이 작품은 DAL에 수여 건강 / NHLBI (1ZIAHL006126)와 Lenfant 생물 의학 박사 학위 취득 후 친교의 국립 연구소의 교내 연구 부문에 의해 지원되었다.

1. 필요한 재료의 제조는 세 번째 탈피 애벌레의 머리를 이식​​편하기 <ol><li> 미세 절제에 필요한 도구를 준비합니다. <ol><li> 먼저 각 핀 홀더에 하나의 해부 핀을 배치하여 두 해부 도구 (메스와 훅)를 위조. 손으로 또는 플라이어 (그림 1C)와 긴밀하게 핀을 고정합니다. </li><li> 약 120 °의 각도로 하나 해부 핀이 구부러 이전 포셉 한 쌍을 사용합니다. 핀 홀더가 손에 개최 될 때 핀의 위쪽 절반이 평평하도록 해부 현미경이 작업을 수행합니다. 이 도구를 누른 상태에서 또는 조직을 통해 슬라이스 메스로 사용됩니다. </li><li> 보유 및 조직을 쳤어요하는 데 사용되는 훅으로 두 번째 핀이 구부러 이전 포셉 한 켤레를 사용합니다. </li><li> 손상 도구를 보호하기 위해 피펫 팁 각 해부 도구를 포함한다. 주의로, 잘 형성된 전통 무기한 해부에 사용될 수있다. 필요에 따라 손상되거나 변형 핀을 교체합니다. </li></ol> &lt;/ 리&gt; <li> 매체를 해부 준비합니다. <ol><li> 조직 문화 후드에서 슈나이더의 배양 배지에 항생제 항진균 보충을 희석. 보충 통합 미디어를 소용돌이 친다. </li><li> 보충 미디어를 여러 번 5 ㎖ 씩 분주을 준비합니다. 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 모든 미디어를 저장합니다. </li><li> 실온으로 보충 매체의 5 ML의 나누어지는을 따뜻하게. 멸균 5 ML의 주사기로 매체를 그리고 멸균 0.2 μm의 주사기 필터를 나사. </li></ol></li><li> 해부 유충을 선택합니다. 뇌 해부하는 것이 가장 쉬운 방법이 될 것으로 크롤링 제 령 유충을 선택 해부 프로브를 사용합니다. 선택 사항 : 포도 한천 접시에 예금 애벌레. 참고 :이 너무 일찍 빠져 나오는 두 번째 또는 첫 번째 령 유충을 강제하는 경향 &quot;젖은 음식,&quot;지나치게 붐비는 유리 병이나 병을 사용하지 마십시오. 참고 : 일부 유전 적 배경이 어린 애벌레를 사용하여 필요로합니다. 이 프로토콜에 영향을주지 않지만, D을 않는다issection 더 어렵습니다. </li></ol> 중추 신경계의 2. 해부 <ol><li> 하나의 유리 슬라이드에서 약 3cm로 구분 따뜻한 해부 미디어의 두 50 ㎖ 풀을 만들 수 있습니다. 하나의 풀 미세 절개 (그림 1C)에 사용되는 총 해부 및 기타에 사용됩니다. </li><li> 미디어 상품의 하나에 여러 유충을 전송합니다. </li><li> 해부 현미경으로 애벌레와 커버 슬립을 이동합니다. 유충의 앞쪽과 뒤쪽 끝이 알 수있는이되도록 애벌레가 들어있는 풀을 확대합니다. </li><li> 하나의 애벌레의 중간 영역을 파악하는 집게의 쌍을 사용합니다. 다른 손에 집게의 두 번째 쌍을 가지고 같은 지역에 가까운 유충을 파악. 부드럽게 절반의 유충을 찢어 떨어져 집게의 두 쌍을 당깁니다. 커버 슬립의 모든 애벌레에 대해 위의 두 단계를 반복합니다. </li><li> 티슈로 전송하여 유충의 몸의 뒤쪽 절반 폐기하십시오. </li><li> 유충을 확대 번째 있도록전자 전방 mouthhooks 명확하게 볼 수 있습니다. 세 번째 흉부 먼저 앞쪽에 작은이 밴드 사이의 애벌레 mouthhooks의 양측에 작은 절개, 또는 노치를 만들 집게의 두 쌍을 사용합니다. </li><li> 비 지배적 인 손에 집게와 mouthhooks을 잡습니다. 부드럽게 전방 - 투 - 뒤 방향으로 표피를 벗겨하는 다른 손에 집게를 사용합니다. 중앙 신경 시스템이 노출 될 때까지 천천히 표피를 벗겨 계속. </li><li> 집게로 조직을 찢어하여 유충의 나머지 부분에서 중추 신경계를 분리합니다. 중앙 신경 시스템을 방해하지 않도록주의하십시오. 중요한 단계 : 중추 신경계에 잡아 당기지 마십시오! 찢어진 복부 신경 코드 (그림 2A) 또는 왜곡 된 광 엽 (叶) (그림 2B와 2B &#39;)에 손상 샘플을 폐기하십시오. </li><li> 커버 슬립의 모든 애벌레에 대해 위의 두 단계를 반복합니다. 에 건강한 외식 조직을 전송미세 해부 단계의 커버 슬립에 매체의 두 번째 (청소) 수영장. </li><li> 뇌에서 말초 조직 (예를 들어, 눈, 날개, 다리 디스크)를 멀리 맑게하기 위하여 해부 핀 도구를 사용합니다. 커버 글라스에 결합 조직을 고정, 원 (뇌)와 원치 않는 조직 사이의 메스를 밀어 넣습니다. 동시에 톱 같은 움직임에 커버 슬립에 메스를 누른 상태에서 부드럽게 원치 않는 조직을 멀리 애타게 후크를 사용합니다. </li><li> 중요한 단계 : 각 뇌에서 모든 디스크를 제거하기 위해 천천히 그리고 신중하게 작업 할 수 있습니다. 