Questo lavoro è stato sostenuto dalla divisione di ricerca intramurale presso il National Institutes of Health / NHLBI (1ZIAHL006126) ed un Lenfant Biomedica Postdoctoral Fellowship attribuiti a DAL.

1. Preparazione dei materiali necessari per espianto Brains al terzo stadio larvali <ol><li> Preparare gli strumenti necessari per microdissezione. <ol><li> Forge due strumenti di dissezione (un bisturi e un gancio) in primo luogo mettendo un unico perno dissezione in ciascun supporto del perno. Assicurare le spine saldamente a mano o con pinze (Figura 1C). </li><li> Utilizzare un paio di vecchie pinze per piegare un pin dissezione ad un angolo di circa 120 °. Eseguire questa sotto un microscopio da dissezione per garantire che la metà superiore del perno sia piatto quando il supporto del perno è tenuto in mano. Questo strumento sarà utilizzato come un bisturi per tenere premuto o tagliare attraverso il tessuto. </li><li> Utilizzare un paio di vecchie pinze per piegare il secondo perno in un gancio che verrà utilizzato per contenere e raschiare via il tessuto. </li><li> Coprire ogni strumento di dissezione con un puntale per proteggere gli utensili da danneggiamenti. Con cura, strumenti ben formati possono essere utilizzati per la dissezione a tempo indeterminato. Sostituire i perni danneggiati o deformati, se necessario. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Preparare dissezione mezzo. <ol><li> In una cappa di coltura tissutale, diluire il supplemento antibiotico-antimicotico nel mezzo di coltura di Schneider. Agitare il supporto per incorporare il supplemento. </li><li> Preparare diverse aliquote di 5 ml dei media integrati. Conservare tutti i mezzi a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Scaldare una aliquota 5 ml di mezzo integrato a temperatura ambiente. Disegnare il mezzo in una sterile siringa da 5 ml e avvitare un filtro 0,2 micron siringa sterile. </li></ol></li><li> Selezionare larve per la dissezione. Utilizzare una sonda dissezione per selezionare strisciando terzo instar larve come il cervello sarà più facile da sezionare. Optional: deposito di larve su una piastra di agar uva. Nota: Non usare i flaconcini eccessivamente affollati o bottiglie con &quot;cibo umido&quot;, in quanto questi tendono a forzare seconda o prima larve instar a strisciare fuori prematuramente. Nota: alcuni background genetico richiederanno utilizzando larve più giovani. Questo non pregiudica il protocollo, ma non rendono il dissection più difficile. </li></ol> 2. Dissezione del Sistema Nervoso Centrale <ol><li> Su un singolo vetrino, creare due 50 ml piscine di media dissezione caldi separati da circa 3 cm. Una piscina sarà utilizzata per la dissezione lordo e l&#39;altro utilizzato per fini dissezione (Figura 1C). </li><li> Trasferire più larve di una delle gocce media. </li><li> Spostare il vetrino con larve di un microscopio da dissezione. Zoom della piscina contenente le larve tale che le estremità anteriori e posteriori delle larve sono riconoscibili. </li><li> Utilizzare una coppia di pinze per afferrare il mid-regione di un singolo larva. Prendere una seconda coppia di pinze nell&#39;altra mano e afferrare la larva vicino alla stessa regione. Tirare le due coppie di pinze a parte per strappare delicatamente la larva a metà. Ripetere i due passaggi precedenti per tutte le larve sul vetrino. </li><li> Smaltire le metà posteriore del corpo larvale trasferendoli ad un tessuto. </li><li> Zoom in una larva in modo che esimoe mouthhooks anteriori sono chiaramente visibili. Utilizzare entrambe le coppie di pinze per creare una piccola incisione, o tacca, su lati opposti delle mouthhooks larvali tra il terzo toracica e primi gruppi denticle anteriori. </li><li> Afferrare le mouthhooks con la pinza in mano non dominante. Utilizzare le pinze nell&#39;altra mano per staccare delicatamente la cuticola in senso antero-posteriore. Continua a sbucciare lentamente cuticola finché il sistema nervoso centrale è esposto. </li><li> Isolare il sistema nervoso centrale dal resto della larva strappando tessuti con le pinze. Fare attenzione a non disturbare il sistema nervoso centrale. Passaggio critico: Non rimorchiatore sul sistema nervoso centrale! Scartare campioni danneggiati con una corda strappata nervo ventrale (Figura 2A) o lobi distorte ottica (Figure 2B e 2B &#39;). </li><li> Ripetere i due passaggi precedenti per tutte le larve sul vetrino. Trasferire il tessuto espiantato sano allasecondo (pulito) piscina di media sul vetrino per la fase di dissezione multa. </li><li> Utilizzare gli strumenti pin dissezione per eliminare i tessuti periferici (ad esempio, degli occhi, ala, e gambe dischi) dal cervello. Far scorrere il bisturi tra il voluto (cervello) e il tessuto indesiderato, appuntare il tessuto connettivo al coprioggetti. Utilizzare il gancio a stuzzicare delicatamente il tessuto indesiderato contemporaneamente premuto il bisturi per il vetrino movimenti sega-like. </li><li> Passaggio fondamentale: Lavorare lentamente e deliberatamente per rimuovere tutti i dischi da ciascuna cervello. Fare attenzione a non disturbare la morfologia del cervello. Un cervello sano avrà un cordone