Quando studiamo l'invecchiamento e gli elegans di mare, in genere seguiamo una popolazione di animali nel tempo. Questo ci dà un'idea di ciò che quel processo che stai studiando sta facendo nella popolazione in ogni punto temporale, ma non ti dice come il processo sta cambiando nei singoli animali nel tempo. Questi singoli ambienti di coltura animale ci consentono di seguire i cambiamenti dinamici nei processi molecolari e nei processi fisiologici nei singoli animali nel tempo per centinaia di animali in parallelo.
Scopriamo che ci sono due cose principali che possono davvero avere un impatto sulla qualità di questi sistemi di coltura multi-pozzo. Uno è sopra o sotto l'essiccazione dei pozzi e il secondo è la contaminazione. E cerchiamo di notare in tutto il protocollo passaggi specifici in cui è possibile provare a mitigare questi problemi.
A dimostrare il protocollo oggi sarà Emily Gardea. È un tecnico nel mio laboratorio e ha lavorato molto per ottimizzare questo protocollo. Dopo aver preparato tutti i reagenti, mescolare 60 grammi di base PDMS e sei grammi di agente polimerizzante per stampo in una grande barca usa e getta utilizzando una spatola usa e getta.
Mettere la miscela PDMS in una camera sottovuoto per 30 minuti a meno 0,08 Mega Pascal per rimuovere le bolle. Versare e riempire la miscela PDMS in ogni stampo stampato in 3D. Mettere lo stampo riempito e l'eventuale miscela PDMS extra nella camera a vuoto per 25 minuti a meno 0,08 Mega Pascal.
Rimuovere lo stampo riempito dalla camera a vuoto e far scoppiare eventuali bolle rimanenti con una spatola usa e getta. Partendo da un bordo, abbassare lentamente un foglio acrilico piatto sopra lo stampo riempito PDMS. Se si verifica la formazione di bolle, procedere come descritto nel manoscritto.
Posizionare un peso di 2,5 libbre sull'acrilico e posizionare gli stampi ponderati nel forno. Lasciateli curare a 55 gradi Celsius durante la notte. Al termine dell'incubazione, togliere i pesi e gli stampi dal forno.
Quindi, lavorare una lama di rasoio tra l'acrilico e il PDMS polimerizzato Per rompere il sigillo Utilizzando un rasoio o una spatola metallica, allentare con cura i lati del PDMS polimerizzato e rimuoverli dallo stampo. Avvolgere il dispositivo PDMS in un foglio di alluminio. Sigillarlo con nastro adesivo e sterilizzare autoclavando su un ciclo a secco per almeno 15 minuti a 121 gradi Celsius e 15 libbre per pollice quadrato di pressione manometrica.
Per preparare il dispositivo multi-pozzetto, preriscaldare un incubatore da bagno a perline asciutte a 90 gradi Celsius. Scartare un dispositivo multipozzetto autoclavato e tagliare una piccola tacca nell'angolo in alto a destra del dispositivo. Posizionare fino a tre dispositivi non avvolti nel pulitore al plasma con i pozzetti rivolti verso l'alto ed eseguire il pulitore al plasma.
Sterilizzare un singolo vassoio di polistirolo per dispositivo spruzzando l'interno del vassoio con etanolo al 70% e asciugandolo con una salvietta da attività. Rimuovere ciascun dispositivo dal detergente al plasma con una mano guantata e metterlo in un vassoio pulito. Quindi posizionare una bacinella per pipetta monouso da 25 millilitri nell'incubatore da bagno a perline preriscaldato a 90 gradi Celsius.
Prendere un tubo di premiscela LMNGM solidificata per dispositivo da riempire e metterlo in un becher di vetro da 200 millilitri. Rimuovere il tappo e il parafilm e il microonde fino a quando il supporto non si scioglie sufficientemente per versare. Versare la premiscela LMNGM fusa in un altro becher sterile da 200 millilitri.
