This work received support through Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (subprojects A05 and B05 to S.E.L.) and KFO 155 (subproject 4 to S.E.L.), a Halbach Foundation award to S.E.L. supporting E.W.; a grant from the German Cardiac Society to S.B.; and a DAAD exchange program supporting T.K. as visitor at the University of Maryland. The research leading to these results has received funding from the European Community&#8217;s Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement No. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (to S.E.L.). S.E.L. is a principal investigator of the German Center of Cardiovascular Research (DZHK).

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The authors declare that no conflict of interest exists.

Anche se miociti cardiaci sono stati isolati e studiati per decenni 32, una recente revisione ha concluso che l&#39;alta qualità isolamenti cellulari dei miociti coerenti rimangono impegnativo 27. Ciò riflette i protocolli relativamente complessi per l&#39;isolamento dei miociti cardiaci primari nei confronti di una mancanza di approcci standard comuni, metadati condivisi, e la documentazione di qualità cellulare trasparente. Protocolli di isolamento delle cellule di solito sono personalizzate da singoli gruppi, produrre risultati variabili di cellule isolati, dipende dalle impostazioni individuali del modello (ad esempio, specie, età, coesistenti malattie cardiache), e di solito sono regolati per particolari condizioni sperimentali. Nel contesto del TATS quantitativa studi e protocolli di membrana qui presentati, un livello essenziale di valutazione della qualità e della documentazione riguarda la confocale o SuperResolution microscopio di singole strutture della membrana cellulare inclini a metaboliche e protocolli isolamento variazioni dipendenti, siain AM o VM. È importante sottolineare che, anche se alte rese di ceppi cellulari suggeriscono miociti sana ed intatta, gli investigatori hanno bisogno di documentare e valutare criticamente attentamente ogni singola cella in base a criteri morfologici di superficie e l&#39;integrità della membrana TATS contro il danno non specifico a causa di procedure di isolamento rispetto a specifici cambiamenti dovuti a diversi tipi degli interventi rispetto alle condizioni di controllo. Una variabile importante durante l&#39;isolamento delle cellule cardiache è l&#39;attività specifica di un dato lotto collagenasi. Per selezionare un nuovo lotto di collagenasi, l&#39;attività enzimatica di diversi campioni collagenasi deve essere testato contro l&#39;altro valutando la resa dei miociti cardiaci e di qualità, e secondo le istruzioni del produttore. Idealmente, un nuovo lotto di collagenasi si identifica con l&#39;attività collagenasi simile a precedenti lotti utilizzati con successo (per la valutazione estesa di possibili attività enzimatiche fare riferimento al &quot;strumento di selezione collagenasi molto&quot; nella tabella materiali e metodi). TAken insieme, approcci quantitativi di visualizzazione membrana TATS dipendono criticamente sulla qualità isolamento delle cellule e, viceversa, isolamenti cellule cardiache che portano a danni della membrana non specifica come documentato mediante microscopia TATS dovrebbe attivare revisione critica e correzione delle procedure di isolamento. Dal momento che la qualità di isolamento delle cellule e la visualizzazione della membrana TATS e la quantificazione sono intrinsecamente legate, i protocolli descritti in questo articolo coprono tutti i principali aspetti come strategia di continuo. Un&#39;ulteriore sfida e problema comune di studi cardiaci, danni cellulari e / o perdita di cellule si verificano a causa di interventi metabolicamente compromettenti per esempio, a seguito di infarto miocardico 9, ma devono essere giudicati da possibili danni accidentali ad esempio, a seguito di embolia gassosa inosservato durante l&#39;isolamento delle cellule. Isolamento dei miociti cardiaci da cuori malati può portare a ulteriore, significativa perdita di cellule e una diminuzione dei rendimenti delle celle. Dunque, comparIson del numero totale di isolate cellule intatte tra controllo e cuori malati può essere significativo se l&#39;isolamento e il conteggio delle cellule vengono costantemente applicati attraverso protocolli standardizzati. Di conseguenza, è fondamentale per giudicare l&#39;integrità cellulare attraverso un gruppo di controllo adeguato, che riflette la migliore qualità possibile isolamento delle cellule miociti. È importante sottolineare che la qualità singola cella e microscopia cellulare dal vivo di un sano rispetto malata contro miociti inavvertitamente danneggiati dalla procedura di isolamento può influenzare in modo significativo l&#39;analisi dei tatuaggi reti di membrana. I protocolli qui presentati sottolineano