Questo protocollo dimostra l'interruzione meccanica degli elegans marini. In un formato a 96 pozzetti che consente la quantificazione della carica batterica nei singoli vermi. Questa tecnica aumenta la velocità e l'uniformità della rottura meccanica rispetto ai metodi basati su Pasel consentendo ai ricercatori di produrre facilmente set di dati più grandi di misurazioni di singoli vermi di alta qualità.
Questa tecnica coinvolge molte parti mobili ed è facile perdere il posto. Assicurati di avere tutti i materiali, i tubi etichettati, i tamponi e le piastre impostati prima di iniziare. A dimostrare la procedura sarà Megan Taylor, specialista di ricerca del mio laboratorio.
Iniziare risospendendo il campione di vite senza fine in un millilitro di M nove TX zero uno in una provetta da microcentrifuga. Raccogliere i vermi adulti mediante centrifugazione e scartare il surnatante. Utilizzando gli stessi parametri di centrifugazione.
Risciacquare i vermi due volte con un millilitro di M9TX01 e una volta con un millilitro di tampone per vermi M9, per ridurre al minimo i batteri esterni. Quindi, risospendere ogni campione in un millilitro di mezzo S più due x OP50 ucciso dal calore in una provetta di coltura. Incubare i tubi a 25 gradi Celsius per 20-30 minuti per passare i batteri non aderenti dall'intestino.
Dopo l'incubazione, sciacquare i vermi spurgati due volte con un millilitro di M9TX01 freddo e scartare il super natante. Metti i tubi sul ghiaccio per 10 minuti per paralizzare i vermi. Quindi aggiungere un millilitro di tampone per vermi M nine ghiacciato con candeggina non profumata a ciascun tubo.
Incubare i tubi sul ghiaccio per un minimo di 10 minuti per uccidere i batteri esterni. Scartare il tampone di candeggina e riportare i tubi nel ghiaccio per evitare che i vermi. Quindi, aggiungere un millilitro di M9TX01 freddo a ciascun tubo e centrifugare per cinque secondi.
In una mini centrifuga. Riportare i tubi sul ghiaccio e rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio una volta.
Per la permeabilizzazione chimica della cuticola del verme. Trasferire i tubi contenenti i vermi in 20 microlitri di tampone in un rack di tubi a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione SDS/DTT a ciascun campione caldo.
Incubare i tubi per un massimo di otto minuti sulla panchina per abbattere parzialmente la cuticola dei vermi adulti. A questo punto, i vermi moriranno e si depositeranno sul fondo del tubo. Dopo l'incubazione, gettare con cautela il surnatante SDS/DTT.
Quindi, aggiungere un millilitro di M9TX01 a ciascun tubo e centrifugare brevemente per pellettare i vermi. Scartare il surnatante e risospendere i worm in un millilitro di tampone M nove worm con 0,1% Triton x-100. Per prepararsi alla rottura meccanica dei vermi, ottenere una piastra sterile profonda due millilitri fino a 96 pozzetti e un coperchio della piastra in silicone.
Utilizzare una spatola sterile per aggiungere una piccola quantità di carburo di silicone sterile a griglia 36 a ciascun pozzetto in modo tale che la griglia copra a malapena il fondo del pozzetto. Aggiungere 180 microlitri di tampone senza fine M nove a ciascun pozzetto. Etichettare le colonne e le righe e quindi coprire la piastra liberamente con il coperchio della piastra di silicone.
Quindi, trasferire i vermi permeabilizzati in una piccola capsula di Petri con M9TX01 riempito fino a una profondità di un centimetro. Utilizzando un microscopio da dissezione pipetta i singoli vermi in volumi da 20 microlitri e trasferirli nei singoli pozzetti della piastra del pozzetto 96 per espellere eventuali vermi attaccati alla pipetta, aspirare 20 microlitri di M9TX01 da un'area libera della capsula di Petri e rilasciarlo nel piatto. Una volta trasferiti tutti i vermi, coprire la piastra da 96 pozzetti con un foglio di pellicola flessibile per soffitti con il lato posteriore di carta rivolto verso il basso sui pozzetti del campione.