뇌의 형태를 방해하지 않도록주의하십시오. 건강한 뇌 손상 복부 신경 코드와 대칭, 둥근 눈 로브 (그림 2C)를해야합니다. </li></ol> 3. 라이브 이미징 두뇌를 외식 마운팅 <ol><li> (그림 2D)을 위로 향하게하여 투명 필름 50mm의 가스 투과성 배양 접시 전환. t에 매체의 작은 방울 (약 30 μL)을 입금 주사기를 우울요리의 그는 센터. </li><li> 접시에 매체의 드롭에 격리 뇌, 한번에 하나씩 전송. 광 엽 (叶) 아래에 머리를 올리다 훅 도구를 사용합니다. 또한, 복부 신경 코드로부터 돌출 축삭을 파악하는 집게를 사용합니다. </li><li> 매체의 드롭 ~ 10 두뇌를 수집합니다. 그들 중 많은 사람들이 같은 매체의 드롭의 맨 아래에 각각의 머리를 밀어 해부 핀 도구를 사용하여 머리를 물속에 메 니스 커스 (그림 2E)에 갇혀됩니다. </li><li> 이미지에 표시 할 NBS (그림 3A)에 따라 머리를 맞 춥니 다 해부 핀 도구를 사용하여 두뇌의 방향을. 이미지 등의 NBS는 (막 따라) 아래로 향하게 복부 신경 코드를 배치합니다. 이미지에 anterio - 복부 NBS는 (멀리 막에서) 위로 향하게 복부 신경 코드로 두뇌를 놓습니다. 모든 복부 신경 코드가 xy 평면 내에서 같은 방향을 가리 키도록 머리를 맞 춥니 다. </li><li> 주사기 또는 플라스틱 전송 (P)을 사용하여ipette 가스 투과 막에 4 할로 카본 (HC) 기름 방울 (약 30 ㎕를 각)을 배치합니다. 오일의 각 방울의 부피는 서로 중간의 드롭에 해당해야한다. 공간의 오일 방울을 배양 배지의 드롭 중심 커버 슬립의 네 모퉁이에 대응. 완료되면, 다섯 방울 (오일의 4 마리와 중심에있는 매체의 한 방울은) 서양 주사위 (그림 3B)의 다섯 가지 측면을 유사합니다. </li><li> 그것은 모두 한 번에 5 방울을 명중하도록 어셈블리에 # 1.5 22mm의 coverslip에 내립니다. 샘플에 걸쳐 일정한 압력을 유지하는 것은 그들이 중단 될 가능성을 줄일 수 있습니다. 석유와 매체가 커버 슬립의 무게 분산으로 약 3 분을 기다립니다. 미디어의 교차와 같은 모양 (그림 3C 및 3D)을 형성 할 것이다. </li><li> 중요한 단계 : 휴지 심지 (Figu를 사용하여 초과 용지를 제거하여 뇌의 표면에 커버 슬립을 낮 춥니 다) 3C를 다시. 해부 범위에서 샘플을 보면서이 작업을 수행합니다. 용지가 제거 될 때, 커버 슬립을 낮출 것이다. 커버 슬립이 두뇌에 접촉되면 중지합니다. 하지에 심지이 조직의 왜곡 또는 뇌 폭발의 원인이됩니다. </li><li> 영상 등의 NBS (그림 3E)는 3.9 단계로 이동합니다. 영상 anterio - 복부 NBS 경우, 커버 슬립이 약간 복부 신경 코드의 끝 방향으로 (부드럽게 집게로 이끌어으로) 이동해야합니다. 이 영상 (그림 3 층)을 용이하게하기 위해 coverslip에 직접 접촉 두뇌 엽 (叶)을 제공 회전하는 두뇌를 발생합니다. </li><li> 할로 카본 오일 (그림 3D) 소량의 커버 슬립을 포위하여 챔버를 밀봉. coverslip을 돌아 다니며 여분의 기름을 최소화하고 조직 멀리 도말되어야한다. </li></ol> 중앙 브레인 Neuroblasts 4. 라이브 영상 참고 :이 작업을 위해, 니콘 이클립스 티 회전 디스크공 초점 현미경 (도립 현미경) 실시간 이미징에 사용되었다; 우리의 설치에 대한 자세한 내용은 이전에 31 발표되었다. 대안 적으로, 샘플은 직립 시스템을 사용하여 이미징 될 수있다. <ol><li> 바로 장착 두뇌 위의 커버 슬립에 침지 기름 한 방울을 추가합니다. 이것은 직접 샘플 위의 목표를 중심에 도움이 될 것입니다. </li><li> 중요한 단계 : 단계 인큐베이터와 25 ° C의 일정한 온도에서 머리를 유지합니다. 조심스럽게 무대 인큐베이터에 탑재 된 샘플의 위치와 뚜껑이있는 챔버를 포함한다. </li><li> 광 엽 (叶)의 중앙과 중간 지역에있는 대형 원형 세포에 초점을 맞춤으로써 전송 된 빛을 사용하여 중앙 뇌 NBS를 찾아, 에피 형광을 사용하지 않습니다. 이 연습 쉬워집니다. 그것은 가능한 한 빛의 최소 금액에 샘플을 노출하는 것이 매우 중요합니다. 손상된 시간 이미징 머리를 낭비하지 마십시오. </li><li> 일단 장소에서, 공 촛점을 위해 사용 빠른 노출을적절한 위치와 깊이를 결정합니다. 제 15 μm의 깊이를 제한합니다. 필요에 따라 조정하고, 다른 테스트 이미지를 촬영. <ol><li> 선택 단계 : 더 XY 드리프트가 없는지 확인하기 위해 복부 신경 코드의 테스트 동영상을 수집합니다. 드리프트가 발견되면 해결하기 위해 샘플에 대한 15 ~ 30 분을 기다립니다. 