quindi l&#39;integrità e la stabilità dei componenti della membrana fisiologiche durante l&#39;isolamento delle cellule e microscopia di cellule in vivo delle membrane intatte. L&#39;intero flusso di lavoro è concepito come una strategia continua per raggiungere e conservare componenti della membrana TATS intatte mentre escludendo le cellule danneggiate, dal momento che questi esporranno isolamento manufatti membrana dipendenti come tubuli di membrana perturbato, a membranaE blebs e reti tatuaggi alterati erroneamente in condizioni di controllo e di compromettere ulteriormente l&#39;analisi quantitativa. Viceversa, le stesse strategie sono fondamentali per gli studi di intervento con il potenziale di distruggere le membrane Tats, che dipendono criticamente sui controlli confronto fra vero sano contro la vera cellula malata con tatuaggi membrana modifiche. Inoltre, ci rivolgiamo procedure per realizzare l&#39;isolamento tecnicamente molto più impegnativo di cellule AM. Nonostante i progressi e protocolli migliorati, è importante sottolineare che non è banale riprodurre isolamenti cellule di alta qualità di macchine virtuali e ancor meno affidabile per AM. Ciò è dovuto al rendimento complessivo inferiore di cellule AM ​​dove anche piccoli errori o variazioni durante l&#39;isolamento delle cellule può portare al fallimento completo di isolamento cellulare AM, mentre un lieve grado di danno cellulare VM potrebbe essere meno evidente in sospensione cellulare a causa della relativamente alta cella numeri rispetto al mattino. Poiché le cellule AM ​​potrebbero diventare curved dopo l&#39;isolamento, l&#39;analisi attraverso diversi ROI può essere vantaggiosa come indicato sotto passo 4.3. A seguito di una procedura dettagliata di misure di isolamento delle cellule, mettiamo a disposizione un protocollo per la colorazione diretta integrale di membrana e confocale o STED SuperResolution imaging reti tatuaggi sia per VM e AMS. Questi protocolli consentono sia l&#39;analisi quantitativa e la differenziazione di selezionare i componenti delle membrane tatuaggi attraverso i parametri precedentemente stabiliti. Rispetto al VM, l&#39;organizzazione 3D e comportamenti funzionali della rete TATS atriale in AMS sono attualmente meno capito. Le procedure per membrane immagine Tats in cellule viventi (passi da 3.1 a 3.7) sono stati sviluppati con confocale commerciale (Tabella dei materiali / attrezzature) e STED microscopi a fluorescenza misura 9. Per ottimizzare le impostazioni del microscopio per la generazione di immagini a fluorescenza e analisi TATS quantitativa, i seguenti punti sono di importanza generale: <ul><li> Obiettivo </strong&gt; Al fine di risolvere i piccoli dettagli di tatuaggi strutture a membrana, empiricamente testare obiettivo che fornisce la più alta qualità dell&#39;immagine, mentre la messa a fuoco diversi micrometro profondità nella cella. Alcuni microscopi confocale possono funzionare meglio con gli obiettivi d&#39;acqua o glicerolo, in contrasto con l&#39;obiettivo 63X 1.4 NA olio usato qui. Obiettivi con ingrandimento 100X sono utilizzati per SuperResolution STED microscopia, la negoziazione fuori un campo più piccolo di vista per la risoluzione nanometrica 34. </li><li> Eccitazione e Gain Le impostazioni ottimali della potenza di eccitazione e il guadagno del rivelatore dipendono dal percorso ottico del microscopio, le prestazioni del laser, e le proprietà del campione. Idealmente, potenza del laser e del guadagno vengono regolati per sfruttare l&#39;intera gamma del rivelatore, ma evitare la saturazione dell&#39;immagine. Pacchetti software microscopia commerciali in genere forniscono le tabelle di ricerca che visualizzano il limite inferiore e superiore della gamma dinamica. Inoltre, per ridurre al minimo colorante sbiancamento impiegare la più bassa possibile lpotere Aser che offre ancora sufficienti dettagli strutturali di membrana TATS. Inoltre, il potere di eccitazione dovrebbe essere sufficientemente basso per evitare danni foto cumulativo portando a contratture miociti e la morte. </li><li> Pixel Size Utilizzare una dimensione del pixel compatibile con il campionamento di Nyquist, circa la metà della risoluzione ottenuta con le impostazioni date. Per l&#39;imaging confocale una dimensione di pixel di 100 nm x 100 nm è compatibile, che si limita anche lo sbiancamento. Per la microscopia SuperResolution dimensioni dei pixel significativamente più piccole sono usate per esempio, 20 nm x 20 nm per la microscopia STED 9. </li><li> Tempo di sosta Microscopi confocale forniscono una funzione di media. In generale, utilizzare il minor tempo di permanenza dei pixel possibile evitare sbiancamento in combinazione con il valore medio es, linea media ≥ 8 per migliorare il rapporto segnale-rumore rapporto. </li><li> Documentare le impostazioni di Microscopia