the two subunits. However ITC data obtained at a single c-value can be fit equally well to at least two different models a two-sets-of-sites independent model and a two-site sequential (cooperative) model. Through varying the c-value as explained above, it was established that the correct binding model for AAC(6')-Ii is a two-site sequential binding model. Herein, we describe the steps that must be taken when performing ITC experiments in order to obtain datasets suitable for variable-c analyses.

ITC is a powerful tool for studying the binding of a ligand to its host. In complex systems however, several models may fit the data equally well. The method described here provides a means to elucidate the appropriate binding model for complex systems and extract the corresponding thermodynamic parameters.

Raccolta variabile concentrazione dataset Calorimetria isotermica di titolazione per determinare meccanismi vincolanti

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

Titolazione biochimica di glicogeno<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Un protocollo per Phage Display e affinità selezione con esche proteina ricombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

L&#39;isolamento a base di affinità di Tagged Nuclei di<em&gt; Drosophila</em&gt; tessuti per Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

High-throughput Titolazione della luciferasi che esprimono ricombinanti virus

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree of compositional heterogeneity of a complex do not usually impede progress in conducting such studies. In contrast, a complex intended for structural characterization should be purified in a state that is both compositionally and structurally homogeneous as well as at a higher concentration than required for proteomics. Recently, there have been significant advances in the application of electron microscopy for structure determination of large macromolecular complexes. This has heightened interest in approaches to purify native complexes of sufficient quality and quantity for structural determination by electron microscopy. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been optimized to extract and purify an 18-subunit, ~ 0.8 MDa ribonucleoprotein assembly from budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) suitable for negative stain and electron cryo microscopy. Herein is detailed the modifications made to the TAP method, the rationale for making these changes, and the approaches taken to assay for a compositionally and structurally homogeneous complex.

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

Purificazione di Native Complessi di studio strutturale utilizzando un metodo Tag Tandem Affinity

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between cells, the extracellular matrix, and soluble and non-soluble chemical factors (e.g., chemoattractants). Standard methods for measuring the migration of cells, such as the Boyden chamber assay, work by counting cells on either side of a divider. These techniques are easy to use; however, they offer little geometric modification for different applications. In contrast, microfluidic devices can be used to observe cell migration with customizable concentration gradients of soluble factors1,2. However, methods for making microfluidics based assays can be difficult to learn.
Here, we describe an easy method for creating cell culture chambers to measure cell migration in response to chemical concentration gradients. Our cell migration chamber method can create different linear concentration gradients in order to study cell migration for a variety of applications. This method is relatively easy to use and is typically performed by undergraduate students.
The microchannel chamber was created by placing an acrylic insert in the shape of the final microchannel chamber well into a Petri dish. After this, poly(dimethylsiloxane) (PDMS) was poured on top of the insert. The PDMS was allowed to harden and then the insert was removed. This allowed for the creation of wells in any desired shape or size. Cells may be subsequently added to the microchannel chamber, and soluble agents can be added to one of the wells by soaking an agarose block in the desired agent. The agarose block is added to one of the wells, and time-lapse images can be taken of the microchannel chamber in order to quantify cell migration. Variations to this method can be made for a given application, making this method highly customizable.

This protocol details a customizable method to measure cell migration in response to chemoattractants that may also be used to determine the diffusion rate of a drug out of a polymer matrix.

Una camera per la migrazione delle cellule di misura personalizzabile

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into protein function. Despite the importance of multi-PTM enrichment studies, few studies investigate more than one PTM at a time, due partially to the expenses, time, and large protein quantities required to perform multiple global proteomic analysis of PTMs. The &#34;one-pot&#34; affinity enrichment detailed in this protocol overcomes these barriers by permitting the simultaneous identification and quantification of peptides with lysine residues containing acetylation and succinylation PTMs with low amounts of sample input. The protocol involves preparation of protein lysate from mouse livers of SIRT5 knockout mice, performance of trypsin digestion, enrichment for PTMs, and performance of mass spectrometric analysis using a data-independent acquisition (DIA) workflow. Because this workflow allows for the enrichment of two PTMs from the same sample simultaneously, it provides a practical tool to study PTM crosstalk without requiring large amounts of samples, and it greatly reduces the time required for sample preparation, data acquisition, and analysis. The DIA component of the workflow provides comprehensive PTM-specific information. This is particularly important when studying PTM site localization, as DIA provides comprehensive sets of fragment ions that can be computationally deciphered to differentiate between different PTM localization isoforms.

This workflow describes the performance of time- and cost-efficient enrichment of multiple protein post-translational modifications (PTMs) simultaneously for quantitative global proteomic analysis. The protocol utilizes peptide-level PTM enrichment with multiple conjugated antibodies, followed by data-independent acquisition mass spectrometry analysis to gain biological insights into PTM crosstalk.

Arricchimento simultaneo dell'affinità di due modifiche post-traduzionali per la quantificazione e la localizzazione del sito

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...