드리프트는 30 분에 정착하지 않는 경우, 새로운 샘플을 준비하고 있습니다. 주요 드리프트는 일반적으로 여분의 기름을 추가로 다시 추적 할 수 있습니다, 또는 기름의 불평등 크기는 설치시 삭제합니다. </li></ol></li><li> 축 드리프트 (Z-드리프트를) 제거하려면 적외선 LED를 사용하는 연속 자동 초점 장치를 사용합니다. 또한, 수동으로 초점면을 수정합니다. </li><li> 관심 NB가 확인되면, 영상식이 요법을 진행. 모든 살아있는 세포 이미징, 레이저 빛의 양, 노출 시간, 카메라 비닝 (binning), 목표 확대, 시간 및 / 또는 z 단계 간격으로 모두 경험적으로 손에 질문에 대답 할 수있는 특정 실험을 위해 최적화해야합니다. 목표는 빛 댐을 최소화하는 것입니다나이 동안은 여전히​​ 유용한 데이터를 수집. 추가 지침에 대한 설명을 참조하십시오. <ol><li> 이미지 Z 축에서 1 μM로 이격 12-14 이미지를 수집하여 NB의 전체 볼륨. 같은 NB의 하나 또는 여러 개의 세포주기를 캡처하는 시간 해상도를 조정합니다. 일반적인 지침으로, 하나의 세포주기 이미징 및 여러 세포주기 1-3 분 간격으로 10 ~ 30 초 간격을 사용합니다. </li></ol></li><li> 중요한 단계 : 시료가 유사 분열의 지속 시간을 모니터링하여 정상인지 확인합니다. 유사 분열은 더 이상 15 분 걸린다면, 다른 두뇌로 이동합니다. 건강한 뇌는 유사 분열의 여러 라운드를 진행 한 시야에서 많은 NBS를 표시합니다. 각각의 세포주기 때문에 가벼운 손상을 약간 더 이전보다 있습니다. </li><li> 촬상이 완료되면, 배양 챔버를 분해하고, 가스 투과성 배양 접시하지만 모든 버린다. 95 % 에탄올로 배양 접시 표면을 씻어 티슈로 잘 닦아냅니다. 두 번 더 반복합니다. </리&gt; </ol> 면역 형광에 대한 두뇌의 5. 준비 <ol><li> 보충 매체의 약 0.2 ML를 포함하는 1.5 ML 튜브에 20 개 이상의 외식 두뇌를 수집합니다. </li><li> 튜브에서 매체를 제거하고 (0.3 % 트리톤 X-100과 인산염 완충 생리 식염수, PBS) 0.5 ㎖ PBSTx 한 번 머리를 헹군다. 뇌가 모든 액체 교류의 튜브의 바닥에 정착하자. 트리톤 X-100 세제는 조직을 투과하는 데 사용됩니다. 일반적으로 세정 미만 30 초 소요; 뇌가 튜브의 바닥에 정착 한 후 단순히 PBSTx를 제거합니다. </li><li> PBSTx에 희석 9 %의 전자 현미경 수준의 파라 포름 알데히드 0.5 ㎖의 솔루션을 교체합니다. 실온에서 15 분 동안 장동에 품어. </li><li> 유해 폐기물 규정에 따라 정착 폐기하십시오. </li><li> 15 분 동안 0.5 ㎖ PBSTx와 샘플을 씻으십시오. 신선한 PBSTx 두 번 더와 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 0.5 ㎖ PBT (PBS, 1 솔루션을 대체% 소 혈청 알부민 (BSA), 0.1 % 트윈 -20). 실온에서 1 시간 동안 장동로 부화. 이 단계는 블록 조직에 항체의 비특이적 결합을. </li><li> 4 % 정상 염소 혈청 (NGS)와 보충 PBT 희석 0.5 ㎖ 차 항체 솔루션을 교체합니다. 4 ℃에서 하룻밤 장동에 품다 </li><li> 희석 된 일차 항체를 폐기 또는 저장합니다. </li><li> 15 분 동안 0.5 ㎖ PBT와 샘플을 씻으십시오. 신선한 PBT 두 번 더와 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 0.5 수정 PBT의 ML (PBS, 2 % BSA, 0.1 % 트윈 20, 4 % NGS)와 솔루션을 교체합니다. 실온에서 1 시간 동안 장동로 부화. </li><li> 수정 PBT로 희석하여 0.5 ㎖ 차 항체 솔루션을 교체합니다. 실온에서 2 시간 동안 장동에 품어. </li><li> (0.1 % 트윈 - (20)와 PBS) 0.5 ㎖ PBST과 솔루션을 교체합니다. 실온에서 15 분 동안 장동에 품어. 신선한 PBST 두 번 더와 세척 단계를 반복합니다. </li></ol><ol><li> 정중 슬라이드의 중심의 왼쪽을 향해 강하를 제한하는, 유리 슬라이드에 방울로 샘플을 전송. </li><li> 슬라이드의 중심에 장착 매체의 굵은 (직경 약 2 ㎝) (예 Aqua-Poly/Mount)를 추가한다. 왼쪽을 향 PBST의 풀을 피하십시오. </li><li> 설치 매체의 풀에 PBST의 풀에서 두뇌를 전송하는 집게를 사용합니다. 뇌의 바로 위에 설치 매체를 추가하면 자신의 방향을 방해 할 수 있습니다 피해야한다. </li><li> 광학 현미경 아래에서 위로 향하게 이미지를 만들면 설치 매체에 샘플을 준비한다. </li><li> 광학 현미경 슬라이드, 천천히 샘플의 상단에 # 1.5 유리 커버 슬립을 낮 춥니 다. 