applicata attraverso meta-dati Una volta che le impostazioni comedettagli delle immagini di strutture a membrana tatuaggi sono stati ottimizzati su un particolare microscopio confocale, cassetta di sicurezza e / o documentare le impostazioni del protocollo (meta-dati). Acquisire tutte le immagini all&#39;interno di un gruppo (o tra) (s) di cellule con lo stesso obiettivo, il potere di eccitazione, il guadagno, la dimensione dei pixel, pixel tempo di sosta, e la funzione media. Condizioni di imaging Pari permettono un confronto diretto e quantificazione all&#39;interno di un gruppo (o tra) (s) delle cellule. </li><li> Per una guida generale e ulteriori dettagli circa i principi e le applicazioni della microscopia confocale fare riferimento al manuale del biologico Microscopia confocale (Pawley JB, 3 ° edizione, 2006, Springer Science + Business Media, LLC). </li></ul> In contrasto con le strategie di analisi diretti qui presentati, precedenti pubblicazioni che descrivono le membrane tatuaggi e correlati alla malattia, i cambiamenti hanno utilizzato letture aggregati regionali di densità T-tubulo come strategia quantitativa 16,17, o strategie regionali indirette sulla base di Fourier trasfanalisi ormazione dei segnali di membrana striati al fine di valutare T-tubulo componente regolarità 7. Al contrario, gli approcci quantitativi qui descritti sono direttamente correlati ai componenti Tats individuali e fornire una serie di parametri aggiuntivi tra cui membrana proprietà di rete e componenti specifici come la percentuale di A-tubuli. Inoltre, la densità di rete TATS può essere quantificato come la lunghezza normalizzata dell&#39;intero scheletro estratta per area ROI. Il numero delle giunzioni triple di tre singoli, componenti tubulari costantemente collegati può essere usato come misura della complessità ramificazione della rete membrana TATS. Notiamo che qualsiasi analisi di componenti più piccoli tatuaggi dipende dalle procedure di colorazione. Nella nostra esperienza, 800 ml di una soluzione di-8-ANEPPS 50 micron sono sufficienti a macchiare le reti Tats completi in un pellet di cellule contenente 50.000 cellule VM 9. Tuttavia, se il pellet cellulare contiene un minor numero di miociti cardiaci, Se i rivelatori di fluorescenza potenti sono disponibili, e se l&#39;imaging confocale della distribuzione complessiva rete TATS piuttosto che piccoli dettagli di membrana e le modifiche quantitative sono di interesse, concentrazioni più basse di tintura può essere utilizzato sulla base di prove empiriche. Infine, una macro software scritto per l&#39;analisi descritto può essere utilizzato per automatizzare le fasi di elaborazione dell&#39;immagine per facilitare l&#39;analisi di insiemi di dati di grandi dimensioni, che è particolarmente utile per il confronto tra i diversi gruppi di trattamento (ad esempio, farmaci), tipi di cellule (ad esempio, AM contro VM ), e gli interventi fisiopatologici (ad esempio, farsa contro infarto del miocardio). Per l&#39;analisi delle immagini delle reti di tatuaggi, la seguente sequenza di passi principio si applica: 1) palla background-sottrazione (4.5.1) per rimuovere variazioni spaziali di intensità di sfondo; 2) miglioramento del contrasto locale (4.5.2).; 3) smoothing immagine (4.5.3); 4) regione statistica fusione (4.5.4); 5) che definisce laSoglia di binarizzazione dell&#39;immagine (4.5.6); e 6) calcolo dei dati scheletro (4.5.8). Un passo fondamentale durante la scheletrizzazione di immagini tatuaggi fluorescenti è l&#39;binarizzazione immagine mostrato nella Figura 6. I passi thresholding associati infine definire quali strutture a membrana veri vengono rilevati a rappresentare i componenti tatuaggi sottostanti rispetto al potenzialmente falsi strutture individuate per errore dal rumore di fondo. Identificazione della soglia corretta per l&#39;analisi delle immagini binaria deve corrispondere con i veri TATS strutture di membrana, che dipende da una (SNR) rapporto sufficientemente elevato segnale-rumore ogni approcci microscopia confocale e SuperResolution. Pertanto, una qualità dell&#39;immagine sufficiente dovrebbe essere stabilito prima e successivamente combinate con giudizio critico di qualità cella individuale, compresa la documentazione per immagini in campo chiaro come indicato. Opzioni alternative per adattare il protocollo di segmentazione delle immagini per una data di uscita e / o grandezza fisica dati microscopiodomande iological includono deconvoluzione delle immagini e altre procedure thresholding come &quot;Otsu&quot; o &quot;Iso-dati&quot;, disponibile come plugin di ImageJ. Indipendentemente dalla procedura di segmentazione finale, consideriamo il confronto tra i dati estratti grezzi e da sovrapposizione immagine un passaggio obbligatorio controllo di qualità. In sintesi, l&#39;integrità morfologica e la