È possibile combinare più provette in questo becher se viene riempito più di un dispositivo alla volta. Cuocere a microonde la premiscela LMNGM per altri 20 secondi. Se la premiscela inizia a bollire, fermare il microonde e lasciarlo sedimentare.
Rimuovere la premiscela LMNGM fusa dal microonde e raffreddarla a 60 gradi Celsius. Aggiungere i restanti ingredienti LMNGM alla miscela premiscelata e versare il LMNGM fuso nella bacinella da 25 millilitri nel bagno di perline. Riempire i pozzetti del dispositivo utilizzando una pipetta ripetitore multicanale da 200 microlitri.
Impostare il ripetitore per erogare aliquote da 14 microlitri e montare cinque punte per pipette. Caricare le punte con LMNGM fuso ed erogare i primi 14 microlitri nel bacino contenente LMNGM. Muovendosi rapidamente ma con attenzione, erogare 14 microlitri nei pozzetti interni del dispositivo e rifornire il rimanente LMNGM nel bacino poiché l'aliquota finale è in genere inferiore a 14 microlitri.
Quindi, impostare il ripetitore per erogare aliquote di 15 microlitri e riempire l'anello più esterno dei pozzi. Utilizzando una pipetta da 200 microlitri, erogare 200 microlitri di soluzione di solfato di rame nel fossato del dispositivo in ogni angolo. Evitare di riempire eccessivamente il fossato e assicurarsi che il solfato di rame non tocchi la superficie superiore dei pozzi.
Se il solfato di rame non scorre facilmente attraverso l'intero fossato, utilizzare un corto filo di platino per aiutare a rompere la tensione e trascinare il solfato di rame attraverso il fossato. Dopo che il solfato di rame ha attraversato l'intero fossato, rimuovere quanto più solfato di rame possibile utilizzando una pipetta da 200 microlitri o un'aspirazione con un vuoto. Utilizzando una bottiglia di spremitura, aggiungere i cristalli d'acqua negli spazi tra il dispositivo e le pareti del vassoio.
Chiudere il coperchio del vassoio e avvolgere tutti e quattro i lati con un pezzo di Parafilm. Aggiungere altri due pezzi di parafilm per sigillare completamente la piastra. Utilizzando una pipetta ripetitrice, individuare ogni pozzetto con cinque microlitri di batteri concentrati.
Evitare il contatto diretto con la superficie LMNGM. Asciugare i dispositivi utilizzando una scatola di asciugatura personalizzata che può essere costruita a costi minimi utilizzando ventole per case per computer e filtri HEPA. Sotto un ambito di dissezione, ispezionare i pozzi per assicurarsi che tutti i pozzi si siano asciugati correttamente.
Usando un plettro di platino, trasferire gli animali dalle piastre di verme preparate e aggiungere un verme per pozzetto. Aggiungere una goccia di soluzione detergente preparata all'interno del coperchio del vassoio e strofinare con una salvietta fino a quando la soluzione detergente non si è asciugata. Avvolgere il vassoio con tre pezzi di Parafilm come descritto nel manoscritto.
Il prolungamento della durata della vita da daf-2 (RNAi) è bloccato dalla mutazione nulla daf-16. La durata della salute è diminuita anche in presenza di daf-2 (RNAi)La media mobile di tre giorni di attività nel corso della vita è ridotta dal mutante daf-16 e dal daf-2 (RNAi)Viene mostrata la variazione della durata della vita e della durata della salute tra i singoli animali confrontata in termini assoluti o come frazione della durata totale della vita. L'attività cumulativa nel corso della vita dei singoli animali è correlata meglio con la durata della vita rispetto all'attività per i singoli animali in un giorno specifico per tutta la durata della vita.
È importante riempire i pozzetti e aggiungere i vermi il più rapidamente possibile. Altrimenti i pozzi possono asciugarsi e i vermi non sopravviveranno. Questo sistema è compatibile con l'imaging automatizzato che può essere utilizzato per raccogliere dati ad alta produttività come durata della vita, attività e dimensioni o forma del corpo.
