Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni R00AG031911 dal National Institute on Aging dei National Institutes of Health per PHM Il contenuto di questo articolo non riflette necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

1 Preparazione di mezzi e soluzioni <ol><li> Crescere cellule utilizzando estratto di lievito-peptone-glucosio (YPD) ricco mezzo per il protocollo standard. Preparare un Bacto-peptone 2%, estratto di lievito 1%, soluzione di glucosio al 2% per YPD media e aggiungere 2% Bacto-agar per terreno solido 19. Autoclave per la sterilizzazione. Utilizzare un mezzo alternativo, se necessario, per verificare una particolare condizione di crescita o ceppo di lievito mutante. </li><li> Fai solido terreno completo sintetico privo di arginina con 60 mg / L canavanina (SC-arg + canavanina) per selezionare mutanti resistenti canavanina. Preparare una soluzione che è 0,67% Bacto-lievito base di azoto, senza aminoacidi, 2% di glucosio, 0,2% miscela completa senza supplemento di arginina (mix di abbandono), e il 2% Bacto-agar 19. Autoclave e fredda prima di aggiungere canavanina da un / ml di soluzione di 20 mg (filtro sterilizzato, conservato a 4 ° C) 19. <ol><li> Fai solido terreno completo sintetico contenente acido 5-fluoroorotic (5-FOA). Preparare 500ml di una soluzione 1,34% Bacto-base azotata di lievito senza amminoacidi, 4% di glucosio, 0,4% miscela completa supplemento, e 0,2% 5-FOA e filtro-sterilizzare 19. Autoclave 500 ml di una soluzione di Bacto-agar 4%, brevemente raffreddare, e poi mescolare con la soluzione nutritiva, sterilizzata per filtrazione da 500 ml. Utilizzare appropriati mezzi alternativi per altri test di mutazione. </li></ol></li><li> Per l&#39;etichettatura biotina, fare 500 ml 1x fosfato soluzione salina tamponata (PBS) contenente 137 mM di cloruro di sodio, cloruro di potassio 2,7 mM, 10.14 mM sodio fosfato bibasico, e 1,77 mM potassio fosfato bibasico, pH 8 Conservare a 4 ° C e continuare a ghiaccio durante l&#39;uso. </li><li> Fare un fresco 5 mM biotina magazzino in sterile, acqua ultrapura. </li><li> Per placare l&#39;etichettatura biotina, fare 500 ml di PBS 1x, glicina 100 mM. Conservare a 4 ° C e tenere in ghiaccio durante l&#39;uso. </li><li> A seconda del numero di cellule utilizzate e durata dell&#39;esperimento, fare 1-2 L di tampone branello-etichettatura contenente PBS 1x, 2 mM EDTA, 0,5% Bovine albumina sierica. Filtro sterilizzare e buffer di de-gas. Conservare a 4 ° C e tenere in ghiaccio durante l&#39;uso. </li><li> Preparare una soluzione allo 0,4% trypan blu in 1x PBS, filtro sterilizzare e conservare a temperatura ambiente per l&#39;utilizzo nelle misure vitalità cellulare. </li><li> Aliquota piccoli volumi (~ 100 microlitri) di un agglutinina germe di grano (WGA) coniugato fluorescente a conservare a -20 ° C in imballaggio leggero (o opachi) microprovette da utilizzare nel determinare l&#39;età delle cellule. </li></ol> 2 Determinazione del Tasso di mutazione e frequenza <ol><li> Stabilire un tasso di mutazione di base per la generazione di cellule utilizzando test di fluttuazione di cellule cresciute in condizioni di coltura standard. Crescere sette alle undici replicare 1 ml culture da una densità iniziale di 1.000-5.000 cellule / ml ai primi di fase stazionaria (~ 10 8 cellule / ml). <ol><li> Per ogni cultura replica, diluire le cellule 1: 2.000 e diffondere 1-4 microlitri su terreno non selettivo (YPD) per determinare formante colonia-unità / ml. Pellet cellule rimanendo a ~ 2.400 xg per 1 min in una microcentrifuga e risospendere in 100 ml di acqua di diffondersi su terreno selettivo per identificare i mutanti. Incubare le piastre per tre giorni a 30 ° C prima di contare le colonie (regolare il tempo di incubazione, se necessario sulla base del tasso di crescita delle cellule). </li><li> Determinare il numero di mutazioni indipendenti (m) che si sono verificati nel processo in base al numero di colonie mutanti (r) ottenuti su terreno selettivo. Utilizzare lo stimatore mediana Lea-Coulson per trovare m sostituendo il numero medio di colonie mutanti per r nella formula sotto 9. Poi sostituire i valori