intatto ventrale dei nervi e simmetrica, lobi ottici rotondi (Figura 2C). </li></ol> 3. Montaggio Brains espiantati per Live Imaging <ol><li> Invertire un piatto di cultura gas-permeabili 50 millimetri con la pellicola trasparente rivolta verso l&#39;alto (Figura 2D). Premere la siringa a depositare una piccola goccia (circa 30 ml) di media su tegli centro del piatto. </li><li> Trasferire il cervello isolato, uno alla volta, la goccia di mezzo sul piatto. Utilizzare lo strumento gancio per raccogliere un cervello sotto i lobi ottici. In alternativa, utilizzare pinze per afferrare assoni sporgenti dal cordone nervoso ventrale. </li><li> Raccogliere 5-10 cervelli nella goccia di medium. Immergere il cervello utilizzando gli strumenti pin dissezione di spingere cervelli individuali al fondo della goccia di mezzo come molti di loro saranno intrappolati al menisco (Figura 2E). </li><li> Orientare il cervello utilizzando gli strumenti pin dissezione per allineare il cervello a seconda della NBs per essere ripreso (Figura 3A). Per l&#39;immagine NBS dorsale, posizionare il cordone nervoso ventrale rivolto verso il basso (lungo la membrana). Per l&#39;immagine NBS antero-ventrale, posizionare il cervello con il cordone nervoso ventrale rivolto verso l&#39;alto (lontano dalla membrana). Allineare i cervelli tale che tutti i cordoni nervosi ventrali puntano nella stessa direzione nel piano xy. </li><li> Utilizzare una siringa o il trasferimento di plastica pipette a posto 4 halocarbon (HC) gocce di olio (circa 30 ml ciascuno) sulla membrana permeabile ai gas. Il volume di ciascuna goccia di olio deve essere equivalenti tra loro e al calo di mezzo. Spazio le gocce di olio corrispondono ai quattro angoli di un coprioggetto centrata intorno alla goccia di mezzo di coltura. Una volta completato, i cinque gocce (quattro gocce di olio e una goccia di mezzo al centro) sarà simile al cinque sfaccettature di stile occidentale dadi (Figura 3B). </li><li> Abbassare un # 1.5 22 millimetri coprioggetto sul gruppo tale che colpisce tutti 5 gocce contemporaneamente. Il mantenimento di una pressione uniforme di tutti i campioni riduce la probabilità che essi saranno interrotti. Attendere circa 3 min come l&#39;olio e mezzo disperdono sotto il peso del coprioggetto. Una forma a croce dei media formerà (Figure 3C e 3D). </li><li> Passaggio fondamentale: Abbassare il vetrino sulla superficie del cervello, eliminando l&#39;eccesso multimediale utilizzando una carta stoppino tessuto (Figuri 3C). Fate questo mentre si guarda il campione nell&#39;ambito di applicazione dissezione. Come supporto viene rimosso, il vetrino si abbasserà. Fermare una volta che il vetrino tocca il cervello. Non esagerare con stoppino in quanto questo causerà distorsioni o tessuti cerebrali esplosioni. </li><li> Se l&#39;imaging dorsale NBs (Figura 3E), passare al punto 3.9. Se immagini NBs antero-ventrale, il vetrino deve essere leggermente spostato (da spingendo delicatamente con una pinza) in direzione delle punte cordone nervoso ventrale. Questo fa sì che il cervello per ruotare, che porta i lobi cerebrali in contatto diretto con il coprioggetto per facilitare l&#39;imaging (Figura 3F). </li><li> Sigillare la camera circondando il vetrino con piccole quantità di olio Halocarbon (Figura 3D). Un eccesso di olio che trasuda dal vetrino dovrebbe essere minimizzato e cancellato via con un fazzoletto di carta. </li></ol> 4. Imaging Live del Central Brain neuroblasti Nota: Per questo lavoro, una filatura disco Nikon Eclipse Timicroscopio confocale (microscopio invertito) è stato utilizzato per l&#39;imaging in tempo reale; dettagli della nostra configurazione precedentemente sono stati pubblicati 31. In alternativa, il campione può essere ripreso con un sistema verticale. <ol><li> Aggiungere una goccia di olio di immersione al vetrino appena sopra i cervelli montati. Ciò contribuirà a centrare l&#39;obiettivo direttamente sopra il campione. </li><li> Passaggio fondamentale: mantenere il cervello ad una temperatura costante di 25 ° C con un incubatore palcoscenico. Posizionare delicatamente il campione montato nell&#39;incubatore palco e coprire la camera con il suo coperchio. </li><li> Individuare NBs cerebrali centrali a luce trasmessa, concentrandosi sui grandi cellule rotonde che si trovano nelle zone centrali e mediali dei lobi ottici, non utilizzare epi-fluorescenza. Questo diventa più facile con la pratica. È molto importante esporre il campione per la minor quantità di luce possibile. Non sprecate il cervello di imaging di tempo che sono danneggiati. </li><li> Una volta sul posto, prendere le esposizioni rapide utilizzando il confocale adeterminare la corretta posizione e la profondità. Limitare profondità al primo 10-15 micron. Regolare, se necessario, e prendere un&#39;altra immagine di prova. <ol><li> Passaggio facoltativo: Raccogliere un filmato di prova del cordone nervoso ventrale per garantire che non vi è alcuna deriva xy. Se viene rilevato deriva, attendere 15-30 minuti per il campione di stabilirsi. Se la deriva non si stabilizza in 30 min, preparare un nuovo campione. Maggiore deriva di solito può essere fatta risalire