Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di avviamento presso l&#39;Università di Pittsburgh e NIH concedere AG028977 a ALF

Panoramica Tradizionalmente vermi transgenici sono stati generati da microinjecting DNA transgene nel C. elegans germinale 1,2,3,4. Anche se di successo, questo approccio richiede attrezzature specializzate e lo sviluppo di esperienza con l&#39;anatomia vite senza fine e la tecnica di microiniezione. Più di recente bombardamento biolistic è stato sviluppato come un approccio alternativo che utilizza rivestite di DNA particelle d&#39;oro per introdurre DNA estraneo nella linea germinale 5,6. Questo approccio richiede investimenti meno tempo in termini di pratica per avere successo. Il bombardamento biolistic di C. elegans per generare vermi transgenici è bassa efficienza a livello del worm individuo così il successo richiede una grande quantità di animali. Questi possono essere coltivate in diversi modi, ma usiamo le piastre uovo per ridurre il lavoro e numero di piatti coinvolti. Il nostro protocollo inizia con la preparazione di piatti uovo e vermi e poi si concentra sul protocollo bombardamento con il Bio-Rad PDS-1000/He sistema epta. Abbiamo adattato il nostro protocollo, in parte dal lavoro di Berezikov et al 7. Con i bombardamenti, il gene unc-119 è in genere utilizzato come marcatore per gli animali transgenici. Ceppi di vite senza fine portando questa mutazione sono gravemente scoordinato e poco movimento, sono losca in apparenza, e non sono in grado di formare le larve dauer 8. Il dauer è uno stadio larvale alternativa che viene utilizzato per ritardare lo sviluppo di un adulto riproduttivo in condizioni avverse, e l&#39;entrata in dauer è regolata da più geni 9. Ceppi diversi portando il gene unc-119 sono disponibili presso il C. elegans Genetics Center (CGC, Minneapolis, MN). L&#39;originale DP38 ceppo (unc-119 (ED3)) comporta anche un estraneo Dauer-formazione costitutivo (daf-c) mutazione che potrebbe influenzare gli esperimenti a valle. Vari laboratori hanno outcrossed questa mutazione, e il ceppo HT1593 è disponibile presso il CGC. Troviamo che gli animali transgenici sono un po &#39;più facili da identificare con il ceppo DP38 e tendono ad utilizzare questo sforzo per la creazione di animali transgenici. Se necessario, utilizziamo HT1593 per outcross i vermi transgenici per rimuovere il daf-c mutazione. Ottenere il DP38 vermi a crescere è uno dei passi più lenti del protocollo in modo da mantenere uno stock di lastre in crescita durante la preparazione del transgeni. Espressione del marcatore unc-119 insieme al gene di interesse permette una facile identificazione degli animali esprimono il transgene sulla base di salvataggio della motilità normale e dimensioni del corpo 5. Il gene unc-119 può essere ottenuto da diverse fonti e vettori usando il DNA genomico unc-119, unc-119 promotore e cDNA, e il DNA genomico per i più piccoli la C. briggsiae gene vengono utilizzati 8,10. Recentemente abbiamo descritto un protocollo semplice per aggiungere un unc-119 cassette a qualsiasi plasmide contenente un gene di resistenza all&#39;ampicillina per ricombinazione omologa 11 e un metodo per modificare fosmids verme per trasportare il gene unc-119 da Cre-lox ricombinazione di generare animali transgenici 12. I plasmidi sono disponibili presso Addgene Inc. (Cambridge, MA). Mentre l&#39;impegno necessario per l&#39;esecuzione di un bombardamento singolo è significativo, ma gestibile, il lavoro aggiuntivo coinvolti nello svolgimento bombardamenti multipli su un singolo giorno è minimo. Di conseguenza, la produzione di routine grappolo di vermi transgenici per ridurre il lavoro necessario per generare ciascuno. 1. Piastra uovo Preparazione Il unc-119 vermi mutanti sono difficili da crescere su piastre NGM standard perché con la loro mobilità ridotta tendono a morire di fame su parti di un piatto, mentre altre parti del piatto contengono ancora il cibo. Piastre uovo risolvere questo problema in quanto lo strato di spessore cibo su piatti d&#39;uovo permette unc-119 vermi a strisciare più facilmente e di assolvere a tutti il piatto 7. Le piastre uovo hanno anche il vantaggio di supportare la crescita di un gran numero di vermi in modo da poche piastre sono necessari 13. Di solito 5 piatti uova sono sufficienti per crescere worm per un bombardamento. La ricetta qui sotto fa circa 50 piastre, ma può essere dimezzata per rendere meno se lo si desidera. Le piastre uovo può diventare facilmente contaminati in modo da utilizzare sia gli antibiotici e farmaci antifungini nei piatti e utilizzare solo uova di prodotti dal trattamento di ipoclorito per la semina delle piastre. 