per m finché il lato sinistro dell&#39;equazione è praticamente nulla. <img alt="Equazione 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51850/51850eq1.jpg" /></li><li> Per determinare il tasso di mutazione, prima di calcolare il numero medio di cellule vitali sparsi sul terreno selettivo moltiplicando il formante colonia-unità / ml media delle culture replicare e il volumedella cultura nella diffusione ml su terreno selettivo. Dividere il valore m dal punto 2.1.2 da questo numero medio di cellule vitali per ottenere il tasso di mutazione per generazione di cellule. </li></ol></li><li> Calcolare autonomamente il numero di cellule vitali sparsi sul terreno selettivo per ogni cultura replica in un processo come descritto al punto 2.1.3. Dividere il numero di colonie mutanti (r) ottenuti per una cultura per il numero di cellule vitali sviluppa su terreno selettivo per ottenere la frequenza di mutazione. Utilizzare la media o la mediana delle singole frequenze di mutazione dalle culture ripetute nel passaggio 2.1 come frequenza di mutazione basale. </li><li> Effettuare misure di frequenza, prima e dopo che le cellule di etichettatura biotina (passi 3.2 e 3.4) per determinare se i risultati di etichettatura passo di qualsiasi cambiamento nella frequenza delle mutazioni che dovranno essere prese in considerazione durante la verifica per le modifiche età-specifici in accumulo di mutazioni. </li></ol> 3 Biotina Etichettatura <ol><li> Streak S. cerevisiae da uno stock di glicerolo a -80 ° C su YPD media e incubare a 30 ° C per 1-3 giorni. </li><li> Usando una pipetta sterile, trasferire le cellule dalla piastra striscia di 1 ml (o più) di acqua, tenendo presente che 1-1,5 cm di una porzione fittamente coltivato della striscia darà circa 10 8 cellule. Determinare la densità esatta delle cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Etichetta 10 8 cellule per ceppo (o condizione di trattamento) per punto di raccolta in cui sarà determinata la frequenza di mutazione o di un numero di abitanti sufficiente per ottenere almeno 5-10 colonie mutanti per il campionamento sul terreno selettivo (in base alla frequenza di mutazione dal punto 2.2). Includere un ulteriore 10 8 celle per misurazioni di base per ceppo / condizione. </li><li> Etichetta biotina secondo la procedura standard dal produttore, ad eccezione di utilizzare un 5 mM reagente biotina magazzino e scuoterla delicatamente durante l&#39;incubazione. Spin per 5 minuti a 4 ° C a 3000 xg per tutte le fasi di centrifugazione, sInce filatura a temperature superiori a 4 ° C può portare ad una maggiore perdita di cellule. Dopo l&#39;ultimo lavaggio, sospendere le cellule ad una concentrazione di 10 8 etichettati cellule / ml in acqua. </li><li> Controllare la vitalità delle cellule utilizzando trypan colorazione blu. Diluire 10 ml di cellule con 23 ml di acqua e 67 ml di 0,4% trypan blu in 1x PBS. Incubare per almeno 40 minuti a temperatura ambiente prima di segnare dal vivo (non colorati) e morti (colorati), le cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Misurare i valori di base per l&#39;instabilità del genoma, l&#39;età delle cellule, e le altre caratteristiche rilevanti (vedere paragrafi 5, 6 e 7). </li><li> Trasferire le cellule biotina marcata a 20 ml di YPD media per 10 a 8 celle in una beuta (circa 5 x 10 6 cellule / ml). Far crescere la cultura (s) 16-18 ore a 20 ° C per una densità approssimativa di 10 8 cellule / ml (4-5 generazioni cellulari), ma non consentono di raggiungere le cellule fase stazionaria. Utilizzare un tempo di incubazione più breve per la crescita a 30 ° C. Tenere biotina marcata con cells a 4 ° C fino a diverse ore prima di essere aggiunti alla media, se aveva bisogno di ottimizzare i tempi del periodo di crescita e di raccolta. </li></ol> 4. Bead Etichettatura e ordinamento magnetico <ol><li> Dopo la fase di crescita, diluire un&#39;aliquota di coltura per determinare la densità delle cellule utilizzando un emocitometro. Cellule pellet di centrifugazione per 5 minuti a 4 ° C a 3.000 x g. Eliminare il surnatante. </li><li> Lavare le cellule vortex per sospendere pellet in 30 ml