Il metodo di immersione manuale qui descritto è un metodo economico e affidabile per la preparazione di campioni per la microscopia elettronica a trasmissione. In questo video, dimostreremo come impostare lo stantuffo manuale, preparare il criogeno ed eseguire il blotting manuale e l'immersione delle griglie EM. Preparare l'ambiente di immersione manuale.
Questa procedura deve essere eseguita in una cella frigorifera mantenuta a 40 gradi Celsius con umidità superiore al 95% Si consiglia di utilizzare i materiali mostrati qui e come descritto nel protocollo online per il blotting e l'immersione manuale. Preparare il criogeno Dewar e lo stantuffo manuale. Per assemblare il criogeno Dewar, installare prima la base della piattaforma nella parte inferiore del polistirolo blu Dewar, assicurandosi che sia piatta e piana.
Quindi posizionare il portaborsella di etano sopra la base della piattaforma e inserire il recipiente di etano di ottone. Infine, situare la piattaforma di stoccaggio della griglia rotante. Quindi, posizionare il Dewar che si immerge alla base dello stantuffo manuale.
Centra la nave di etano sotto il braccio di immersione e fissa il Dewar che si immerge alla base. Per impostare l'altezza di immersione manuale, attaccare prima del nastro adesivo fresco alla base del braccio di immersione. Quindi, fissare un paio di pinzette di serraggio avvolgendo saldamente il nastro attorno al braccio di immersione e alla base della pinzetta.
Assicurarsi che le pinzette siano saldamente attaccate toccandole leggermente. Tenere il braccio che si immerge e abbassare lentamente le pinzette nel vaso di etano di ottone premendo il pedale. Regola la posizione del Dewar in picchiata in modo che le pinzette si trovino al centro del vaso di etano di ottone.
Le punte delle pinzette non devono contattare le dimensioni o il fondo del recipiente di etano in ottone per evitare danni alle pinzette e allo stantuffo manuale. Una volta impostata la posizione, reimpostare il braccio di immersione manuale. Preparare il criogeno.
La preparazione criogena deve essere eseguita in una stanza ben ventilata e devono essere indossati sempre adeguati dispositivi di protezione individuale. Per cominciare, scarso azoto liquido direttamente nel Dewar in picchiata, fermandosi quando il livello di azoto liquido raggiunge la parte superiore del vaso di etano di ottone. Il sistema dovrebbe essere abbastanza freddo da procedere dopo che l'azoto liquido smette di gorgogliare violentemente.
Ci vorranno circa cinque minuti. L'etano si presenta come gas compresso e deve essere condensato. Per impostare il flusso di gas per una condensazione ottimale dell'etano, inserire la punta della linea del gas di etano in un becher d'acqua da 250 mil e osservare il gorgogliamento.
Il flusso di gas dovrebbe produrre un flusso costante di bolle che non interrompa violentemente la superficie dell'acqua. Per iniziare a condensare l'etano, posizionare la punta della linea del gas di etano sul fondo del recipiente di etano di ottone. Mescolare lentamente la punta di metallo e iniziare a liquefare l'etano.
Non appena l'etano inizia a raffreddarsi, emetterà un rumore udibile. Riempire il recipiente di etano di ottone a tre quarti pieno di etano liquido. Completare il Dewar con azoto liquido, assicurandosi che tocchi il vaso di etano in ottone ma non si riversi in esso.
L'aggiunta di azoto liquido è necessaria per il congelamento uniforme dell'etano. Posizionare il coperchio di schiuma sul Dewar blu e lasciare che l'etano si solidifichi completamente. Riavviare il flusso di gas etano e posizionare con attenzione la punta della linea del gas nell'etano solido.
È importante posizionare la punta verticalmente nella nave e dispensare etano sul fondo. Mescolare lentamente la punta metallica per sciogliere l'etano e portare il livello di etano liquido fino alla parte superiore della nave. Chiudere il coperchio per circa un minuto e lasciare che l'etano si solidifichi attorno ai bordi del recipiente di ottone fino a quando non sono visibili due o tre millimetri di etano solido.
L'etano è ora ad una temperatura ideale per il congelamento di campioni biologici. Attaccare con attenzione il Dewar a immersione alla base dello stantuffo manuale. Fissare un paio di pinzette di serraggio avvolgendo saldamente il nastro attorno al braccio di immersione e alla base della pinzetta.
