Questo metodo può essere utilizzato per la valutazione quantitativa della maturazione del sarcomero nei cardiomiociti derivati dall'iPSC. Utilizzando questo approccio basato sulla super risoluzione, è possibile rilevare anche sottili alterazioni nell'organizzazione del sarcomero, che non è possibile con l'imaging confocale convenzionale. Almeno tre ore prima dell'uso, accendere il microscopio e portare il campione a temperatura ambiente.
Quando il microscopio è pronto, aggiungere 300 microlitri di tampone di imaging PALM a un pozzo di celle etichettate e inserire la diapositiva della camera nel supporto del palco del microscopio. Selezionare l'obiettivo dell'olio 1.57 NA 100X e utilizzare la modalità PALM nel software di imaging e attivare le impostazioni TIRF. Impostare il numero di fotogrammi su 5.000 a 10.000, la potenza del laser UV allo 0,1% e il laser 647 allo 0,2% e il livello di guadagno a 50 a 100.
Una volta impostati tutti i parametri di acquisizione, accendere l'illuminazione laser e selezionare una cella di destinazione. Per acquisire un'immagine, aumentare la potenza laser 647 al 100% e ridurre il guadagno a zero. Sbiancare la cella di destinazione per circa cinque secondi, quindi aumentare il guadagno a 50 e avviare l'acquisizione dell'immagine PALM.
Per la ricostruzione dei dati PALM, al termine dell'acquisizione, aprire i dati in ImageJ e aprire il plugin Thunderstorm. Selezionare Esegui analisi nel plug-in e aprire il menu di configurazione della fotocamera. Immettere la dimensione dei pixel e il guadagno elettromagnetico.
Nel menu analisi di esecuzione, impostate l'ordine B-spline su tre, la scala B-spline su due, la soglia di intensità di picco su stfwave. f1, il raggio del raccordo a tre, il sigma iniziale a 1,6, l'ingrandimento a cinque, la frequenza di aggiornamento a 50 e il laterale si sposta su due e fare clic su OK. Dopo la ricostruzione, selezionate sigma nel menu dell'istogramma del plottaggio e utilizzate lo strumento rettangolo per selezionare un'area di interesse, escludendo possibili artefatti. Aggiungere l'area di interesse al filtro e aggiungere e incertezza inferiore a 25 ai valori dell'area di interesse.
Nella scheda rimuovi duplicati immettere una soglia di distanza di 10 nanometri. Nella scheda unione, impostate la distanza massima su 20, i fotogrammi massimi per molecola su zero e il massimo dei fotogrammi spenti su uno. Nella scheda correzione deriva selezionare la correlazione incrociata e impostare il numero di collocazioni e l'ingrandimento su cinque, quindi salvare l'immagine PALM finale ed esportare i dati post-processo.
Per analizzare la lunghezza del sarcomero, importate l'immagine PALM ricostruita di interesse in ImageJ e utilizzate lo strumento linea per tracciare una linea tra le strutture sarcomere selezionate perpendicolari al disco Z per misurare la distanza più breve tra i filamenti di actina. Nel menu analisi, selezionate il profilo del plottaggio e acquistete la lunghezza tra i due picchi. Per analizzare lo spessore del disco Z, convertire l'immagine PALM ricostruita in un'immagine in modalità a otto bit e aprire il plug-in Rilevamento cresta.
Impostare la larghezza della linea su 20, il contrasto elevato su 230, il contrasto basso su 10, il sigma su 0,79, la soglia inferiore a 25,84 e la lunghezza minima della linea a 20. Selezionare la larghezza della stima, estendere la linea e visualizzare i risultati, quindi fare clic su OK e utilizzare la larghezza media della linea dalla tabella dei risultati per ulteriori analisi. Le cellule cardiomiocite e neonatale derivate da iPSC mostrano un simile modello di actina alfa con strutture sarcomere irregolari disarranged.
La valutazione quantitativa dimostra che la lunghezza e lo spessore dei filamenti di alfa actinaina sono quasi identici tra i due gruppi di cellule che indicano uno stato di sviluppo prematuro dei cardiomiociti derivati dall'iPSC. Al contrario, i cardiomiociti maturi adulti mostrano una rete di sarcomei regolare con una lunghezza del sarcomero leggermente aumentata e uno spessore del disco Z ridotto. Un confronto tra imaging confocale convenzionale e PALM non rivela differenze significative nella lunghezza del sarcomero.
Tuttavia, viene rilevato un profondo spessore ridotto del disco Z quando i cardiomiociti iPSC sono sottoposti all'imaging PALM. Un guadagno di risoluzione si osserva quando viene applicato PALM, che è supportato dai corrispondenti grafici di intensità. In particolare, le strutture sarcomere acquisite utilizzando un tampone di bassa qualità sembrano essere più spesse rispetto alle strutture catturate in condizioni di imaging ottimali.
Questa mancanza di accuratezza dei dati è dovuta alle ridotte proprietà lampeggianti del fluoroforo, con conseguente riduzione dei fotoni rilevati per evento di localizzazione. Inoltre, la precisione di localizzazione viene ridotta, abbassando la risoluzione complessiva dell'immagine PALM ricostruita. Inoltre, la deriva del campione può influenzare la localizzazione precisa delle molecole fluorescenti con conseguente immagini sfocate.
Per acquisire immagini PALM adeguate, è molto importante consentire l'equilibrazione termica dell'intero sistema di imaging per evitare un'eccessiva deriva del campione durante l'imaging. Seguendo questa procedura, altre strutture cellulari come i mitocondri possono essere immaginite dal PALM per acquisire parametri aggiuntivi di maturazione dei cardiomiociti.