l&#39;aggiunta di olio in eccesso, o la dimensione ineguale delle gocce d&#39;olio durante il montaggio. </li></ol></li><li> Per eliminare la deriva assiale (z-drift) utilizzano un dispositivo di continua messa a fuoco automatica che utilizza un LED a infrarossi. In alternativa, correggere manualmente il piano focale. </li><li> Una volta che un NB di interesse è identificato, procedere con regime di imaging. Come con tutti cellule vive, la quantità di luce laser, tempo di esposizione, fotocamera binning, ingrandimento dell&#39;obiettivo, tempo e / o l&#39;intervallo di z-passo devono essere tutti empiricamente ottimizzato per un particolare esperimento per rispondere alla domanda in questione. L&#39;obiettivo è di ridurre al minimo diga di luceetà, mentre ancora raccogliendo dati utili. Si veda la discussione per ulteriori indicazioni. <ol><li> Immagine l&#39;intero volume del NB raccogliendo 12-14 immagini intervallate da 1 micron a l&#39;asse z. Regolare la risoluzione temporale per catturare cicli singoli o multipli di cellule della stessa NB. Come regola generale, utilizzare gli intervalli di 10-30 secondi per l&#39;imaging di un singolo ciclo cellulare e 1-3 min intervalli per più cicli cellulari. </li></ol></li><li> Passaggio fondamentale: Verificare che il campione è sano monitorando la durata della mitosi. Se mitosi richiede più di 15 minuti, passare a un altro cervello. Un cervello sano mostrerà molti NBs nello stesso campo visivo subire diversi round di mitosi. Si noti che ogni ciclo cellulare è leggermente più lungo del precedente a causa di danni luce. </li><li> Una volta che l&#39;imaging è completa, smontare la camera di incubazione, ed eliminare tutto, ma i piatti di coltura di gas-permeabili. Sciacquare la superficie cultura piatto con il 95% di etanolo e asciugare bene con un fazzoletto. Ripetere altre due volte. </li&gt; </ol> 5. Preparazione di cervelli per immunofluorescenza <ol><li> Raccogliere 20 o più espiantati cervelli in una provetta da 1,5 ml contenente circa 0,2 ml di mezzo supplementato. </li><li> Rimuovere mezzo dal tubo e risciacquare cervelli una volta con 0,5 ml PBSTx (Phosphate Buffered Saline, PBS con 0,3% Triton X-100). Let cervelli depositano sul fondo della provetta tra tutti gli scambi di liquido. Il detergente Triton X-100 è utilizzato per permeabilize tessuto. Risciacquo in genere richiede meno di 30 secondi; è sufficiente rimuovere il PBSTx volta cervelli si sono stabiliti sul fondo della provetta. </li><li> Sostituire la soluzione con 0,5 ml del 9% elettronica del grado di microscopia paraformaldeide diluito in PBSTx. Incubare con nutazione per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Smaltire fissativo secondo i regolamenti rifiuti pericolosi. </li><li> Lavare i campioni con 0,5 ml PBSTx per 15 min. Ripetere la fase di lavaggio con PBSTx fresco due volte. </li><li> Sostituire la soluzione con 0,5 ml PBT (PBS, 1% Di sieroalbumina bovina (BSA), e lo 0,1% Tween-20). Incubare con nutazione per 1 ora a temperatura ambiente. Questo passo blocca il legame non specifico di anticorpi al tessuto. </li><li> Sostituire la soluzione con 0,5 ml di anticorpo primario diluito in PBT integrato con il 4% siero normale di capra (NGS). Incubare con nutazione notte a 4 ° C. </li><li> Eliminare o salvare l&#39;anticorpo primario diluito. </li><li> Lavare i campioni con 0,5 ml PBT per 15 min. Ripetere la fase di lavaggio con PBT fresco due volte. </li><li> Sostituire la soluzione con 0,5 ml di modifica PBT (PBS, 2% BSA, 0,1% Tween-20, e il 4% NGS). Incubare con nutazione per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Sostituire la soluzione con 0,5 ml di anticorpo secondario diluito in PBT modificati. Incubare con nutazione per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Sostituire la soluzione con 0,5 ml di PBST (PBS con 0,1% di Tween-20). Incubare con nutazione per 15 min a temperatura ambiente. Ripetere la fase di lavaggio con PBST fresco due volte. </li></ol><ol><li> Trasferire accuratamente i campioni come una goccia su un vetrino, limitando la goccia verso la sinistra del centro della diapositiva. </li><li> Aggiungere una goccia (circa 2 cm di diametro) di mezzo di montaggio (per esempio, Aqua-Poly/Mount) al centro della diapositiva. Evitare il pool di PBST che è verso sinistra. </li><li> Usare pinze per trasferire i cervelli dal pool di PBST al pool di mezzo di montaggio. Aggiunta mezzo di montaggio direttamente sopra cervello può interrompere il loro orientamento e deve essere evitato. </li><li> Sotto un microscopio ottico, disporre i campioni nel liquido di montaggio con il lato che verrà ripreso rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Con il vetrino al microscopio luce, abbassare lentamente un bicchiere coprioggetto # 1.5 sulla cima dei campioni. Passaggio facoltativo: Eliminare le bolle d&#39;aria minori esercitando una leggera pressione sul vetrino. </li><li> Lasciare che il mezzo di montaggio per polimerizzare per diverse ore, o durante la notte, mentendo scivoli piatto, light-protetto, a temperatura ambiente. </li><li> I vetrini possono essere ripreso il giorno dopo, o immagazzinato prima di imaging. </li></ol>