di tampone bead-etichettatura, centrifugazione e poi versare il surnatante come nella sezione 4.1. Ripetere il lavaggio. </li><li> Completamente risospendere le cellule in 50 microlitri di buffer bead-etichettatura per 10 8 cellule totali nel vortex. Aggiungere 2 ml sfere magnetiche per 10 a 8 cellule totali e vortice brevemente per mescolare. Incubare in ghiaccio per 10 minuti, invertendo periodicamente a mescolare (modificato da un protocollo online all&#39;indirizzo <a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf &lt;</a>/ A&gt;). </li><li> Lavare le cellule tre volte con 30 ml di tampone bead-etichettatura. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di tampone bead-etichettatura per 10 8 cellule totali e brevemente vortice pellet su un&#39;impostazione media solo fino a quando le cellule sono risospese. Versare attraverso un colino cella di 40 micron in un tubo da 50 ml per rimuovere eventuali grumi di cellule rimanenti. Se necessario, lasciare le cellule in ghiaccio per 1-2 ore prima del carico sulla colonna. </li><li> Seguire protocollo raccomandato dal costruttore per le colonne magnetiche per legare, lavare, ed eluire le cellule madri tallone marcato magnetici. Per aumentare il recupero delle cellule marcate, utilizzare almeno una colonna per 2 x 10 9 cellule totali. <ol><li> Rimuovere eventuali bolle che si verificano durante il caricamento di colonne, in quanto saranno bloccare il flusso. Rimuovere e sostituire la colonna sul separatore tra un lavaggio per impedire alle cellule di diventare intrappolati tra le perle (modificato da un protocollo online su <a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/user</a>manual031113.pdf). </li><li> Salva fluire dalle fasi vincolanti e lavaggio di analizzare giovani cellule prodotte dalle cellule madri, se lo si desidera. Concentrato cellule come descritto al punto 4.7. </li><li> Utilizzare separatori multi-colonna per il trattamento più campioni in una sola volta. Eluire più colonne dello stesso campione nella stessa provetta di raccolta per ridurre il tempo di trattamento e diminuiscono la perdita di cellule. </li></ol></li><li> Concentrato cellule madri eluiti mediante centrifugazione a 3000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare tutto ma 1 ml di tampone per 10 a 8 celle marcati con biotina originali. Vortex brevemente per sospendere le cellule in tampone rimanente. </li><li> Diluire un&#39;aliquota di cellule e macchia blu trypan per determinare la densità cellulare e la vitalità delle cellule utilizzando un emocitometro (vedere il punto 3.5). Calcolare il numero totale di cellule recuperate. <ol><li> Se il numero delle cellule è notevolmente più elevato del previsto, passare il campione di eluizione attraverso un&#39;altra colonna per cercare di rimuovere contaminanti cellule giovani.Se il numero di celle è sostanzialmente inferiore al previsto, passare il flusso salvati attraverso campione attraverso un&#39;altra colonna per cercare di migliorare il rendimento delle cellule madri. </li></ol></li><li> Utilizzare cellule per ulteriori analisi, come descritto nelle sezioni 5 e 6 In alternativa, far crescere le cellule in YPD brodo ancora per aumentare la loro età replicativa (passo 3.7) e seguire, mediante l&#39;etichettatura tallone e smistamento (gradini 4.1-4.8.1), senza il necessario ripetere l&#39;etichettatura biotina. </li></ol> 5 Determinazione del replicativo Age <ol><li> Spin cellule per 2 minuti a 5000 xg a temperatura ambiente per tutti i passaggi in questa sezione. Mettere 25 ml di cellule recuperate (~ 10 8 cellule / ml) in una provetta da 1,5 ml per centrifuga e lavare due volte con 1 ml di PBS 1X. Aspirare il surnatante. <ol><li> Scongelare una aliquota di WGA-coniugato, vortice per mescolare e girare brevemente per eliminare aggregati proteici. Sospendere le cellule in 180 microlitri 1x PBS e 20 ml di WGA coniugati con una molecola fluorescente per etichettare le cicatrici gemma sulla superficie di thcellule e. Coprire la provetta da 1,5 ml per centrifuga con pellicola e incubare con una leggera oscillazione a 30 ° C per 30 min. </li><li> Lavare tre volte con 1 ml