membrana dei singoli miociti isolati, sufficiente colorazione delle membrane intracellulari tatuaggi, ottimizzazione dei parametri per l&#39;imaging di fluorescenza, e il controllo di sovrapposizione dei dati scheletro estratti saranno tutti contribuire alla qualità delle immagini tatuaggi fluorescenti e risultati quantitativi. Se si utilizzano le specie più grandi rispetto del mouse per l&#39;isolamento delle cellule, i protocolli possono essere facilmente adattate a seconda dei casi. Per i prossimi specie più grandi, cuori di ratto possono essere cannulati con un ottuso 14 G cannula (diametro esterno 2,1 millimetri) e perfusi a 8 ml / min. Significativamente cuori più anziani o malati possono richiedere dimensioni cannula ancora più grandi. In general, perfusione cardiaca può essere effettuata sia dalla pressione costante ad esempio, utilizzando una colonna di acqua alta 1 m tra serbatoio e aorta o dal flusso costante utilizzando una pompa peristaltica. Per l&#39;isolamento di cellule da piccoli cuori roditori come topi e ratti flusso costante può essere vantaggiosa in quanto collagenasi digestione alla fine distruggere vasi di resistenza coronarici che portano a tassi di perfusione eccessivi di perdite letti navi che saranno controllate in una certa misura dai protocolli di flusso costante. Al contrario, la perfusione pressione costante è vantaggioso se il monitoraggio della portata e corretta incannulazione sono una priorità, che è vantaggioso per i modelli di intervento con comportamenti resistenza vaso sanguigno alterato nonché per la formazione delle procedure di isolamento cellulare. Come indicato sopra, la qualità delle cellule sufficiente è molto importante per studi quantitativi di sistemi a membrana endogeni. Tuttavia, durante la perfusione cardiaca e collagenasi digestione numerosi fattori possono critically influenzano la qualità del isolamento delle cellule, che non dovrebbe mai essere sottovalutato durante l&#39;ottimizzazione di protocollo o di risoluzione dei problemi 27. In particolare, l&#39;attività di un dato lotto di collagenasi deve essere determinato per il tessuto specifico di interesse per esempio, atri o ventricoli prima dell&#39;esecuzione degli studi in buona fede sperimentali per stabilire le condizioni di isolamento deve essere mantenuta per tutto il resto dello studio. Inoltre, la qualità dell&#39;acqua, il pH, la temperatura, l&#39;ottimizzazione e la pulizia del setup perfusione sarà ridurre al minimo il rischio di danni accidentali da contaminanti e emboli, e fattori potenzialmente complementari devono essere monitorati per stabilire condizioni omeostatiche ottimali durante l&#39;isolamento delle cellule. BDM (2,3-butanedione-monoxime), un inibitore reversibile della miosina ATPasi trasversali dei ponti è comunemente usato durante la dissezione dei tessuti e la digestione per sostenere il rilassamento del muscolo cardiaco, che aumenta il rendimento di isolamenti cellulari. Tuttavia, gli investigatori hanno bisogno di to essere consapevoli che BDM può esercitare attività di fosfatasi non specifici che portano a effetti fuori bersaglio ad esempio, l&#39;inibizione della Na + / Ca 2 + correnti di scambio in determinate condizioni 33. Per alcuni esperimenti potrebbe essere vantaggioso sostituire BDM da blebbistatin come soluzione cardioplegic, un inibitore con alta affinità per miosina a concentrazioni micromolari che è, tuttavia, tossici e relativamente costoso e può avere altri effetti off-target. Riposo cardiomiociti sani non devono mostrare alcun contrazioni in assenza di stimolazione elettrica e tali cellule dovrebbero essere esclusi da ulteriori analisi. D&#39;altra parte, la contrazione dei miociti cardiaci e relax in risposta alla stimolazione elettrica a fisiologici extracellulare di Ca 2 + concentrazioni possono essere utilizzati per stabilire il normale comportamento contrattile come misura supplementare per valutare la qualità delle cellule funzionali e / o comportamento anomalo nelle malattie cardiache rispetto ai controlli sani cellule. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; In sintesi, i protocolli per l&#39;isolamento di singole cellule e l&#39;analisi quantitativa delle immagini qui descritto è stato applicato con successo per la microscopia confocale e SuperResolution della rete membrana TATS in VM 9 e 21 AM cellule così come per l&#39;analisi quantitativa di reti microtubuli in miociti cardiaci fissi (dati non mostrati). Queste e future applicazioni dei protocolli possono aprire strade per una serie di questioni sperimentali come la caratterizzazione di membrane tatuaggi a diversi stadi di sviluppo o l&#39;analisi delle proteine ​​di membrana associata o organelli strutture che contattano la rete TATS di esercitare altamente localizzata, segnalazione dominio specifico funzioni nelle cellule AM ​​e VM.