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).</li><li>Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+the+model+to+the+test:+are+APC+proteins+essential+for+neuronal+polarity,+axon+outgrowth,+and+axon+targeting.">Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting.</a> J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).</li><li>Lerit, D. A., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLP+inhibits+the+activity+of+interphase+centrosomes+to+ensure+their+proper+segregation+in+stem+cells.">PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells.</a> J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).</li><li>Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+pericentrin-like+protein+is+essential+for+cilia/flagella+function,+but+appears+to+be+dispensable+for+mitosis.">The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis.</a> J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).</li><li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Spd-2+recruits+PCM+to+the+sperm+centriole,+but+is+dispensable+for+centriole+duplication.">Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication.</a> Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).</li><li>Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localisation+of+the+mitotic+POLO+kinase+shows+a+highly+dynamic+association+with+the+mitotic+apparatus+during+early+embryogenesis+in+Drosophila.">In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila.</a> Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).</li><li>Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+is+a+dynamic+structure+that+ejects+PCM+flares.">The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares.</a> J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Imaging cellulare dal vivo è un approccio prezioso utilizzato per studiare i meccanismi che regolano ACD delle cellule staminali, la differenziazione delle linee cellulari, e la morfogenesi dei tessuti complessi. Sebbene gruppi di ricercatori hanno storicamente impiegato una varietà di tecniche per visualizzare NB ACD, questi approcci possono generalmente essere raggruppate in due categorie che differiscono principalmente per quanto riguarda se il tessuto cerebrale è lasciata intatta o dissociata. <p class="jove_...