di PBS 1X. </li></ol></li><li> Per la microscopia a fluorescenza, scivoli etichette e montare secondo la procedura standard con un agente anti-fade. Curare completamente i vetrini al buio (fino a un paio di giorni) prima coprioggetto di tenuta per evitare il movimento delle cellule durante l&#39;imaging. Contare cicatrici gemma su almeno 50 cellule per campione per ottenere una misura rappresentativa di età cellulare. Conservare i vetrini per un massimo di 1 mese per la visualizzazione di cicatrici gemma, se necessario. <ol><li> In alternativa, determinare l&#39;intensità del segnale fluorescente dal WGA-coniugato eseguendo citometria a flusso su cellule in sospensione in 1 ml di PBS 1x dopo passo 5.1.2. Utilizzare un laser di eccitazione 405 nm e 530/30 filtro nm emissione con un filtro passaggio lungo 505 nm per WGA-Alexa 488 Includere un controllo senza macchia per ogni punto di raccolta. </li></ol></li><li> Cicatrici germoglio grafico sulle cellule giovani e le cellule invecchiate contate al microscopio sulasse y contro la media geometrica normalizzata (tinto media geometrica / incolori media geometrica) della fluorescenza WGA-coniugato dalle stesse popolazioni cellulari sul asse x. Ottenere l&#39;equazione di una linea di tendenza lineare per questo rapporto. Per gli esperimenti successivi, sostituire la media geometrica normalizzata di WGA-coniugato intensità di fluorescenza di una popolazione di cellule di x nell&#39;equazione e risolvere per y per determinare l&#39;età cella media di un campione. </li></ol> 6 Mutazione Frequenza <ol><li> Diffusione allineati cellule madri risospese in un tampone dal passo 4,7 su terreno YPD e terreno selettivo come descritto al punto 2.1.1. Utilizzare 1 ml di cellule madri risospese per celle di media e di spin selettivi a 5.000 xg per 1 min. NOTA: Diffusione grandi quantità di cellule diluite su terreno YPD come cellule aumentano di età per compensare un numero crescente di cellule non vitali e senescenti nelle popolazioni anziane. <ol><li> Incubare YPD media e piastre di terreno selettivopunto 6.1 a 30 ° C per 3 e 4 giorni, rispettivamente. Aumentare il tempo di incubazione fino a una settimana per molto vecchie cellule o dei geni lenta crescita. Calcolare la frequenza di mutazione, come descritto al punto 2.2. </li></ol></li></ol> 7 Calcolo prevista frequenza di mutazione di Age replicativo Data <ol><li> Calcola l&#39;aumento medio dell&#39;età replicativa delle cellule biotina marcata nel corso dell&#39;esperimento sottraendo l&#39;età media della popolazione di cellule iniziale dall&#39;età media delle cellule madri ordinati per il tipo in questione. Utilizzare i secoli cellulari calcolati al punto 5.2 o punto 5.2.2. </li><li> Moltiplicare il tasso di mutazione ottenuto nel passaggio 2.1.3 con l&#39;aumento dell&#39;età media delle cellule calcolata al punto 7.1. Aggiungere questo valore per la frequenza di mutazione basale per la popolazione iniziale calcolata nel passo 2.2 per determinare la frequenza di mutazione previsto per le cellule dell&#39;età replicativa pertinente. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo combina diversi metodi per attivare risorse e approcci disponibili in Saccharomyces cerevisiae sistema modello da applicare efficacemente allo studio del genoma instabilità durante l&#39;invecchiamento cellulare mitotica. Una vasta gamma di test per quantificare le diverse forme di instabilità del genoma attraverso la selezione fenotipica può essere combinato con l&#39;ordinamento magnetica per studiare i possibili cambiamenti età-specifici in accumulo di particolari forme di mutazioni o riarrangiamenti cromosomici. Mentre gli approcci di sequenziamento dell&#39;intero genoma potrebbero fornire maggiori informazioni sui tipi generali di cambiamenti che si verificano in un genoma con l&#39;età, la possibilità di utilizzare sistemi di selezione fenotipica di ottenere misurazioni dei tassi di mutazione e di isolare preferenzialmente specifici tipi di cambiamenti genetici sono importanti vantaggi per lo studio meccanicistico aspetti di legati all&#39;invecchiamento genoma instabilità. Razionalizzazione della