Questo protocollo utilizza un approccio semplificato per misurare l'espressione genica delle piante in risposta all'erbivoro degli insetti. Usando foglie staccate isolate nelle piastre di Petri, gli insetti sono più facili da applicare e monitorare durante il periodo relativamente breve di infestazione contribuendo ai dati di espressione genica riproducibili. Questo protocollo può essere adattato a molte interazioni pianta / insetto.
se vengono prese in considerazione osservazioni di base da interi sistemi impiantisi. La natura imprevedibile dell'alimentazione degli insetti può essere impegnativa. Pertanto, una fornitura affidabile di larve correttamente messe in scena e piante sane offre le migliori possibilità di successo.
Visualizzare come dovrebbero apparire e comportarsi piante e insetti sani è fondamentale per ottenere risultati ottimali soprattutto per i ricercatori nuovi nel campo di studio. A dimostrare la procedura con me sarà Frances Perez, biologa molecolare nel laboratorio di miglioramento genetico di frutta e verdura. Per preparare piante di patate da coltura tissutale propagata nodale, ottenere prima le plantlet Kennebec coltivate da materiale di espianto con almeno tre o quattro nodi.
Utilizzare una lama sterile per rimuovere le foglie tagliando i rami vicino allo stelo principale e lasciando circa due millimetri di tessuto di ramo per foglia. Tagliare circa due millimetri sopra e sotto ogni nodo per rimuovere le sezioni nodali dagli steli e disporre le talee nodali in un contenitore sterile di coltura tissutale contenente mezzo di trasferimento nodale con il ramo rivolto verso l'alto. Quindi trasferire le talee nodali in una camera di coltura dei tessuti vegetali per due o tre settimane di crescita a 24 gradi Celsius e un periodo fotografico buio di 16 ore e luce di otto ore.
Per preparare gli insetti per l'alimentazione, ottenere lo stadio larvale desiderato di M.sexta e trasferire una larva in ogni pozzo di un vaso di contenimento appropriato in base alle dimensioni della larva. Crea modelli di posizionamento per ogni punto di tempo di raccolta utilizzando cinque robusti vassoi in grado di contenere un set di sei piastre di Petri di dimensioni appropriato foderate con carta bianca. Traccia un set di sei cerchi usando la piastra di Petri di dimensioni appropriate sulla carta in ogni vassoio ed etichetta un set di cerchi che controllano A, B e C e gli altri infestati A, B e C.Quindi etichetta ogni modello di posizionamento con il tempo di raccolta appropriato.
Successivamente, etichettare un tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri per ogni cerchio nel modello di posizionamento per identificare in modo appropriato la perturbazione, la lettera di replicazione delle piante e il punto di tempo di raccolta. Una volta etichettati tutti i tubi, posizionare un disco di carta da filtro sterile in una piastra di Petri per modello e inumidire i dischi con acqua sterile senza lasciare che la piscina liquida in eccesso in ogni piatto. Quindi posizionare un piatto in ogni cerchio in ogni modello di posizionamento e posizionare tre piante di patate della stessa età e dimensione relativa accanto a ciascun modello di posizionamento.
Per iniziare l'infestazione, utilizzare forbici sterili per rimuovere le prime due foglie abbinate da ogni pianta e posizionare una foglia nella piastra di Petri di controllo e una nella piastra di Petri infestata per ogni pianta il più rapidamente possibile. Quando tutte le foglie sono state posizionate, utilizzare le forcep soft touch per trasferire almeno una larva in ogni piatto infestato il più rapidamente possibile e impostare il timer per il tempo di infestazione desiderato. Osserva l'alimentazione per assicurarti che tutte le larve mangino, sostituendo eventuali larve non nutrite se necessario.
Rimuovere tutte le larve da tutte le foglie alla fine del tempo di infestazione e iniziare il timer per il raccolto. Alla fine di ogni momento di raccolta, trasferire ogni foglia nel tubo corrispondente e far cadere immediatamente il tubo in azoto liquido per congelare il campione fogliare prima dello stoccaggio a meno 80 gradi Celsius fino all'isolamento dell'RNA. Le larve sane accuratamente messe in scena dovrebbero iniziare a nutrirsi immediatamente dopo il posizionamento sulla superficie fogliare e l'alimentazione dovrebbe continuare in modo abbastanza coerente durante il periodo di infestazione.
La larva sul fondo di questa foglia non ha consumato alcun materiale vegetale ed è un esempio di infestazione non riuscita. Queste foglie sono state staccate dalle piante di coltura dei tessuti propagate nodali di due settimane e consumate a velocità e stili di alimentazione diversi per ogni stadio larvale. Sulla base di questi risultati, sono state selezionate le quattro larve instar per valutare ulteriormente i danni alle foglie per piante di patate coltivate in terreno più mature che approssimano più da vicino le piante di patate coltivate sul campo.
In questi studi sull'espressione genica, sono stati identificati due nuovi fattori di trascrizione delle dita di zinco C2H2 che sono robustamente reattivi all'erbivoro M.sexta supportando l'uso di foglie staccate per saggi di infestazione. Ricorda di usare foglie abbinate all'età e alle dimensioni e di stadioe correttamente le larve per ogni esperimento poiché l'uniformità si traduce in dati più riproducibili. I tessuti fogliari possono essere saggiati per le specie reattive dell'ossigeno induttivo dallo stress e i derivati dell'ormone dell'acido jasmonico.
Trascrittami interi, proteoma o studi sul microbioma possono anche essere eseguiti sui tessuti fogliari.