Le cellule staminali mantenere un equilibrio di differenziazione e di auto-rinnovamento per generare diversità cellulare durante lo sviluppo iniziale e sostituire le cellule danneggiate nei tessuti adulti. Regolamentazione di tale omeostasi impedisce sia la perdita e eccessiva espansione della popolazione di cellule staminali, che può provocare la degenerazione dei tessuti deleterio o tumorigenesi. Neuroblasti (NBS) sono le cellule staminali neurali ampiamente studiati del sistema Drosophila nervoso centrale (Figura 1A), che prima forma durante le fasi embrionali 1, 2. NBs sottoposti a ripetuti cicli di divisione cellulare asimmetrica (ACD) per produrre due cellule inegualmente fatidici: una cellula staminale auto-rinnovare e una cella di differenziazione. ACD è guidata dai centrosomi, gli organelli non membranose che fungono da centri di microtubuli organizzazione della maggior parte delle cellule 3. Durante la mitosi, centrosomi NB organizzano e orientano il fuso mitotico bipolare lungo la polare apicale-basaleAsse lità. Dopo la scissione della divisione NB, determinanti destino apicali che specificano il destino delle cellule staminali, e determinanti destino basali che specificano la differenziazione, sono segregati nelle cellule figlie disuguali. Nel cervello centrale larvale, due tipi di NBs si distinguono per il loro numero, posizione, espressione del fattore di trascrizione, e la linea cellulare (Figura 1A) 4-6. Tipo I NBs sono il più abbondante, e circa 90 di essi popolano i lati anteriore e posteriore di ciascun lobo ottica del cervello 7. Questi NBs esprimono il fattore di trascrizione Asense (Ase), e tipicamente dividono in una auto-rinnovo NB e un ganglio cella più piccola madre (GMC; Figura 1B). Ogni GMC subisce una sola divisione terminale per generare due neuroni o glia (Figura 1B). Al contrario, la Banca nazionale slovacca otto di tipo II che popolano il lato posteriore di ciascun lobo ottico mancano espressione Ase 5. Subiscono ACDper produrre un NB auto-rigenerante e un progenitore neuronale intermedio (INP). Il INP, a sua volta, divide asimmetricamente tre a cinque volte. Ciascuna di queste divisioni risultati nella rigenerazione del INP e la produzione di un singolo GMC 4. Collettivamente, l&#39;identità specifica NB e l&#39;ordine temporale di GMC nascita dà origine alla diversità stupefacente neuronale del sistema nervoso centrale adulto. Capire la biologia cellulare che è alla base NB ACD è stata notevolmente migliorata attraverso l&#39;uso di tecniche di imaging cellulare dal vivo. Protocolli pubblicati utilizzate dai ricercatori per l&#39;immagine NBs dal vivo variano molto. Nel complesso, tuttavia, questi metodi possono essere raggruppate in due categorie generali che si distinguono per se il cervello larvale è lasciata intatta o meccanicamente dissociato. Entrambe le tecniche presentano vantaggi e svantaggi a seconda dell&#39;applicazione del ricercatore. I primi rapporti che rivelano in tempo reale divisione cellulare NBsioni implicano un certo grado di dissociazione manuale del cervello larvale. Questi protocolli dettaglio sbavature 8 o prendere in giro a parte 9 il cervello per crescere colture primarie a breve termine della NBs su vetrini. Per migliorare l&#39;imaging, la Banca nazionale slovacca rotondo di solito sono appiattiti sulle coprioggetto sia con vetrini 8 o pad agarosio 9. Sebbene le cellule appiattite hanno migliorato ottica, queste tecniche spesso portano a difetti mitotici NB, compreso regressione del solco scissione e l&#39;incapacità di dividere più di una volta. Pertanto, i protocolli che coinvolgono sia dissociazione manuale e distorsione fisica del tessuto cerebrale larvale sono generalmente adatti solo a brevissimo termine (cioè., Un ciclo di cella o meno) applicazioni. Allo stesso modo, semi-schiacciamento o appiattire completamente il cervello intatto fra vetrini e vetrini limita il tempo si può trascorrere l&#39;imaging un dato campione, ad un periodo di circa 30 min 10. Nonostante questa limitazione, this approccio è stato utilizzato con successo 11-14. I recenti sforzi di immagine dal vivo dissociate limite NBs distorsione fisica delle cellule isolate. Queste tecniche sono particolarmente utili per applicazioni in cui è necessario sostenere colture cellulari per più cicli di divisione cellulare. Per esempio, le cellule disperse dal cervello dissociate manualmente possono essere parzialmente incorporati in un coagulo ottenuto dalla miscela di fibrinogeno e trombina 15 per l&#39;imaging a lungo termine 16. In alternativa, possono essere espiantati cervelli primo dissociato chimicamente con l&#39;enzima collagenasi, accanto interrotto manualmente ripetuto passaggio attraverso una punta di pipetta, e successivamente placcato su poli-L-lisina rivestite con vetro piatti inferiori 17, 18. Rivestimento piatti di vetro o con fibrinogeno o poli-L-lisina favorisce l&#39;attaccamento e leggero diffusione delle cellule rotonde, portando loro il più vicino al vetrino possibile senza grave distorsione fisica. In additisu, questi metodi comportano coltura NBS in mezzo che può essere facilmente scambiato per esperimenti farmacologici perturbativi 18. Nel complesso, placcatura direttamente dispersi NBs migliora l&#39;ottica delle immagini senza sacrificare la funzionalità di imaging a lungo termine. Recentemente, un protocollo che descrive la coltura a lungo termine di dissociata NBs è stato dettagliato 19. Tuttavia, questo approccio non è privo di limiti. Ci sono diversi avvertimenti all&#39;imaging NBs vivo dissociate. In un campo di cellule disperse, per esempio, è difficile identificare specifici lignaggi NB che sono spazialmente organizzati nel cervello intatto 1. Allo stesso modo, distinguendo il tipo I