determinazione dell&#39;età cellulare e la possibilità di effettuare misurazioni parallele di physiologimodifiche cal tramite citometria a flusso forniscono mezzi efficaci per correlare l&#39;instabilità del genoma con altri cambiamenti cellulari durante fasce di età specifiche. Determinazione dei potenziali cambiamenti età-dipendenti dei tassi di mutazioni si accumulano richiede: 1) la determinazione accurata dei tassi in popolazioni di cellule giovani, 2) la determinazione precisa dell&#39;età delle cellule, e 3) la capacità di arricchire in modo affidabile sufficientemente grandi popolazioni di cellule madri per misurare riproducibile instabilità del genoma in età avanzata. Questo approccio permette al sistema modello di lievito di contribuire a definire meccanismi alla base di responsabili dei cambiamenti età-dipendente dei tassi e / o frequenze di instabilità del genoma nelle cellule mitoticamente attive. Inoltre, fattori genetici e ambientali possono essere rapidamente valutati per contributi a età-dipendente genoma instabilità. In ultima analisi, queste caratterizzazioni potrebbero portare allo sviluppo di modelli che rappresentano il modo in cui le mutazioni si accumulano durante l&#39;invecchiamento replicativo. Questo metodo dipende dalla capacità di rilevare mutazioni o altri tipi di instabilità del genoma attraverso la comparsa di fenotipi selezionabili per misurare i tassi di tali eventi. Tuttavia, la creatività nella progettazione di test può permettere molti aspetti del genoma instabilità per essere esaminati. Ad esempio, il URA3 e geni CAN1 possono essere collocati in differenti siti genomici per verificare eventuali influenze della posizione genomica sui risultati. Reversion di specifici alleli del gene non-funzionali alleli di geni funzionali potuto testare particolari processi mutazionali. Inoltre, l&#39;introduzione di molteplici alleli inattivi di un gene o di accompagnamento di un gene con sequenze ripetute potrebbe essere usato per esaminare gli eventi di ricombinazione attraverso il restauro o la perdita di funzione del gene, rispettivamente. Test di fluttuazione sono l&#39;approccio standard per determinare i tassi di questi vari eventi genoma instabilità 9. Il protocollo è scritto usando lo stimatore mediana Lea-Coulson ben accettato e relativamente semplice per determinare mutatasso zione per renderlo più accessibile ai diversi ricercatori, anche se il metodo MSS-stimatore di massima verosimiglianza è considerato il metodo migliore per determinare i tassi di mutazione 9. Lo stimatore di massima verosimiglianza-MSS è stato già recensito in dettaglio 9, e può essere utilizzato come metodo alternativo, ma richiede calcoli più sofisticati. In alternativa, il software gratuito per calcolare i tassi di mutazione con questo metodo è stato messo a disposizione 22. Ottenere misure riproducibili su tassi di mutazione richiede attenzione ad alcuni aspetti del disegno sperimentale, compreso l&#39;uso di colture replicate sufficienti, inoculando colture a bassa densità sufficiente di cellule iniziali che taglia la popolazione aumenta di adeguati volumi di coltura di 10.000 volte o più, e scegliendo in modo che l&#39;intera popolazione di cellule può essere diffuso su terreno selettivo. Per quest&#39;ultimo punto, una formula precedentemente descritta può essere utilizzata per regolare il tasso di mutazione basata sulla frazione di cultura tested 9. Variazione del tasso di crescita delle culture può complicare la determinazione di un tasso di mutazione riproducibile, e uno stimatore basato mediana-modificato che può produrre risultati più riproducibili in tali situazioni è stata recentemente descritta 23. La possibilità di misurare con precisione l&#39;età delle cellule è un altro fattore che è importante per stabilire se le frequenze genoma instabilità in vecchie cellule sono diversi dai valori attesi a causa del tasso di eventi nelle cellule giovani. Abbiamo trovato WGA colorazione sia preferibile calcofluor colorazione bianca, sia in termini di background e flessibilità, poiché WGA è disponibile coniugato con molecole fluorescenti differenti. Questa flessibilità