Nelle cellule muscolari striate sane, strutture a membrana tubolari con orientamenti &quot;trasversali&quot; (tubuli T) perpendicolari all&#39;asse delle cellule principali sono abbondanti. Di conseguenza, T-tubuli sono stati caratterizzati da continue estensioni della cellula muscolare principale &quot;laterale&quot; membrana superficiale (sarcolemma), che penetrano profondamente citosol verso il centro della cellula. Il ruolo fisiologico di tubuli T continue con la membrana superficie esterna è l&#39;accoppiamento elettrico rapido di compartimenti intracellulari remoti formate da domini contatto SER organelli tutto il volume relativamente grande cardiaco cellule muscolari per accoppiamento vicinanza nanometrica di tensione attivati ​​tipo L Ca 2 + canali (Cav1.2) verso l&#39;interno corrente (I Ca) attivando recettori ryanodine adiacente (RyR2) SER Ca 2 + release. In miociti ventricolari (VM), i contatti di membrana non continui (&quot;nodi&quot;) tra i domini giunzionale SER e T-tubules sono pensati per controllare migliaia di singoli nanodomini Ca 2 + intracellulare di rilascio in ogni cella 1. Per ogni dominio contatto, le porzioni di membrana giustapposte ciascuno dei T-tubulo e l&#39;(giunzionale) SER periferico sono di circa 15 nm vicini gli uni agli altri, quindi definiti come nanodomain. In tal modo, molto piccoli singoli sottospazi citoplasmatici vengono separati che consentono comportamenti vano cella-autonoma quasi. Quando un potenziale d&#39;azione in arrivo attiva i canali Cav1.2 nel T-tubuli di macchine virtuali, una relativamente piccola Ca 2 + verso l&#39;interno corrente aumenterà rapidamente il sottospazio Ca 2 + concentrazione [Ca 2 +] S nel nanodomain dimensioni attoliter 1. Accanto, la S aumento [2 + Ca] attiva Ca 2 + -gated recettori rianodinici (RyR2) in prossimità nanometri nella giunzione membrana SER giustapposti, e questo processo di accoppiamento si verifica in tutta coppia elettricamented nanodomini miociti. RyR2s si verificano come densi cluster multi-canale con una stechiometria stimato di 1 canale Cav1.2 per 5-10 canali RyR2 2. Dal momento che il SER-to-citosol [Ca 2 +] pendenza è molto ripida (rapporto 10 4: 1) e RyR2s Funzione come ad alta conduttanza canali Ca 2 + rilascio in ammassi funzionalmente accoppiati, RyR2 risultati attivazione di un grande quantitativo di Ca 2 + rilasciare corrente da T-tubulari accoppiati domini SER giunzionali crescenti sottospazio locale [Ca 2 +] S a 100 micron o superiore in 1-2 msec 3,4. Questo cardiaco comportamento amplificazione del segnale è indicato anche come Ca 2 + indotto da Ca 2 + rilascio (CICR). Nel loro insieme, T-tubuli sono strutture di membrana essenziali che attivano rapidamente Ca 2 + segnali di rilascio attraverso giunzionali contatti nanodomain SER e livello cellulare CICR ​​durante l&#39;eccitazione-contrazione (EC) di accoppiamento. Oltre ai tubuli T, tubulo assiales (A-tubuli) con una significativamente diverso orientamento parallelo alle principali (longitudinale) Asse cellulari sono stati documentati mediante microscopia elettronica (EM), confocale e studi di microscopia a 2 fotoni. Ad esempio, un reticolo continuo a livello delle cellule di A-tubuli tra miofibrille interconnessi con T-tubuli vicino Z-linee sarcomero è stato dimostrato da traccianti extracellulari e EM imaging cavia fisso VM 5. Utilizzando extracellulare destrano-linked fluoresceina colorazione e vivere 2-Photon Imaging di ratto macchine virtuali, una reticolare complessa rete tubulo 3D è stato visualizzato costituito da ~ 60% di T-tubuli e ~ 40% A-tubuli 6. Questo studio non solo ha portato alla visualizzazione 3D di abbondanti A-tubuli, ma anche alla realizzazione che di sezionamento per la visualizzazione EM è intrinsecamente limitato per l&#39;analisi di reti di membrana complessi e dinamici come il sistema tubulo trasverso-assiale (TATS). Di conseguenza, confocale imaging cellulare dal vivo di membrane tatuaggi direttamente macchiato di di-8-ANNEPS è stato sviluppato. Se il cellulare dal vivoReti Tats sono analizzati da Fourier trasformazione, l&#39;aspetto regolare dei componenti T-tubulo nello spazio vicino Z-linee sarcomero si riflette lo spettro di potenza insieme da una regione di segnali striati 7. Questa strategia di analisi indiretta è stata utilizzata per rilevare le modifiche regionali a livello di cellulari in TATS componente regolarità in modelli di malattia 7. Ad esempio, shRNA mediata junctophilin-2 knock-down ha causato insufficienza cardiaca e la carenza di proteina specifica isoforma portato a T-tubulo riorganizzazione con nanodomain Ca 2 + rilascio disfunzioni 8. Abbiamo recentemente esteso l&#39;analisi delle reti di membrana tatuaggi attraverso approcci quantitativi diretti e oltre, dal vivo al microscopio SuperResolution cella di componenti tatuaggi individuali in topo macchine virtuali utilizzando deplezione emissione stimolata (STED) nanoscopia 9. Risoluzione nanometrica consentito per l&#39;analisi diretta dei componenti tatuaggi individuale più piccoli, che approssimano la distribuzione delle 50:50 trasversalirispetto orientamenti tubuli assiali, quantitativamente confermando ancora due differenzialmente orientati componenti tatuaggi individuali abbondanti nei cuori sani topo 9. Tali strategie saranno ulteriormente illustrate nella sezione del protocollo di seguito. Mentre il ruolo fisiologico delle abbondanti componenti A-tubulari nel cuore adulto è rimasto enigmatico, studi EM hanno documentato strutture a membrana SER connessi con A-tubuli suggerendo endogena Ca 2 + nanodomini rilascio di cavia e nel ratto VM 5,10. Analisi confocale di Cav1.2 e RyR2 trovato un alto grado di colocalization agli incroci A-tubulo 10. Poiché ~ 20% dei spontanee Ca 2 + scintille nel ratto VM