rispetto al tipo NBs II all&#39;interno del tessuto dissociato è anche una sfida, senza l&#39;espressione di traccianti lignaggio o transgeni specifico sottotipo, come worniu-GAL4, asense-GAL80 20. Sebbene questi transgeni sono molto utili per alcune applicazioni, che limitano ricercatori a quelli transgeni expremuto sotto il controllo dell&#39;elemento UAS enhancer 21 e richiedono regimi genetiche più complesse. Gli studi che riguardano lo sviluppo spaziale o temporale di NBs, quindi, richiedono imaging in vivo nel contesto di un tessuto intatto. Inoltre, studi di NBs embrionali dissociate indicano che il contatto fisico di celle adiacenti è critica per la localizzazione interfase di polarità chiave determinanti 22, 23. Questi studi mostrano completamente isolato NBs mantenere più l&#39;asse mitotico mandrino invariante. Invece, queste cellule mostrano un più randomizzati asse mandrino e ampi angoli di separazione tra gemme successive GMC, forse a causa della perdita di posizionamento apicale centrosome 22. Anche se il rapporto tra i NBs larvali e le loro cellule vicine non è stato ampiamente studiato, vale la pena considerare che il larvale microambiente delle cellule staminali potrebbe ricadere su polarità cellulare o altrocomportamenti. Per mantenere il contesto fisiologico di larve NBs, abbiamo un&#39;immagine ACD da cervelli interi. Dati i limiti intrinseci associati a immagini dissociato NBs, il nostro laboratorio e altri hanno stabilito protocolli per immagine cicli successivi di NB ACD da interi cervelli larvali. Tecniche all&#39;immagine cervello integro spesso sostituiscono la superficie rigida di vetro su un lato della camera di coltura con una membrana flessibile per evitare la distorsione del tessuto o danneggiamento e consentire lo scambio di gas. Alcuni metodi coinvolgono montaggio cervelli espiantati in una miscela di insetto mezzo di coltura, il siero, e acido ascorbico con i corpi grassi isolati da dieci larve 24. I corpi grassi isolati vengono aggiunti perché secernono un mitogeno nota per stimolare la divisione cellulare NB 25. Questo protocollo preserva l&#39;integrità del tessuto per oltre 3 ore ed è, quindi, suscettibili di immagini a lungo termine 24, 26-28. Recentemente, un protocollo che descrive la lonImaging g-termine intatte cervelli larvali in presenza di acido ascorbico, siero, e corpi grassi è stato dettagliato 29. Importante, perché il tessuto non è né esposto né immobilizzato, questo approccio è meno utile per applicazioni in cui viene scambiato medio di coltura (per esempio, studi di droga, immunodeplezione, ecc.). Il nostro laboratorio ha semplificato tutta la preparazione monte di cervelli larvali vivi per l&#39;imaging a lungo termine 30, 31. Il vantaggio principale per il nostro protocollo sugli altri è la sua semplicità: le nostre osservazioni indicano né sierica, acido ascorbico, l&#39;insulina, né corpi grassi sono additivi necessari a immagine cicli successivi di NB ACD. Sebbene additivi, come l&#39;insulina, sono stati utili per l&#39;imaging prolungato di divisioni cellulari staminali 32 e la migrazione delle cellule collettivo in Drosophila ovaie 33, sembrano essere indispensabili per NB ACD, come il nostro mezzo di imaging consiste in una semplice miscela di standard insetto mezzo di coltura cellulare integrato con antibiotico-antimicotico per prevenire la contaminazione. Attraverso l&#39;uso di piatti della cultura di fondo del gas-permeabili o vetro riutilizzabili, siamo stati in grado di sostenere diverse fasi di successivi NB ACD. Gli stessi campioni espiantati facilmente utilizzabile per immunofluorescenza e altre procedure con tessuto fissato. In questo protocollo, si dettaglio la dissezione di cervelli larvali intatte, così come la preparazione di cervello per l&#39;analisi sia vivo e fisso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="851">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">94.6077.410</td>
			<td style="width:167px;">A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Schneider&#39;s S2 Medium</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td>A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider&#39;s S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Glass coverslips, #1.5 22X22 mm</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-541-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Halocarbon oil 700</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8898</td>
			<td>A high viscosity inert oil that is clear and colorless.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26018-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Minutien dissecting pins</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">pair of Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Dissecting needle/probe with plastic handle</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-965-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Syringe filter, 0.22 mm pore size</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Syringe 5 mL&#160;</td>
			<td style="width:185px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">plastic transfer pipet</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S30467-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:380px;">paraformaldehyde, 32% EM-grade</td>
			<td style="width:185px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15714</td>
			<td>CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">DAPI (4&#39;, 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>A dye that labels DNA and is excited by UV light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">18606-20</td>
			<td>A water-soluble mounting medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of drosophila larval neuroblasts