Tenere il braccio che si immerge e abbassare lentamente le pinzette nell'etano liquido premendo il pedale. Regolare la posizione del Dewar in immersione in modo che le pinzette si trovino al centro dell'etano liquido, evitando il contatto con l'anello di etano solido. Preparare materiali e accessori per immersioni.
Preparare la carta assorbente tagliando ogni carta da filtro circolare in strisce larghe circa un centimetro. Evitare di toccare il centro della carta assorbente e scartare i pezzi finali più piccoli. È importante assicurarsi che le strisce di carta assorbente siano asciutte, pulite e prive di contaminanti.
Prima di immergersi, posiziona le scatole della griglia nel Dewar che immerge nelle fessure appropriate. Assicurati che la griglia copra il nostro libero di ruotare. Prepara i campioni di CryoEM con Plunge Freezing.
A causa della diversità dei preparativi della griglia e della griglia, seguire i protocolli raccomandati per rendere le griglie idrofile. Per gestire correttamente le griglie, utilizzare pinzette di serraggio pulite e asciutte per raccogliere le griglie idrofile sull'anello esterno. Far scorrere il morsetto di plastica per fissare la griglia e picchiettare delicatamente le pinzette per assicurarsi che la griglia sia bloccata correttamente.
Applicare tre microlitri di campione sulla parte anteriore della griglia tenuta nelle pinzette di serraggio. Fissare saldamente le pinzette al braccio di immersione manuale avvolgendo il nastro attorno alla base della pinzetta. Il campione è ora pronto per essere cancellato e immerso congelato.
Tieni ogni estremità di una striscia pulita di carta assorbente tra l'indice e il pollice. Appoggia le mani sul bordo del Dewar che si immerge per stabilire una posizione stabile. La carta assorbente dovrebbe trovarsi a circa un centimetro dalla superficie della griglia.
Piegare la carta assorbente fino a quando il centro non contatta la griglia. È importante che la carta assorbente sia parallela alla superficie della griglia per consentire un contatto uniforme e prevenire danni alla griglia. Quando il frontale liquido mobile smette di diffondersi, inizia a contare.
Cancella la griglia per cinque secondi. Schiocca le dita, sforzando la carta assorbente e rimuovendola rapidamente dalla superficie della griglia. Contemporaneamente, premere il pedale per rilasciare il braccio di immersione manuale, immergendo le pinzette che tengono la griglia nell'etano liquido.
Mantenendo la griglia appena congelata nell'etano liquido, staccare con cura le pinzette dal braccio di immersione manuale. Scollegare con cura le pinzette in modo che la griglia sia rimovibile. Spostare la griglia nel serbatoio di azoto liquido sotto il recipiente di etano di ottone con un rapido movimento dall'etano all'azoto liquido.
Posizionare la griglia nella casella della griglia. Risultati rappresentativi. Da questo video, i ricercatori dovrebbero essere in grado di preparare griglie CryoEM, come questa, con molti quadrati contenenti sottili film di ghiaccio vitreo per l'imaging ad alta risoluzione.
La concentrazione del campione e il tempo di blotting possono essere regolati per ottimizzare la densità delle particelle. Qui, dimostreremo l'intero flusso di lavoro per il congelamento dei campioni CryoEM utilizzando il metodo blot and plunge. Utilizzare una pinzetta di serraggio pulita per raccogliere una nuova griglia e fissare la griglia in posizione.
Applicare tre microlitri di campione sul lato idrofilo della griglia e fissare una pinzetta al braccio di immersione manuale avvolgendo il nastro attorno alla maniglia della pinzetta. Posizionate la carta assorbente parallelamente alla superficie della griglia e piegate delicatamente la carta assorbente verso la griglia per avviare il blotting. Dopo il periodo di tempo desiderato, spostare la carta assorbente con un movimento di scatto lontano dalla superficie della griglia mentre si preme il pedale per rilasciare il braccio che si immerge, immergendo la griglia nell'etano liquido.
Srotolare con cura il nastro da intorno alle pinzette e al braccio di immersione manuale. Con un movimento rapido, trasferire rapidamente la griglia dal serbatoio di etano al serbatoio di azoto liquido. Posizionare la griglia nella scatola di stoccaggio della griglia e avvolgere le pinzette in un Kim Wipe per asciugare; ripetere.