avuto origine relativamente lontano da striature Z-linea, dove in genere si verificano T-tubuli, un argomento è stato che nanodomini A-tubulo associati possono effettivamente esistere e funzionare come Ca 2 + siti di rilascio 11,12. È interessante notare che, la formazione di T-tubuli e la maturazione occagnacci solo dopo la nascita e paralleli la crescita delle cellule cardiache, per esempio, attraverso la germinazione di invaginazioni precursore sarcolemma a P5 e immaturo ramificati assemblee rete TATS a P10 nei topi 13. Sembra che Junctophilin-2 è particolarmente importante per la maturazione postnatale rete TATS dal shRNA knock-down impedito l&#39;ancoraggio delle membrane T-tubuli per giunzioni SER conduce al ritardato rilascio di Ca 2 + e organizzazione TATS patologica coerente con architetture immaturo A-tubulo dominato in VM 13. Queste osservazioni possono sfociare proof-of-concept che T-tubuli formano attraverso processi di invaginazione considerando che un tubuli possono trasformarsi attraverso ulteriori o addirittura alternative meccanismi intracellulari 14. Caratterizzazione dei tatuaggi variazioni di membrana nella malattia di cuore è diventato un settore importante della ricerca per le domande fisiopatologiche. I primi rapporti in un modello canino di stimolazione indotta cuore failure ha mostrato una perdita di T-tubuli e attuale Cav1.2 (I Ca) 15. Un modello suino di cardiomiopatia ischemica ha mostrato una riduzione di densità T-tubulo e una sincronia ridotta intracellulare di Ca 2 + rilascio 16. Utilizzando un ratto spontaneamente ipertesi (SHR) modello di scompenso cardiaco, una perdita di T-tubuli è stata associata con una ridotta accoppiamento nanodomain di Cav1.2 e RyR2 dal meccanismo proposto di &quot;RyR2 orfano&quot; 7. Una perdita di T-tubuli è stato dimostrato anche in macchine virtuali umana dal ischemici, dilatati, e ipertrofiche campioni cardiomiopatia 17. Inoltre, un aumento di A-tubuli è stato segnalato in sezioni di tessuto di cardiomiopatia dilatativa umana 18. A seguito di infarto miocardico, abbiamo mostrato un meccanismo differenziale di TATS riorganizzazione del mouse VM con diminuzioni significative di T-tubuli in contrasto con incrementi di componenti A-tubulo 9. È importante sottolineare che, migliorato il contrasto locale di membrana ottenuta attraverso superre cellule vivesoluzione microscopia STED abilitato dettagliata analisi componente quantitativa attraverso misure dirette, che hanno mostrato la proliferazione significativa degli A-tubuli con aumenti globali della lunghezza della rete TATS e ramificazione complessità 9. Inoltre, è stato dimostrato che l&#39;esercizio fisico può invertire T-tubulo rimodellamento nei ratti dopo infarto miocardico 19 e che la terapia di risincronizzazione cardiaca può portare ad invertire il rimodellamento di T-tubuli in cani con tachypacing atriale indotta insufficienza cardiaca 20. Nel loro insieme, gli studi sia in potenziali interventi terapeutici umana e animale malato macchine virtuali così come potranno probabilmente beneficiare di procedure di isolamento delle cellule di alta qualità e strategie di analisi quantitativi dettagliati, come indicato nel protocollo e risultati sezioni di seguito. Inoltre, come dimostrato recentemente dalla superficie laterale rispetto TATS traffico di membrana del canale KATP isoforme 21, è importante considerare m atrialeyocytes (AMS) come biologicamente distinti, nonché comparativa modello di cellule cardiache rispetto a macchine virtuali. T-tubuli sono state recentemente documentate negli ovini e umano AM 22. L&#39;evidenza attuale suggerisce che esistono pochi tubuli T in cellule AM e in genere nei mammiferi più grandi come le pecore e gli esseri umani, ma non nei piccoli roditori 23. A differenza di macchine virtuali, in AMS rilascio intracellulare di Ca 2 + sembra verificarsi dalla propagazione superficie cellulare per diffusione verso il centro della cellula, che si traduce in contrassegnato Ca spaziale e temporale 2+ gradienti 23. In questo quadro mi sembra importante chiarire i meccanismi di Ca 2 + intracellulare di segnalazione di instabilità per le forme di malattie comuni come la fibrillazione atriale 24. In sintesi, sia AM e VM isolamento delle cellule e ciascuno per i cuori sani e malati sono comunemente impiegati protocolli. Solo se l&#39;isolamento delle cellule è fatto correttamente, come giudicato da documentazione microscopica di cellule sufficiente qualità, AM e VM campioni devono essere carried avanti per l&#39;analisi quantitativa TATS. Di conseguenza, le sezioni seguenti protocolli sono criticamente dipendenti da cellule di alta qualità isolati da mouse o altre specie seguite da microscopio cellule in vivo per analizzare membrane Tats intatte. Come sottolineato in precedenza, la caratterizzazione delle membrane Tats è un&#39;area di ricerca impegnativo con una propensione per il fissaggio e la preparazione di manufatti 6, cambiamenti di membrana a causa di alterazioni osmotiche, e le limitazioni di risoluzione di microscopia ottica convenzionale 9. Notiamo che i recenti protocolli di state-of-the-art per l&#39;isolamento dei macrofagi alveolari umani per Ca 2 + imaging e patch-clamp e di ratto macchine virtuali per colture cellulari sono stati precedentemente pubblicati in questa rivista 25,26.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1552">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Chemicals and enzymes</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td style="width:759px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Bovine calf serum</td>
			<td style="width:376px;">Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">SH30073</td>