1 ° giorno: <ol><li> Preparare LB (400 ml) in una bottiglia da 500 ml. Autoclave per 20 min. </li><li> Versare ~ 50 10 centimetri piastre NGA con 1 litro SNG con il 2% agar. Noi aggiungiamo nistatina 10 ml per litro e streptomicina a 200 mg / ml 13. </li><li> Crescere una cultura durante la notte 40 mL di OP50-1 a LB con 200 mg / ml streptomicina. Questo ceppo è streptomicina resistente e disponibile da CGC. </li><li> Autoclave una bottiglia di 500 ml pergiorno successivo. </li></ol> 2 ° giorno: <ol><li> Separare i tuorli di 10 uova di gallina nella bottiglia sterile. Usiamo un separatore tuorlo (disponibile nei negozi per la casa, tra cui Target). Shake. </li><li> Portare il volume di 400mL con LB. Scuotere </li><li> Incubare a 60 ° C per 1 ora. </li><li> Raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 40 ml di OP50-1. Scuotere </li><li> Distribuire 5-8 ml di miscela per piastra. </li><li> Lasciare le piastre a stabilirsi a temperatura ambiente per una notte. </li></ol> Giorno 3: <ol><li> Delicatamente versare il liquido rimanente dalle piastre. Lasciare asciugare con coperchi su a temperatura ambiente per una notte. </li></ol> 4 ° giorno: <ol><li> Mettere le piastre in una scatola o sacchetto di plastica e conservare a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. Queste placche sembrano essere OK per l&#39;uso per 1-2 mesi. </li></ol> 2. Semina Piastre Egg <ol><li> Espandere il DP38 vermi 6 centimetri piatti NGA con l&#39;aggiunta di concentrato OP50 alle piastre di recente fame. Per un solo bombardamento, usiamo ~ 6 piatti piccoli semi di 5 piatti all&#39;uovo. Per i bombardamenti più, usiamo le piastre di piccole e invece arricchito di semi 2 piastre peptone prima di seminare le piastre uovo. </li><li> Isolare le uova dal DP38 worm attraverso l&#39;uso di ipoclorito di 13,14. Risospendere le uova in sterili buffer S-basale o M9 13,14. </li><li> Aggiungere le uova (&gt; 10.000 per piastra) per il numero appropriato di piatti all&#39;uovo. Crescono i vermi su piatti d&#39;uovo a 20 ° C per 7-10 giorni da utilizzare per il bombardamento. Le piastre saranno pronti per l&#39;uso una volta che il worm hanno iniziato a cancellare il cibo dalle piastre. Questi piatti sono davvero duri a morire di fame e in crescita per periodi più lunghi migliorerà la resa worm. </li></ol> Bombardamento Prepariamo le riserve auree in anticipo e tenerlo conservato a 4 ° C per l&#39;uso. Sono necessari anche senza macchia e macchiato 10 centimetri piatti NGA. Le piastre senza macchia deve essere versata in anticipo e lasciati asciugare completamente per facilitare l&#39;assorbimento del liquido aggiunto con i vermi. Il giorno del bombardamento, laviamo via i vermi prima poi iniziare a preparare il DNA particelle rivestite d&#39;oro. Poi aggiungiamo i vermi alle piastre senza macchia NGA e finire il lavaggio delle particelle d&#39;oro e di trasferirli al macrocarriers. Particelle d&#39;oro preparazione: <ol><li> Pesare 60 mg di particelle d&#39;oro in un tubo 1.7mL e immergersi nel 70% di etanolo per 15 minuti. Spin brevemente a precipitare le particelle d&#39;oro. </li><li> Lavare 3 volte in acqua sterile e girare per un breve istante per raccogliere l&#39;oro. </li><li> Risospendere l&#39;oro in 1 ml di 50% glicerolo sterile. Questo è l&#39;oro soluzione stock delle particelle e può essere conservato per mesi a 4 ° C. </li></ol> Worms: <ol><li> Float il DP38 vermi fuori i piatti uovo con tampone S-basale o M9 e trasferirli in una provetta da 50mL conica. </li><li> Mantenere i tubi in panchina fino a quando i vermi sono sul fondo. Poi aspirare il tampone e aggiungere nuovi S-basale o M9. Lavare per 2 o 3 volte, fino a esaurimento buffer è relativamente chiaro di detriti. Tenere il worm in questo passaggio fino a quando il rivestimento del DNA è stata completata. </li><li> Aspirare e lasciare circa 2-3 mL di vermi in un tampone per bombardamento. Trasferire in una tavola 10 centimetri senza macchia NGA sul ghiaccio. E &#39;importante ridurre al minimo il volume trasferita come la piastra di NGA dovrà asciugare completamente prima di bombardamento. Assicurarsi di coprire l&#39;intera superficie del piatto con i vermi. </li><li> Lasciare piatto ad asciugare su ghiaccio. Il ghiaccio impedirà i vermi di aggregazione durante l&#39;asciugatura. </li></ol> Questo passaggio è importante: la piastra deve essere asciutto e il worm uniformemente dispersi sul piatto NGA. Mantenere i vermi sul ghiaccio impedisce loro di muoversi sul piatto e aggregando in pile. Preparazione del DNA (per un bombardamento): <ol><li> Mescolare in un tubo 1.7mL: <ul><li> 50μl particelle d&#39;oro. Risospendere accuratamente prima di aggiungere. </li><li> 50μl del DNA (10-15ug). Vediamo poca differenza tra il DNA circolare o lineare. Di solito si usa cartucce midiprep Qiagen per la purificazione del DNA (Qiagen Inc., Valencia, CA). </li><li> 50μl 2.5M CaCl 2. Questa soluzione è stabile per diverse settimane a temperatura ambiente. </li><li> 20μl 0.1M spermidina. La spermidina è instabile in soluzione acquosa. Facciamo aliquote spermidina 70μl e conservare a -20 ° C. Siamo quindi aggiungere 1 ml di acqua a destra prima dell&#39;uso per ottenere una soluzione 0,1 M. Questa soluzione deve essere preparata fresca ogni bombardamento. Di solito vortice