Le cellule staminali si dividono asimmetricamente per generare due cellule progenie con disparità di potenziale destino: una cellula staminale auto-rigenerante e una cellula di differenziazione. Data la loro rilevanza per lo sviluppo e la malattia, la comprensione dei meccanismi che governano la divisione delle cellule staminali asimmetrica è stata una zona robusta di studio. Perché sono geneticamente trattabili e sottoposti a cicli successivi di divisione cellulare circa una volta ogni ora, le cellule staminali del sistema nervoso centrale Drosophila, o neuroblasti, sono modelli indispensabili per lo studio di divisione delle cellule staminali. Circa 100 cellule staminali neurali sono situati vicino alla superficie di ciascuno dei due lobi cerebrali larvali, rendendo questo sistema modello particolarmente utile per studi di microscopia imaging dal vivo. In questo lavoro, passiamo in rassegna diversi approcci ampiamente utilizzati per visualizzare le divisioni di cellule staminali, e ci rivolgiamo i relativi vantaggi e gli svantaggi di queste tecniche che impiegano dissociano contro i tessuti cerebrali intatti. Abbiamo anche il nostro particolare simplifprotocollo IED utilizzato per espiantare cervelli interi da larve terzo instar per l&#39;imaging cellulare dal vivo e applicazioni di analisi fisse.