			<td>Triple 0.1 &#181;m sterile filtered.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">CaCl2</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">21115</td>
			<td style="width:759px;">Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:376px;">Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II&#160; and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the &#34;collagenase lot selection tool&#34;. Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Glucose</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">HN06.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Heparin</td>
			<td style="width:376px;">Rotexmedica, Trittau, Germany</td>
			<td style="width:113px;">PZN-03862340</td>
			<td>Diluted in 0,9 % NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">HEPES</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Forene 100% (V/V)</td>
			<td style="width:376px;">Abbott, Libertyville, IL, USA</td>
			<td style="width:113px;">B506</td>
			<td>Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">KCl</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">6781.3</td>
			<td style="width:759px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Laminin (2 mg/ml)</td>
			<td style="width:376px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:113px;">354232</td>
			<td>Lamination is described under step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MgCl2 &#183; 6 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">MgSO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Na2HPO4 &#183; 2 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">4984.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">HN01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Taurin</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">4721.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Dyes</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Di-8-ANEPPS</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">D-3167</td>
			<td>Stock solution 2 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">T8154</td>
			<td>Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Langendorff perfusion setup</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Circulation thermostat</td>
			<td style="width:376px;">Lauda, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 &#176;C 15 min prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump</td>
			<td style="width:376px;">VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">224-2252</td>
			<td rowspan="2">Tubing needs to be changed regularly.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Flexible silicone tubing Tygon for thermostat</td>
			<td style="width:376px;">VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">228-4340</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:304px;">Heating coil surroundung perfusion tubing</td>
			<td style="width:376px;">Rettberg, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td style="width:113px;">custom-made</td>
			<td style="width:759px;">Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly&#160; in 10 mM NaOH overnight.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:376px;">Ismatec, Wertheim, Germany</td>
			<td style="width:113px;">ISM830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm</td>
			<td style="width:376px;">Braun, Melsungen, Switzerland</td>
			<td style="width:113px;">16500C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Three way stop cock Discofix 3SC</td>
			<td style="width:376px;">Braun, Melsungen, Switzerland</td>
			<td style="width:113px;">4095146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Instruments</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">42 mm glass coverslips</td>
			<td style="width:376px;">Menzel Gl&#228;ser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>0.13 - 0.16 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Cannula 21G</td>
			<td style="width:376px;">Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA</td>
			<td style="width:113px;">304432</td>
			<td>Cut to a length of ~ 5 mm, roughened with sandpaper.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm</td>
			<td style="width:376px;">Menzel Gl&#228;ser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>0.38 - 0.42 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">LSM 710 NLO</td>
			<td style="width:376px;">Carl Zeiss, Jena, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>63x 1.4 NA oil objective</td>
		</tr>
		<tr height="124">
			<td height="124" style="height:124px;width:304px;">Neubauer improved cytometer</td>
			<td style="width:376px;">Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany</td>
			<td style="width:113px;">1100000</td>
			<td style="width:759px;">Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton&#39;s rings can be observed. Subsequently, 10 - 20 &#181;l cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dlutions and counting shortcuts.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">POC-R2 Imaging Chamber</td>
			<td style="width:376px;">Pecon, Erbach, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Cell suspension volume: 800 &#181;l; desired plating density: ~ 1000 AM and ~ 10,000 VM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:113px;">15025-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student dumont #7 forceps, inox</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student iris scissors, curved, 11.5 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91461-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student iris scissors, straight, 11.5 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91402-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Tissue forceps, 1x2 teeth, slim, 10 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.