선택 단계 : 가볍게 커버 슬립에 밀어 작은 공기 방울을 제거. </li><li> 설치 매체가 슬라이드를 거짓말로 밤새 몇 시간, 또는 중합 평면, 빛 허용실온에서, 보호. </li><li> 슬라이드 다음날 군데, 또는 이전의 이미지로 저장 될 수있다. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila:+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms.">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125, 2149-2158 (1998).</li><li>Siller, K. H., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lis1/dynactin+regulates+metaphase+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical/basal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila.">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).</li><li>Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+the+model+to+the+test:+are+APC+proteins+essential+for+neuronal+polarity,+axon+outgrowth,+and+axon+targeting.">Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting.</a> J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).</li><li>Lerit, D. A., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLP+inhibits+the+activity+of+interphase+centrosomes+to+ensure+their+proper+segregation+in+stem+cells.">PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells.</a> J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).</li><li>Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+pericentrin-like+protein+is+essential+for+cilia/flagella+function,+but+appears+to+be+dispensable+for+mitosis.">The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis.</a> J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).</li><li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Spd-2+recruits+PCM+to+the+sperm+centriole,+but+is+dispensable+for+centriole+duplication.">Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication.</a> Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).</li><li>Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localisation+of+the+mitotic+POLO+kinase+shows+a+highly+dynamic+association+with+the+mitotic+apparatus+during+early+embryogenesis+in+Drosophila.">In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila.</a> Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).</li><li>Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+is+a+dynamic+structure+that+ejects+PCM+flares.">The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares.</a> J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

