Le nano-sonde a fluorescenza a raggi X di sincrotrone di nuova progettate consentono la visualizzazione della distribuzione elementale di un campione. L'uso di approcci criogenici è obbligatorio per rallentare i danni causati dalle radiazioni a raggi X. Pertanto, una rapida criofissazione è essenziale per ottenere cellule idratate congelate per ottimizzare la conservazione della struttura cellulare e la sua integrità chimica.
La specificità dei preparati cellulari per gli studi sul sincrotrone porta all'ottimizzazione di questo protocollo per l'acquisizione di monostrati di cellule idratate congelate. La dimostrazione visiva è importante per comprendere come manipolare i campioni di monostrato cellulare per ottenere cellule riproducibilmente criofisse incorporate all'interno di un sottile strato di ghiaccio. Per preparare un supporto a membrana in nitruro di silicio, aprire la capsula contenente il supporto della membrana e spremere delicatamente la capsula per allentare leggermente il supporto.
Utilizzare pinzette sottili per afferrare un angolo del telaio in silicio facendo attenzione a non toccare la membrana in nitruro di silicio al centro del telaio e posizionare il telaio in una piastra di Petri scoperta in un armadio a flusso laminare. Quindi i raggi UV sterilizzano la membrana per 25-30 minuti. Al termine della sterilizzazione, aggiungere 10 microlitri di fattore di attacco come la poli-L-lisina.
Incubare per 25 minuti a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica con umidità. Quindi riempire i pozzi di una piastra sterile da 48 porri con da 200 a 250 microlitri da 0,22 micrometri filtrati ultra pura e ultra traccia acqua per pozzo. Utilizzare pinzette fini per immergere accuratamente la membrana verticalmente con tre risciacqui successivi di 10 secondi in un pozzo d'acqua.
Dopo il risciacquo, posizionare la membrana verticalmente in un pozzo vuoto di una piastra sterile da 96 po 'sotto il cappuccio di flusso laminare e lasciarla durante la notte fino a quando non è asciutta. Per la semina delle cellule di interesse, posizionare la membrana rivestita con il lato piatto rivolto verso l'alto in un pozzo di una piastra sterile a quattro pozzi. Aggiungere cinque volte 10 alle quattro cellule in 10 microlitri di un mezzo di coltura appropriato alla superficie della membrana di nitruro di silicio senza toccare la membrana.
La goccia dovrebbe coprire l'intera membrana. Quindi coltura le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con umidità. Quando le cellule hanno iniziato ad attaccarsi al substrato, aggiungere lentamente un millilitro di mezzo di coltura completo lungo la parete di ogni pozzo che copre ogni membrana.
Quindi coltura le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con umidità. Per la crioimmobilitazione della preparazione cellulare, prima accendere un congelatore automatico e riempire il numero appropriato di pozzi in una piastra di plastica da 12 po 'con tampone di acetato di ammonio Celsius di 37 gradi Celsius. Immediatamente prima di risciacquare e immergere congelando la membrana, rimuovere il campione dall'incubatrice e utilizzare l'anello di morsetto nero di un paio di pinzette a sganciamento rapido per sbloccare le pinzette.
Utilizzare le pinzette sbloccate per afferrare il supporto della membrana e immergere la membrana verticalmente all'interno della soluzione tampone di acetato di ammonio per circa cinque secondi. Per rimuovere qualsiasi tampone in eccesso, premere il fondo del supporto della membrana sulla carta da filtro e asciugare ogni lato del telaio sulla carta da filtro senza consentire alla membrana di toccare la carta. Quando il tampone in eccesso è stato rimosso, aprire la porta della camera ambientale, far scorrere rapidamente le pinzette nell'interblocco delle pinze e chiudere la porta della camera.
Premere macchia Un tuffo. Le pinzette che tengono la membrana del nitruro di silicio verranno rapidamente immerse nel criogeno. Dopo il congelamento del tuffo, rimuovere il coperchio del contenitore di trasferimento con forceli prerispesiti e trasferimento della pressa.
La membrana in nitruro di silicio verrà spostata leggermente sopra il criogeno. In un rapido movimento singolo, far scorrere e inclinare leggermente le pinzette fuori dall'interblocco delle pinze per portare le pinzette direttamente in uno slot vuoto della criobox nel contenitore di trasferimento riempito con liquido azoto. Quindi rilasciare l'anello del morsetto nero per liberare la membrana.
Per la liofilizzazione delle celle congelate, utilizzare l'interruttore rocker situato sul pannello posteriore dello strumento di liofilizzazione per accendere lo strumento. Il display mostrerà premere INVIO quando è pronto per caricare l'esempio. Montare il supporto in ottone a membrana in nitruro di silicio sopra il portacampioni fornito dal fornitore nel contenitore di stoccaggio in polistirolo mantenendo il livello di azoto liquido a circa uno o due millimetri sotto il bordo superiore del primo pezzo di ottone.
Posizionare la membrana con il lato del campione di cella rivolto verso l'alto nella cavità numerata del supporto in ottone e pre-raffreddare l'asta di trasferimento in una scatola di schiuma di polistirolo riempita di azoto liquido. Utilizzare l'asta per bloccare l'assemblaggio completo, premere INVIO per rompere il vuoto per rilasciare il coperchio della camera dell'essiccatore, trasferire immediatamente il campione nella camera dell'essiccatore e chiudere il coperchio della camera dell'essiccatore. Quindi premere immediatamente iniziare a continuare con il ciclo di liofilizzazione.
Al termine del ciclo di liofilizzazione, premere stop per sfiato la camera e rimuovere l'assemblaggio completo per accedere ai campioni liofilizzato. Qui viene mostrata una tipica vista videoscopica ottica delle cellule congelate della linea cellulare del cancro al seno idrato sottoculturate su un supporto di membrana in nitruro di silicio rivestito in poli-L-lisina come dimostrato. La mappatura elementale a fluorescenza a raggi X delle cellule idratate congelate rivela la distribuzione di elementi fisiologici come potassio, zolfo e zinco.
In questo esempio rappresentativo, l'elemento zolfo strettamente legato è stato distribuito uniformemente all'interno della cellula in un modello simile a quello osservato per il potassio e rappresenta una buona stima del profilo di massa cellulare. La distribuzione dello zinco, tuttavia, presentava un segnale più alto all'interno del nucleo che nel citosolo con una separazione chiaramente definita del segnale tra il citosolo e il nucleo. In questa tipica vista microscopia di Brightfield dei neuroni ippocampali del topo primario liofilizzato direttamente coltivati su una membrana di nitruro di silicio come dimostrato, le cellule mostrano una morfologia neurale tipica che non è influenzata dalla loro coltura o metodo di conservazione.
L'imaging a fluorescenza a raggi X di cellule congelate rivela anche le tipiche distribuzioni elementali esposte da queste cellule liofilizzato rappresentative con una risoluzione spaziale da 50 a 100 nanometri. Tracciare la finestra del nitruro di silicio è fondamentale per ottenere lo strato di ghiaccio più sottile possibile delle cellule dopo il congelamento del tuffo. Preservare l'integrità chimica delle cellule a livello subcellulare permette di esplorare il metallome delle cellule con nano-sonde di sincrotrone e con altre tecniche microanalitiche.
Poiché non tutte le analisi della nano-sonda del sincrotrone possono essere eseguite a temperatura criogenica, le cellule idratate congelate possono essere ulteriormente liofilizzato per facilitarne l'analisi a temperatura ambiente. Ricordarsi di utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale quando si lavora con azoto liquido e di utilizzare sempre gas etano in una cappa aspirante lontano dalle fiamme.