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Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

In miociti cardiaci, strutture a membrana tubolare formano reti intracellulari. Descriviamo protocolli per i) l&#39;isolamento dei miociti da cuore del mouse, tra cui il controllo di qualità, ii) la colorazione delle cellule vive per microscopia state-of-the-art fluorescenza ottimizzato, e iii) analisi di immagine diretta di quantificare la complessità dei componenti e la plasticità della membrana intracellulare reti.

Analisi della membrana tubolare reti in Cardiac miociti da atri e ventricoli

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.4K Views.  Heart Research Center Goettingen.  In miociti cardiaci, strutture a membrana tubolare formano reti intracellulari. Descriviamo protocolli per i) l'isolamento dei miociti da cuore del mouse, tra cui il controllo di qualità, ii) la colorazione delle cellule vive per microscopia state-of-the-art fluorescenza ottimizzato, e iii) analisi di immagine diretta di quantificare la complessità dei componenti e la plasticità della membrana intracellulare reti. 

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Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Plasma Surface Patterning litografia per la creazione di reti di cella

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Ricerca

Bioingegneria

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantificazione di Global Funzione diastolica da Analisi basata su modellazione cinematica del flusso transmitralico tramite il formalismo di riempimento parametrizzate diastolica

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

Luminescence Resonance Energy Transfer allo Studio conformazionale Cambiamenti nella membrana proteine ​​espresse in cellule di mammifero

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these procedures in basic research and preclinical drug development, it is important to develop protocols for automated generation and analysis under standardized conditions. Here, we present a technique to generate engineered heart tissue (EHT) from cardiomyocytes of different species (rat, mouse, human). The technique relies on the assembly of a fibrin-gel containing dissociated cardiomyocytes between elastic polydimethylsiloxane (PDMS) posts in a 24-well format. Three-dimensional, force-generating EHTs constitute within two weeks after casting. This procedure allows for the generation of several hundred EHTs per week and is technically limited only by the availability of cardiomyocytes (0.4-1.0 x 106/EHT). Evaluation of auxotonic muscle contractions is performed in a modified incubation chamber with a mechanical interlock for 24-well plates and a camera placed on top of this chamber. A software controls a camera moved on an XYZ axis system to each EHT. EHT contractions are detected by an automated figure recognition algorithm, and force is calculated based on shortening of the EHT and the elastic propensity and geometry of the PDMS posts. This procedure allows for automated analysis of high numbers of EHT under standardized and sterile conditions. The reliable detection of drug effects on cardiomyocyte contraction is crucial for cardiac drug development and safety pharmacology. We demonstrate, with the example of the hERG channel inhibitor E-4031, that the human EHT system replicates drug responses on contraction kinetics of the human heart, indicating it to be a promising tool for cardiac drug safety screening.

Here, we show the generation of human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived cardiomyocytes. We present a method to analyze contraction force and exemplary alteration of contraction pattern by the hERG channel inhibitor E-4031. This method shows high level of robustness and suitability for cardiac drug screening.

Automated Analysis Contrazione di ingegneria dei tessuti umani Cuore per lo screening cardiaco Drug Safety

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

Scaffold di stampa Core/shell per l'ingegneria dei tessuti di strutture tubolari

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

Imaging ottico di miociti Murine Ventricolari isolati

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), which are developed towards the goal of clinical use. HiPSC-derived cardiomyocytes, endothelial cells, and vascular mural cells are mixed with gel matrix and then poured into a polydimethylsiloxane (PDMS) tissue mold with rectangular internal staggered posts. By culture day 14 ECTs mature into a 1.5 cm x 1.5 cm mesh structure with 0.5 mm diameter myofiber bundles. Cardiomyocytes align to the long-axis of each bundle and spontaneously beat synchronously. This approach can be scaled up to a larger (3.0 cm x 3.0 cm) mesh ECT while preserving construct maturation and function. Thus, mesh-shaped ECTs generated from hiPSC-derived cardiac cells may be feasible for cardiac regeneration paradigms.

The present protocol generates mesh-shaped engineered cardiac tissues containing cardiovascular cells derived from human induced pluripotent stem cells to allow the investigation of cell implantation therapy for heart diseases.

Preparazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di mesh derivati da cellule iPS umane per la riparazione miocardia in Vivo

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Tessuto connettivo ingegnerizzato umano derivato da fibroblasti per applicazioni di screening

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

Using Drosophila melanogaster (fruit fly) as a model organism has ensured significant progress in many areas of biological science, from cellular organization and genomic investigations to behavioral studies. Due to the accumulated scientific knowledge, in recent years, Drosophila was brought to the field of modeling human diseases, including heart disorders. The presented work describes the experimental system for monitoring and manipulating the heart function in the context of a whole live organism using red light (617 nm) and without invasive procedures. Control over the heart was achieved using optogenetic tools. Optogenetics combines the expression of light-sensitive transgenic opsins and their optical activation to regulate the biological tissue of interest. In this work, a custom integrated optical coherence tomography (OCT) imaging and optogenetic stimulation system was used to visualize and modulate the functioning D. melanogaster heart at the 3rd instar larval and early pupal developmental stages. The UAS/GAL4 dual genetic system was employed to express halorhodopsin (eNpHR2.0) and red-shifted channelrhodopsin (ReaChR), specifically in the fly heart. Details on preparing D. melanogaster for live OCT imaging and optogenetic pacing are provided. A lab-developed integration software processed the imaging data to create visual presentations and quantitative characteristics of Drosophila heart function. The results demonstrate the feasibility of initiating cardiac arrest and bradycardia caused by eNpHR2.0 activation and performing heart pacing upon ReaChR activation.

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

The present protocol describes the generation of Drosophila melanogaster expressing eNpHR2.0 or ReaChR opsins in the heart for OCT imaging and optogenetic heart pacing. Detailed instructions for Drosophila OCT imaging and heart beating modulation, including the simulation of restorable heart arrest, bradycardia, and tachycardia in live animals at different developmental stages, are reported.