라이브 세포 이미징은 줄기 세포의 ACD, 세포 계통의 분화를 조절하는 메커니즘을 연구하는 데 귀중한 방법, 복잡한 조직의 형태 형성이다. 연구 그룹은 역사적 NB ACD를 시각화하는 다양한 기술을 채택하고 있지만, 이러한 방법은 일반적으로 주로 뇌 조직은 그대로 유지 또는 해리되어 있는지 여부에 대하여 다른 두 가지 범주로 분류 될 수있다. 영상은 NBS는 장점을 가지고 해?...

줄기 세포는 초기 발달 동안 세포 다이버 시티를 생성하고 성인 조직에서 손상된 세포를 대체하는 분화의 균형과 자기 갱신을 유지한다. 이 항상성의 규정은 손실과 해로운 조직의 변성 또는 종양이 발생할 수 있습니다 줄기 세포 인구의 이상 팽창을 모두 방지 할 수 있습니다. Neuroblasts (NBS)은 초파리의 중추 신경계 (그림 1A) 배아 단계 1, 2 중 그 첫 번째 양식의 널리 연구 신경 줄기 세포입니다. 자기 갱신 줄기 세포와 분화 세포 : NBS는 두 불평등 운명 세포를 생산하는 비대칭 세포 분열 (ACD)의 반복 라운드를 받고있다. ACD는 중심체, 대부분의 세포 3의 미세 소관 조직 센터의 역할이 아닌 막 세포 기관에 의해 인도된다. 유사 분열 동안, NB의 중심체 구성하고 혀끝 - 기초 극성에 따라 양극 분열 스핀들의 방향을ITY 축. 분할 NB의 분열에, 줄기 세포의 운명을 지정 혀끝의 운명을 결정하고, 차별화를 지정 기초의 운명의 결정은, 불평등 한 딸 세포로 분리된다. 유생 중앙 뇌, NBS 두 종류의 그들의 수, 위치, 전사 인자의 발현 및 세포 계보 (도 1a) 4-6에 의해 구별 될 수있다. I NBS는 가장 풍부한 입력하고 약 90 그들의 두뇌 7의 각 광 엽의 전방 및 후방 측면을 채 웁니다. 이 NBS는 전사 인자 Asense (아세)를 표현하고 그들은 특징적으로 하나의 자기 갱신 NB로 나누어 하나의 작은 신경절 어머니 세포 (GMC, 그림 1B). 각 GMC는 두 개의 신경 세포 나 교세포 (그림 1B)를 생성 할 수있는 하나의 단말기 부문을 겪는다. 반면, 각 광 엽의 후방 측을 채울 여덟 유형 II NBS는 아세 식 5 부족합니다. 그들은 ACD를 받아야하나의 자기 갱신 NB와 하나의 중간 신경 전구 (INP)를 생성한다. INP, 차례로, 비대칭으로 3-5 회 분할한다. INP의 재생 및 단일 GMC (4)의 생산에서 이러한 구분 결과의 각. 공동으로, 특정 NB의 정체성과 GMC의 출생의 시간 순서는 성인 중추 신경계의 신경 세포의 놀라운 다양성에 상승을 제공합니다. NB ACD의 기초가되는 세포 생물학이 크게 라이브 셀 이미징 기술의 사용을 통해 향상되었습니다 이해. 이미지 라이브 NBS를 사용하여 연구자 게시 프로토콜은 매우 다양. 전반적으로, 그러나, 이러한 방법은 유충의 두뇌가 그대로 유지 또는 기계적으로 분해되어 있는지 여부를 구별 두 가지 일반적인 범주로 분류 할 수있다. 두 기술은 연구원의 응용 프로그램에 따라 각각 장단점이 있습니다. 라이브 NB 세포 디비를 공개 초기 보고서sions는 애벌레 뇌의 수동 해리의 어느 정도를 포함한다. 이러한 프로토콜 세부 사항은 8 번짐이나 유리 커버 슬립에 NBS의 단기 차 문화를 성장하기 위해 떨어져 9 뇌를 괴롭 히고. 이미지를 개선하기 위해 라운드 NBS는 일반적으로 유리 슬라이드 8 또는 아가로 오스 패드 (9) 중 하나와 함께 커버 슬립에 평평하게됩니다. 편평 세포 광학을 개선하고 있지만, 이들 기술들은 분열 밭고랑의 회귀 하나 이상의 시간을 나눌 수 없다는 등, NB의 유사 분열 결함으로 이어질. 따라서, 수동 해리 애벌레 뇌 조직의 물리적 변형을 모두 포함하는 프로토콜은 일반적으로 단지 매우 짧은 기간 (예., 하나의 세포주기 이하) 응용 프로그램에 적합합니다. 마찬가지로, 반 부수 또는 완전히 유리 슬라이드와 커버 슬립 사이에 그대로 머리를 평평 하나는 약 30 분 동안 10 주어진 표본 이미징 보낼 수있는 시간을 제한합니다. 이 제한, 생에도 불구하고발 접근법은 성공적 11-14 사용되고있다. 이미지 라이브의 최근 노력은 NBS 제한에게 고립 된 세포의 물리적 왜곡 해리. 이러한 기술은 여러 세포 분열주기를 세포 배양을 유지하기 위해 필요한 애플리케이션에 특히 유용하다. 예를 들어, 수동으로 해리 두뇌에서 분산 된 세포는 부분적 장기 촬상 16 피브리노겐과 트롬빈 (15)의 혼합물로부터 만들어 응고에 내장 될 수있다. 또한, 외식 뇌는 화학적으로 효소 다음 수동으로 피펫 팁을 통해 반복 통과에 의해 방해 콜라, 이후에 폴리-L-라이신 코팅 유리 바닥 요리 (17, 18)에 도금 해리 첫 번째가 될 수 있습니다. 피브리노겐 또는 폴리-L-라이신 하나와 유리 접시를 코팅하는 주요 물리적 왜곡없이 가능한 커버 슬립에 그들을 가까이 가져, 둥근 세포의 확산을 첨부하고 약간을 촉진합니다. 책상 외에도에서에 이러한 방법이 쉽게 약물 섭동 실험 18으로 교환 할 수있다 매체에 NBS를 배양 포함한다. 전반적으로, 직접 도금 NBS 장기 이미징 기능을 희생하지 않고 이미징 광학 향상 분산. 최근, 해리 NBS의 장기간 배양을 기술 프로토콜 (19)을 자세히 설명하고있다. 그러나, 이러한 접근은 그 한계가없는 것은 아니다. 라이브 해리 NBS 이미징 몇 가지주의 사항이 있습니다. 분산 된 세포의 분야에서, 예를 들어, 공간적으로 손상 뇌 일이 구성되어 특정 NB 계통을 식별하는 것이 곤란하다. 마찬가지로, 유형 해리 조직 내 II NBS 대 유형 I를 구분하는 것은 이러한 worniu-GAL4, asense-GAL80 20 계보 추적자 또는 서브 타입 별 도입 유전자의 발현없이도 도전. 이러한 형질 전환 유전자가 일부 응용 프로그램에 매우 유용하지만, 그들은 그 형질 전환 유전자의 예에 연구원을 제한 않는다UAS 인핸서 요소 (21)의 제어하에 가압 유전 복잡한 구조를 필요로하기 때문이다. NBS의 공간 또는 시간 발전을 염려 연구는, 따라서 조직 손상의 문맥에서 생체 내 이미징에 요구한다. 또한, 해리 배아 NBS의 연구는 키 극성의 계면 지역화 22, 23 결정에 인접한 셀의 물리적 접촉이 중요하다는 것을 나타냅니다. 이러한 연구는 완전히 격리 NBS가 더 이상 고정 유사 분열 스핀들 축 유지되지 보여준다. 대신에,이 세포는 아마도 인해 혀끝의 중심체 위치 (22)의 손실을 더 무작위 스핀들 축 연속 GMC 싹을 분리, 넓은 각도를 표시합니다. 