le particelle d&#39;oro in un tubo 1.7mL a bassa velocità e quindi aggiungere il CaCl 2, del DNA e spermidina / protamina goccia a goccia, mentre vortex. Per le persone che hanno transfettate con fosfato di calcio questa tecnica è familiare. Abbiamo anche usato al posto di protamina spermidina con ottimi risultati 15. Prepariamo una soluzione fresca (1mg/mL) in acqua e noie 50μl invece del 20μl di spermidina. Se usiamo protamina, di solito incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti invece di mettere sul ghiaccio. Protamina non ha bisogno di essere tenuti congelati ed è una polvere invece di un liquido. </li></ul></li><li> Incubare la miscela in ghiaccio per 30min, e periodicamente mix di tenere le particelle d&#39;oro in sospensione. Poi girare brevemente e aspirare il surnatante. </li><li> Lavare con 300μl etanolo al 70%. Spin brevemente. </li><li> Lavare con 1 ml di etanolo al 100%. Spin brevemente. </li><li> Risospendere in 170μl di etanolo al 100%. </li></ol> Preparazione del macrocarriers: <ol><li> Risciacquare 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) in 2-propanolo. Metterle su una carta assorbente e lasciarli asciugare a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 20μl di DNA / oro miscela al centro di ogni macrocarrier. Assicurati di destra vortex prima pipettaggio per mantenere l&#39;oro in sospensione. </li><li> Lasciate evaporare l&#39;etanolo. </li></ol> 3. Bombardamento Assicurarsi di effettuare un bombardamento vuoto prima dell&#39;esperimento per irrigare elio attraverso il sistema. <ol><li> Accendere la pompa del vuoto e chiudere trappola pompa del vuoto. Noi utilizziamo un olio privo di pompa a vuoto. </li><li> Accendere il serbatoio di elio. Controllare che la pressione è ≥ 2200psi. </li><li> Disco di rottura bagnato (1350 psi) in 2-propanolo, mettendo a mantenere tappo per epta adattatore. </li><li> Vite di adattatore in PDS-1000 il sistema e serrare con la chiave dinamometrica in dotazione. </li><li> Posizionare i 7 macrocarriers nel supporto e farli sedere con lo strumento in dotazione. Poi mettere una schermata di arresto epta e il fondo al titolare. Capovolgere il supporto sul luogo e sul secondo scaffale dall&#39;alto. Il lato d&#39;oro macchiato del macrocarriers deve essere rivolto verso il basso, a questo punto. </li><li> Allineare i fori nella parte superiore del titolare macrocarrier con le prese dell&#39;adattatore epta. </li><li> Posizionare la piastra NGA rivestito con vermi (off coperchio) nel ripiano più basso in camera di bombardamento. </li><li> Aprire completamente il flusso manopola vuoto sul PDS-1000. Premere il pulsante vac camera arriva fino a 26 in Hg. Poi passare a mantenere la posizione per mantenere il vuoto. </li><li> Tenere premuto il pulsante di fuoco fino a rotture del disco. Questo avverrà quando la pressione raggiunge 1350psi. A volte questo richiede 50-20 secondi per verificarsi. Rilasciare il pulsante. </li><li> Rilascio del vuoto da camera (posizione sfiato), e rimuovere la piastra. </li><li> Girare a vuoto e si spegne elio. </li><li> Fuoco più volte fino a quando la linea non contiene elio (elio indicatore dovrebbe segnare 0 psi). </li><li> Spegnere il sistema PDS-1000. </li></ol> Recupero verme dopo bombardamento: <ol><li> Lascia la piastra bombardato a 20 ° C per 20 minuti. </li><li> Galleggiante i vermi dalla piastra con 10 mL di tampone di S-basale o M9. </li><li> Mettere 0,5 ml worm il 20 - 10 cm macchiato piatti NGA. </li><li> Lasciare a 20 ° C di temperatura o una stanza (22-24 ° C) per circa 2 settimane prima di verificare per i vermi in salvo. </li><li> Schermo per i vermi con l&#39;unc-119 (+) fenotipo con un microscopio da dissezione. Il momento ottimale per lo screening è dopo le piastre morti di fame da quando i vermi hanno salvato vantaggio di sopravvivenza per il mancato soccorso vermi. </li><li> Generare una singola linea di ogni tavola 10 cm, che conteneva i vermi in salvo. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Il successo del protocollo per quanto riguarda l&#39;ottenimento di animali transgenici dipende dal transgene particolare. Per promotore: transgeni GFP giornalista che abbiamo ottenuto fino a 20 linee. Un risultato più tipico è di 3-10 righe. Fino al 30% delle linee transgeniche sono linee integrate, ma questo è casuale e ci si esibiranno bombardamenti multipli in un solo giorno, se una linea integrata è particolarmente desiderata.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Bombardamento Biolistic è un metodo semplice per introdurre DNA estraneo in molti organismi, tra cui C. elegans 1,5,6,7,16. Si basa su particelle d&#39;oro che formano un complesso con il DNA in presenza di CaCl 2. Poliammine cationiche, come spermidina, proteggere il DNA dalla degradazione nucleasi in vivo. Dal momento che spermidina è una molecola labile, è importante conservarlo in piccole aliquote a -20 ° C, e fare la giusta soluzione prima di eseguire il bombardamento. Come abbiam...