può offrire maggiori opportunità per la misurazione simultanea di altre caratteristiche cellulari con i reagenti fluorescenti. Il lavoro iniziale per stabilire un rapporto tra l&#39;intensità del segnale per la colorazione WGA e il corrispondente numero di cicatrici gemma su cellule possono poi portare ad una piùrapida determinazione dell&#39;età cellulare attraverso citometria a flusso. Questo approccio consente anche l&#39;uso delle dimensioni delle popolazioni più grandi di quanto sarebbe normalmente esaminati al microscopio per una migliore riproducibilità delle misurazioni. Mentre tutte le determinazioni età potrebbe essere fatto attraverso l&#39;esame microscopico delle cellule, riteniamo che la citometria a flusso approccio facilita screening rapido di fattori che influenzano l&#39;età-dipendente genoma instabilità. Oltre a misurare l&#39;età delle cellule in modo affidabile, la considerazione deve essere data al numero di divisioni cellulari cellule madri sono autorizzati a sottoporsi con ogni successivo round di crescita e l&#39;ordinamento delle cellule. Uso di un formato popolazione iniziale più piccola o un volume più grande cultura potrebbe consentire a cellule di sottoporsi più divisioni cellulari prima di raggiungere la densità cellulare desiderato. Ad esempio, altri ricercatori hanno usato solo due turni di smistamento per ottenere molto vecchie cellule di lievito 16, che ha l&#39;ovvio vantaggio di ottenere cellule vecchie con meno experimepassi ntale. Nel valutare se aumentare il volume della cultura per permettere alle cellule di completare più divisioni cellulari prima di ordinare, tenere a mente il limite per il numero totale di cellule che possono essere elaborati in una singola colonna. Utilizzare un volume di grande cultura può richiedere l&#39;uso di più colonne per ordinare una popolazione di cellule. Inoltre, se le cellule subiscono un minor numero di cicli di divisione cellulare tra i punti di tipi / raccolta, poi ci sono più opportunità per osservare le deviazioni dalla frequenze di mutazione attese in momenti distinti durante la durata della vita. Ad esempio, il campionamento solo in anticipo e momenti in ritardo durante la durata della vita può produrre dati che indicano un costante aumento della frequenza di mutazione, ma di campionamento nei momenti intermedi supplementari durante la durata della vita può dimostrare che la frequenza aumenta mutazione rapidamente e poi altipiani. Tuttavia, dal momento che questo protocollo di isolare cellule madri vecchie, vi è la possibilità di ottenere una misura più diretta della variazione dei tassi di mutazione con l&#39;età. Test di fluttuazione potevano be effettuata utilizzando cellule madri di età diverse per determinare se il tasso di mutazione sarà diverso dal tasso ottenuto con cellule giovani. Mentre le culture di questi test di fluttuazione diventerà una miscela di cellule vecchie e giovani man mano che crescono, eventuali deviazioni da tassi ottenuti a partire da cellule giovani potrebbero essere attribuiti all&#39;uso di una popolazione anziana di partenza. La possibilità di ottenere riproducibile una grande popolazione abbastanza di cellule madri di età compresa tra di misurare con precisione l&#39;instabilità del genoma è fondamentale per il successo di questo approccio. Mentre il protocollo descrive l&#39;uso di un particolare sistema di smistamento magnetico per questo scopo, altri gruppi hanno filtrate cellule di lievito madre con sistemi alternativi 14,18 (vedi Tabella dei Materiali). Tali sistemi alternativi dovrebbero funzionare anche con questo metodo, anche se alcuni ottimizzazione dei protocolli dei produttori potrebbe essere richiesto. Indipendentemente dal sistema specifico utilizzato, la dimensione della popolazione richieded differisce a seconda della frequenza del tipo di mutazione o genoma riarrangiamento scelti per lo studio. Come minimo, ci deve essere un numero sufficiente di cellule madri per ottenere almeno una colonia mutante per ogni popolazione di calcolare una frequenza di mutazione. In pratica, i risultati possono essere molto variabili se solo zero a cinque