Immagini dal vivo ha chiarito una serie di meccanismi che regolano NB ACD. Prima di acquisizione delle immagini, è necessario determinare le condizioni ottimali di imaging. È necessario bilanciare la velocità di acquisizione cornice con la durata di cellule vive. Per l&#39;analisi cellulare fine, per esempio, l&#39;aumento temporale e può essere richiesto risoluzione ottica. Quando visualizzare un singolo ciclo cellulare NB (Figura 4A), la velocità con cui le immagini vengono catturate può essere ...

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Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Dettagli Questo protocollo un metodo semplificato utilizzato per condurre cellule vive nel contesto di un cervello larvale intatto. Approcci di imaging cellulare dal vivo hanno un valore inestimabile per lo studio delle divisioni asimmetriche di cellule staminali neurali così come altri processi neurogena e di sviluppo, in coerenza scoprendo i meccanismi che sono stati precedentemente trascurato.

Immagini dal vivo di<em&gt; Drosophila</em&gt; larvali neuroblasti

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

14.7K Views.  National Institutes of Health.  Dettagli Questo protocollo un metodo semplificato utilizzato per condurre cellule vive nel contesto di un cervello larvale intatto. Approcci di imaging cellulare dal vivo hanno un valore inestimabile per lo studio delle divisioni asimmetriche di cellule staminali neurali così come altri processi neurogena e di sviluppo, in coerenza scoprendo i meccanismi che sono stati precedentemente trascurato. 

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Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral line-widths and allows high-resolution spectra to be obtained from extracts, intact cells, cell cultures, and more importantly intact tissue to investigate relationships between metabolites and cellular processes. In vivo HRMAS 1H-MRS studies have yet to be reported in the live fruit fly Drosophila melanogaster. Drosophila, as a simpler genetic organism, allows the multiple biological functions and various evolutionarily conserved signaling pathways to be examined at the whole organism level and it is a useful model for investigating genetics and physiology. To this end, we developed and implemented an in vivo HRMAS 1H-MRS method to investigate live Drosophila at 14.1 T. Here, we outline an HRMAS 1H-MRS protocol for the molecular characterization of Drosophila with a conventional MR spectrometer equipped with an HRMAS probe. This technique is a novel, in vivo, non-destructive Drosophila metabolite measurement approach, which enables the identification of disease biomarkers and thus may contribute to novel therapeutic development.

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

This technique enables the use of high-resolution magic angle spinning proton MR spectroscopy (HRMAS 1H-MRS) for molecular characterization of live Drosophila melanogaster with a conventional 14.1 tesla spectrometer equipped with an HRMAS probe.

Spettroscopia di Risonanza Magnetica dal vivo Drosophila melanogaster Utilizzando Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

Ricerca

Neuroscienze

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualizzazione dei nervi larvali segmentale in 3 Rd Instar Drosophila I preparativi larvali

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Nella visualizzazione in vivo delle vescicole sinaptiche In Drosophila assoni larvali segmentale

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-cellula Imaging di cellule sensoriali Precursore in Organo intatto Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Imaging in diretta degli assoni spinali dopo rizotomia

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissezione e immunoistochimica di larvale, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retine

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Analisi funzionale del circuito di alimentazione larvale in Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Perché Quantificazione Matters: Caratterizzazione dei fenotipi al<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Giunzione neuromuscolare

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Utilizzando canali lineari Agarose per studiare<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamento larvale Crawling

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Macropatch focale registrazioni delle correnti sinaptiche da giunzione neuromuscolare larvale della drosofila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...