The volume for a solution in, <a href="http://www.jove.com/video/2090">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation</a>, was incorrect.

Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Gold particles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Inbio gold</td>
<td>BD021</td>
<td>1micron</td>
</tr>
<tr>
<td>Midiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12143</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S4139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td> P4505</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macrocarriers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2335</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PDS-1000/He Hepta System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2257</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rupture disk</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2330</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nystatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>N1638</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptomycin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP</td>
<td>100556</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of transgenic c. elegans by biolistic transformation

Il numero di laboratori che si servono libero nematode C. vita elegans è in rapida crescita. La popolarità di questo modello biologico è attribuita ad un tempo di generazione rapida e breve vita, la manutenzione facile e poco costoso, genoma completamente sequenziato, e vasta gamma di risorse RNAi e animali mutanti. Inoltre, l&#39;analisi della C. elegans genoma ha rivelato una grande somiglianza tra vermi e vertebrati superiori, il che suggerisce che la ricerca di vermi potrebbe essere un&#39;aggiunta importante a studi condotti nei topi tutto o in cellule in coltura. Un aspetto importante della ricerca e worm è la capacità di utilizzare animali transgenici per studiare la localizzazione dei geni e la funzione. Animali transgenici possono essere create sia tramite microiniezione della linea germinale verme o attraverso l&#39;uso di bombardamento biolistic. Bombardamento è una tecnica più nuova ed è meno familiare ad una serie di laboratori. Qui descriviamo un semplice protocollo per generare i vermi transgenici dai bombardamenti biolistic con particelle d&#39;oro con il Bio-Rad sistema PDS-1000. Rispetto a microiniezione del DNA in ermafrodita germinale, questo protocollo ha il vantaggio di non richiedere particolari competenze da parte dell&#39;operatore per quanto riguarda l&#39;identificazione o l&#39;esecuzione di anatomia verme microiniezione. Ulteriori più linee transgeniche sono solitamente ottenuti da un singolo bombardamento. Anche in contrasto con microiniezione, bombardamento biolistic produce animali transgenici con entrambi gli array extracromosomico e transgeni integrato. La possibilità di ottenere integrato linee transgeniche possono evitare l&#39;uso di protocolli mutageno di integrare DNA estraneo. In conclusione, bombardamento biolistic può essere un metodo interessante per la generazione di animali transgenici, soprattutto per gli investigatori non sono interessati a investire il tempo e lo sforzo necessario per diventare abili a microiniezione.