colonie mutanti sono attesi dalla dimensione della popolazione, e anche un piccolo aumento della dimensione della popolazione, in modo che 5-10 colonie mutanti sono attesi, può notevolmente migliorare la riproducibilità. Quando biotina etichettare una popolazione di partenza, l&#39;efficienza di recupero per ogni tipo deve essere presa in considerazione per identificare la dimensione della popolazione, necessarie per misurare la frequenza di mutazione in cellule madri vecchie. Con il 90% di recupero di cellule madri dopo ogni sorta, solo il 59% della popolazione originaria sarebbe stata recuperata dopo cinque cicli di crescita e di smistamento. Questo scende a ~ 33% di recupero della popolazione originaria dopo cinque turni di crescita e di smistamento, se solo l&#39;80% delle cellule madri sono etichettati recuperarecato nel corso di ogni sorta. Misurazione e massimizzando il recupero è fondamentale quando si misura eventi a bassa frequenza, dal momento che un 2-3 volte diminuzione della dimensione della popolazione potrebbe facilmente portare a numeri inaffidabili di colonie mutanti per la popolazione. Ci sono numerose opzioni per espandere o modificare questo protocollo per ottenere una più ampia comprensione del genoma instabilità durante l&#39;invecchiamento cellulare mitotica. Semplici esempi includono analizzare come alterazioni delle funzioni del gene, i cambiamenti dei media, o altre variazioni delle condizioni ambientali alterano l&#39;accumulo di mutazioni con l&#39;età. Tassi di mutazione per i giovani cellule con funzione del gene alterato o nella condizione appropriata sarebbero misurati e utilizzati per determinare se le mutazioni si accumulano in modo diverso di quanto previsto dai valori di tasso e di diverso rispetto a popolazioni di cellule di controllo. Popolazioni cellulari in diversi punti durante l&#39;invecchiamento replicativo potrebbero essere esposti a fattori di stress specifici, come le specie reattive dell&#39;ossigeno o del DNA agenti dannosi. Laesposizione transitoria e mite allo stress ossidativo non ha modificato sostanzialmente la capacità di eseguire cell sorting (figura 3), ma le sollecitazioni più severe può complicare il recupero delle cellule. Esperimenti preliminari sarebbero necessarie per verificare che le cellule madri possono ancora essere recuperati in modo efficiente in seguito a sollecitazioni specifiche. Inoltre, le caratteristiche cellulari di cellule madri isolate potrebbero essere analizzati in dettaglio, compresi i livelli di specie reattive dell&#39;ossigeno, la morfologia mitocondriale e vacuolare, e altre caratteristiche fisiologiche che sono associati con l&#39;invecchiamento 3. Inoltre, le cellule madri potrebbero essere una popolazione iniziale per un ulteriore trattamento o manipolazione. Dato che le cellule madre e figlia sono fisicamente separati durante la procedura, le cellule figlie sono ancora disponibili per l&#39;analisi. Ad esempio, cambiamenti nelle caratteristiche fisiologiche delle cellule figlie o l&#39;eredità asimmetrica delle macromolecole danneggiate tra lievito madre e cellule figlie <sup&gt; 24 potrebbe essere paragonato a la tempistica di eventuali cambiamenti interessanti in mutazione frequenze / tariffe. Frequenze di mutazione per le popolazioni di cellule figlia potrebbero essere ottenuti anche per cercare di modellare se vi sia eredità asimmetrica di mutazioni durante l&#39;invecchiamento replicativo. In sintesi, combinando arricchimento delle cellule madri mediante cella magnetico classificare con test di fluttuazione consente i vantaggi della S. sistema modello cerevisiae da applicare in modo efficiente per indagare i meccanismi responsabili per l&#39;accumulo di cambiamenti genetici durante l&#39;invecchiamento cellulare mitotica.