Posizionare leggermente il tappetino in silicone sopra la pellicola flessibile del soffitto senza premere il coperchio verso il basso nei pozzetti. Posizionare la piastra a quattro gradi Celsius per 30-60 minuti per evitare il surriscaldamento durante l'interruzione. Dopo aver raffreddato la piastra, premere saldamente il tappetino in silicone nei pozzetti per sigillarli.
Quindi fissare le piastre nel disgregatore tissutale. Agitare le piastre per un minuto a 30 hertz. Quindi ruotare le piastre di 180 gradi e ripetere l'agitazione per un minuto.
Picchiettare saldamente le piastre sul banco due o tre volte per rimuovere la graniglia dalla pellicola flessibile del soffitto. Centrifugare il set di piastre 2.400 volte G per due minuti per raccogliere i campioni sul fondo dei pozzetti. Quindi rimuovere il coperchio in silicone e rimuovere la pellicola del soffitto.
Per preparare una diluizione seriale decuplicata dei digest del verme, riempire 180 microlitri di un X PBS nelle file da B a D di una piastra da 96 pozzetti. Utilizzando un pipetter multi-pozzetto impostato a 200 microlitri, mescolare lentamente il digest del verme mediante pipettaggio. Trasferire la quantità massima del liquido nella riga A della piastra a 96 pozzetti contenente PBS.
Utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere 20 microlitri dalla fila superiore e erogare nella fila B.Seguito dalla miscelazione. Ripetere questo passaggio per le righe da B a C e quindi per le righe da C a D per ottenere una diluizione di 1000 volte per la quantificazione batterica dei vermi monocolonizzati. Piastra da 10 a 20 microlitri di ogni diluizione su piastre di agar solido.
Per la colonizzazione multi-specie, piastra 100 microlitri di ciascuna diluizione su piastre di agar da 10 centimetri. Utilizzando questo protocollo, è stata osservata un'efficace sanificazione esterna dopo lo sbiancamento superficiale di vermi paralizzati a freddo, come visto dal declino dei batteri esterni nel tampone. Senza influenzare i batteri associati all'intestino.
L'interruzione manuale dei vermi ha portato a una maggiore eterogeneità. La graniglia in carburo di silicone era ideale per la rottura con o senza Tri Andex. Nel metodo dei 96 pozzi, le grandi perle di vetro non erano adatte alla tecnica dei 96 pozzi.
Piccole perle di vetro hanno prodotto risultati coerenti ma hanno intasato il tubo in punta. I vermi colonizzati sullo stesso pool di batteri hanno mostrato un'elevata variazione nel carico intestinale quando osservati per singoli batteri e comunità batteriche multispecie. I vermi colonizzati con batteri che esprimono GFP, hanno mostrato eterogeneità nelle misurazioni dei singoli vermi.
Per questo GFP che esprime ceppo batterico confrontando la colonizzazione di Bristol Len tipo selvatico due vermi. A DAF due mutanti IGF hanno dimostrato che il mutante DAF 16 supporta popolazioni più grandi di batteri, mentre DAF due è resistente alla colonizzazione. Questa eterogeneità era caratteristica e coerente su diverse serie dello stesso esperimento.
È stato riscontrato che il ricampionamento dei dati per simulare i digest in batch altera la distribuzione rispetto ai singoli dati dei worm. Il lotto estrapolato CFU per verme era incentrato sulla media aritmetica dei singoli dati che portavano alla perdita di variazione biologica. Invece di procedere a digerire la candeggina superficiale viva e il risciacquo, i vermi possono essere utilizzati per ulteriori esperimenti.
Il movimento riprenderà rapidamente una volta rimossi i vermi dal freddo.