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Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Vermi transgenici sono comunemente utilizzati in<em&gt; C. elegans</em&gt; Ricerca. Descritto è un protocollo semplice, ma efficace, di introdurre transgeni in vermi mediante bombardamento biolistic con DNA particelle rivestite d&#39;oro. Lo sforzo ei risultati del bombardamento reggono bene il confronto con microiniezione per la produzione di animali transgenici.

Generazione di transgenici C. elegans Di Trasformazione Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

generation-of-transgenic-c-elegans-by-biolistic-transformation

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

21.8K Views.  University of Pittsburgh. Vermi transgenici sono comunemente utilizzati in C. elegans Ricerca. Descritto è un protocollo semplice, ma efficace, di introdurre transgeni in vermi mediante bombardamento biolistic con DNA particelle rivestite d'oro. Lo sforzo ei risultati del bombardamento reggono bene il confronto con microiniezione per la produzione di animali transgenici.

Video: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Ricerca

Biologia

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the anatomy and connectivity of its nervous system has been determined from electron micrographs and refined by pharmacological assays. In this video, we describe how two complementary neural stimulants, an acetylcholinesterase inhibitor, called aldicarb, and a gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor antagonist, called pentylenetetrazole (PTZ), may be employed to specifically characterize signaling at C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) and facilitate our understanding of antagonistic neural circuits.
Of 302 C. elegans neurons, nineteen GABAergic D-type motor neurons innervate body wall muscles (BWMs), while four GABAergic neurons, called RMEs, innervate head muscles. Conversely, thirty-nine motor neurons express the excitatory neurotransmitter, acetylcholine (ACh), and antagonize GABA transmission at BWMs to coordinate locomotion. The antagonistic nature of GABAergic and cholinergic motor neurons at body wall NMJs was initially determined by laser ablation and later buttressed by aldicarb exposure. Acute aldicarb exposure results in a time-course or dose-responsive paralysis in wild-type worms. Yet, loss of excitatory ACh transmission confers resistance to aldicarb, as less ACh accumulates at worm NMJs, leading to less stimulation of BWMs. Resistance to aldicarb may be observed with ACh-specific or general synaptic function mutants. Consistent with antagonistic GABA and ACh transmission, loss of GABA transmission, or a failure to negatively regulate ACh release, confers hypersensitivity to aldicarb. Although aldicarb exposure has led to the isolation of numerous worm homologs of neurotransmission genes, aldicarb exposure alone cannot efficiently determine prevailing roles for genes and pathways in specific C. elegans motor neurons. For this purpose, we have introduced a complementary experimental approach, which uses PTZ.
Neurotransmission mutants display clear phenotypes, distinct from aldicarb-induced paralysis, in response to PTZ. Wild-type worms, as well as mutants with specific inabilities to release or receive ACh, do not show apparent sensitivity to PTZ. However, GABA mutants, as well as general synaptic function mutants, display anterior convulsions in a time-course or dose-responsive manner. Mutants that cannot negatively regulate general neurotransmitter release and, thus, secrete excessive amounts of ACh onto BWMs, become paralyzed on PTZ. The PTZ-induced phenotypes of discrete mutant classes indicate that a complementary approach with aldicarb and PTZ exposure paradigms in C. elegans may accelerate our understanding of neurotransmission. Moreover, videos demonstrating how we perform pharmacological assays should establish consistent methods for C. elegans research.

This video demonstrates how to employ two neural stimulants, aldicarb and pentylenetetrazole (PTZ), in complementary ways to study synaptic function in the nematode, C. elegans. This complementary approach may also be used to shed light on evolutionarily conserved mechanisms for modulating neuronal synchrony and has implications for epilepsy and seizures.

Paradigmi per la caratterizzazione farmacologica di C. elegans Mutanti trasmissione sinaptica

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Generazione di DNA / RNA ibrido nel DNA genomico da trasformazione utilizzando RNA contenenti oligonucleotidi

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemiotassi Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un metodo per la coltura embrionale<em&gt; C. elegans</em&gt; Celle

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Antibody colorazione in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso di &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un modello di anossia-fame per ischemia / riperfusione in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

Culturing<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; In axeniche Liquid Media e la creazione di transgeniche Worms da microparticelle Bombardamento

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.