유생 NBS와 그 이웃하는 셀 사이의 관계를 광범위하게 연구되지 ​​않았지만, 그것은 유생 줄기 세포 미세 환경은 세포 또는 다른 극성에 충돌 할 수 있음을 고려할 가치가있다행동. 유생 NBS의 생리적 컨텍스트를 유지하기 위하여, 전체 뇌에서 우리 화상 ACD. 영상 해리 NBS와 관련된 제한 사항을 감안할 때, 우리의 실험실과 다른 사람은 전체의 애벌레의 뇌에서 NB ACD의 이미지를 연속 라운드에 프로토콜을 설립했다. 이미지 그대로 뇌에 기술들은 조직의 왜곡이나 손상을 방지하고 가스 교환을 허용하는 유연한 막과 문화 실의 한쪽에 유리의 단단한 표면을 교체합니다. 일부 방법은 곤충 배양 배지, 혈청 및 열 유충 (24)로부터 격리 지방 기관과 아스코르브 산의 혼합물에 외식 뇌 장착 포함한다. 그들은 NB 세포 분열 (25)을 자극하는 것으로 알려진 유사 분열 물질을 분비하기 때문에 격리 된 지방 기관이 추가됩니다. 이 프로토콜은 3 이상의 시간 동안 조직의 무결성을 유지하고 장기간 촬상 24, 26-28 의무, 그러므로,이다. 최근, LON을 기술 프로토콜아스 코르 빈산, 혈청, 지방 기관의 존재 그대로 애벌레 두뇌의 G-기간 이미징은 29 자세히 설명하고있다. 조직이 노출되거나 고정되지도 있기 때문에 중요한 것은,이 방법은 배양 배지를 교환 응용 프로그램에 덜 유용하다 (등 예를 들면, 약물 연구, immunodepletion.). 우리 연구소는 장기 이미징 30, 31 일에 대한 살아있는 애벌레 두뇌의 전체 마운트 준비를 간단하게했다. 다른 사람에 우리의 프로토콜의 주요 장점은 단순하다 : 우리의 관측은 NB ACD의 이미지를 연속 라운드에 필요한 첨가제입니다도 혈청, 아스 코르 빈산, 인슐린, 또는 지방 기관을 나타냅니다. 인슐린 등의 첨가제는, 줄기 세포 분열 (32)와 초파리의 난소 (33) 집단 세포 이동의 장시간 촬영에 유용되어 있지만 우리의 영상 매체는 역의 단순한 혼합물로 구성되어, 그들은, NB ACD 비용 소비로 표시ndard 곤충 세포 배양 배지는 오염을 방지하기 위하여 항생제가 보충 항진균. 재사용 할 수있는 가스 투과성이나 유리 바닥 문화 요리의 사용을 통해, 우리는 연속 NB ACD에 몇 차례를 유지할 수 있었다. 같은 외식 샘플은 쉽게 면역 고정 조직과 다른 절차를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 세부 그대로 애벌레 뇌의 해부뿐만 아니라 라이브 및 고정 모두 분석을위한 두뇌의 준비.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="851">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">94.6077.410</td>
			<td style="width:167px;">A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Schneider&#39;s S2 Medium</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td>A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider&#39;s S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Glass coverslips, #1.5 22X22 mm</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-541-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Halocarbon oil 700</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8898</td>
			<td>A high viscosity inert oil that is clear and colorless.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26018-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Minutien dissecting pins</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">pair of Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Dissecting needle/probe with plastic handle</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-965-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Syringe filter, 0.22 mm pore size</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Syringe 5 mL&#160;</td>
			<td style="width:185px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">plastic transfer pipet</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S30467-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:380px;">paraformaldehyde, 32% EM-grade</td>
			<td style="width:185px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15714</td>
			<td>CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">DAPI (4&#39;, 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>A dye that labels DNA and is excited by UV light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">18606-20</td>
			<td>A water-soluble mounting medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of drosophila larval neuroblasts

자기 갱신 줄기 세포와 분화 세포 : 줄기 세포는 불균등 운명 잠재력이 자손 세포를 생성하는 비대칭으로 나눈다. 비대칭 줄기 세포 분열이 연구의 강력한 지역이었다 지배하는 메커니즘을 이해, 개발 및 질병의 관련성을 감안할 때. 그들은 유 전적으로 다루기 쉬운이며, 대한 시간마다 세포 분열의 연속 라운드를 받아야하기 때문에, 초파리의 중추 신경계, 또는 neuroblasts의 줄기 세포는 줄기 세포 부문의 연구에 필수적인 모델입니다. 약 100 신경줄 기세포는 라이브 영상 현미경 연구를위한 모델 시스템이 특히 유용하게,이 유충 두뇌 돌출부의 각각의 표면 근처에 위치되어있다. 이 작품에서 우리는 널리 줄기 세포의 분열을 시각화하는 데 사용되는 여러 가지 방법을 검토하고, 우리는 상대적으로 장점을 그대로 뇌 조직에 비해 해리 고용한다 그 기술의 단점을 해결합니다. 또한, 우리는 우리의 simplif처음 엔 프로토콜은 라이브 셀 이미징을위한 제 령 애벌레 고정 분석 응용 프로그램에서 전체 두뇌를 이식편하는 데 사용됩니다.

라이브 영상은 NB ACD를 조절 메커니즘의 숫자를 해명했다. 종래 이미지 수집하기 위해서는, 최적의 촬상 조건을 결정하는 것이 필요하다. 이 생균의 촬상 기간과 프레임 캡쳐 율을 양립시킬 필요가있다. 미세 세포 분석을 위해, 예를 들어, 일시적인 증가 및 광학 해상도가 요구 될 수있다. 단일 NB 세포주기 (도 4a)를 시각화하는 경우, 이미지가 캡처되는 속도는 광 손상을 도입하지 않고...

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Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

live-imaging-of-drosophila-larval-neuroblasts

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

14.7K 조회수.  National Institutes of Health.  이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다. 

비디오: Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral line-widths and allows high-resolution spectra to be obtained from extracts, intact cells, cell cultures, and more importantly intact tissue to investigate relationships between metabolites and cellular processes. In vivo HRMAS 1H-MRS studies have yet to be reported in the live fruit fly Drosophila melanogaster. Drosophila, as a simpler genetic organism, allows the multiple biological functions and various evolutionarily conserved signaling pathways to be examined at the whole organism level and it is a useful model for investigating genetics and physiology. To this end, we developed and implemented an in vivo HRMAS 1H-MRS method to investigate live Drosophila at 14.1 T. Here, we outline an HRMAS 1H-MRS protocol for the molecular characterization of Drosophila with a conventional MR spectrometer equipped with an HRMAS probe. This technique is a novel, in vivo, non-destructive Drosophila metabolite measurement approach, which enables the identification of disease biomarkers and thus may contribute to novel therapeutic development.

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

This technique enables the use of high-resolution magic angle spinning proton MR spectroscopy (HRMAS 1H-MRS) for molecular characterization of live Drosophila melanogaster with a conventional 14.1 tesla spectrometer equipped with an HRMAS probe.

라이브의 자기 공명 분광학 Drosophila melanogaster 매직 앵글 스피닝를 사용하여

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

연구

신경과학

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

3 애벌레 Segmental 신경의 시각화 차 Instar Drosophila 애벌레 준비

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Drosophila 애벌레 Segmental Axons 이내 시냅틱 Vesicles의 생체내 시각화에

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Rhizotomy 후 도설 루트 Axons의 라이브 영상

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

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The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

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The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

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Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

선형 아가로 오스 채널을 사용하여 공부하기<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 크롤링 동작

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로에서 시 냅 스 전류의 초점 Macropatch 녹음

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...