I microrganismi, come il lievito Saccharomyces cerevisiae, sono ottimi modelli per indagare tassi di mutazione, ma questi modelli non sono stati pienamente utilizzati per studiare l&#39;accumulo di mutazioni durante l&#39;invecchiamento mitotica delle cellule. L&#39;accumulo di mutazioni nel genoma nucleare è stato ipotizzato di contribuire all&#39;invecchiamento dal conseguente progressiva perdita di (o variazione) funzioni geniche 1. La possibilità di utilizzare un sistema microbico per studiare i meccanismi e le conseguenze di accumulo di mutazioni durante l&#39;invecchiamento potrebbe accelerare notevolmente l&#39;identificazione di fattori genetici e ambientali che influenzano questo processo, a causa dei sistemi genetici facili e la facilità di quantificare rari cambiamenti fenotipici in microrganismi. Fattori di riparazione del DNA e le proteine ​​di risposta di danno del DNA sono ben conservati tra le specie diverse 2, e similitudini fondamentali dell&#39;invecchiamento organismal sono stati individuati per gli organismi diversi come S. cerevisiae und mammiferi 3, il che rende probabile che i risultati ottenuti da studi in lievito saranno rilevanti per l&#39;invecchiamento in molti organismi. Studi di affinamento in S. cerevisiae fare uso di due modelli di invecchiamento che misurano l&#39;invecchiamento cronologico o invecchiamento replicativo delle cellule. Invecchiamento cronologico è caratterizzata dalla progressiva perdita di vitalità in popolazioni di cellule di lievito che si trovano in uno stato (fase stazionaria) non-dividendo a causa di esaurimento degli elementi nutritivi 3. Il modello di invecchiamento cronologico è stato utilizzato per dimostrare che le mutazioni si accumulano con l&#39;aumentare di 4 anni, dal momento che le popolazioni di cellule di grandi dimensioni sono facilmente ottenuti in questo modello per eseguire le selezioni fenotipiche di cellule mutanti. In questo caso, l&#39;accumulo di mutazione sembra essere influenzato da percorsi di crescita di segnalazione e di stress ossidativo 5, e ciascuno di questi fattori è rilevante per la comprensione dell&#39;invecchiamento negli eucarioti multicellulari 3. Il modello di invecchiamento replicativo sfrutta l&#39;divisi asimmetricaon tra S. madre e figlia cellule cerevisiae per indagare l&#39;invecchiamento che si verifica con le generazioni di cellule successive 3. Lievito invecchiamento replicativo è stata spesso misurata attraverso la micromanipolazione di piccole popolazioni di madre e cellule figlie, o, più recentemente, attraverso il video microscopio di piccole popolazioni di cellule di lievito in dispositivi microfluidici 6,7. Dimensioni della popolazione limitati rendono questi approcci poco adatta per indagare l&#39;accumulo di mutazioni durante l&#39;invecchiamento mitotico a meno che le informazioni dell&#39;intero genoma è ottenuto da cellule singole o cambiamenti genetici molto ad alta frequenza sono misurati 8. Whole-sequenziamento del genoma di singole cellule fornisce set di dati sostanziali per indagare l&#39;accumulo di mutazione, ma sistemi di selezione fenotipica hanno l&#39;importante vantaggio di fornire un mezzo per misurare i tassi di mutazione per studiare i meccanismi alla base di accumulo mutazione. Studi per esaminare le frequenze di mutazione e tariffe attraverso selezioni fenotipiche in haploinon sono ancora stati segnalati ceppi di lievito d durante l&#39;invecchiamento replicativo. Tassi di mutazione sono comunemente misurati mediante test di fluttuazione 9. Valori di frequenza di mutazione riflettono il numero totale di cellule che ospitano una mutazione in una sequenza genica in una popolazione. Questo include celle in cui si verificano mutazioni indipendenti e tutte le progenie di quelle cellule che semplicemente ereditano mutazioni preesistenti. Al contrario, i tassi di mutazione misurati mediante test di fluttuazione rappresentano il numero di mutazioni indipendenti che di recente si presentano con ogni generazione cellulare. Questi test coinvolgono tipicamente inoculando molte culture ripetute a densità cellulari bassa per ridurre la probabilità di aggiunta di cellule con preesistenti mutazioni in una sequenza bersaglio, in crescita le culture nei pressi di saturazione, e identificare le cellule mutanti dalla crescita su terreno selettivo. Il numero di cellule mutanti identificati nelle popolazioni replicati vengono poi utilizzati in uno dei diversi modelli matematici per stimare il numero di imutazioni INDIPENDENTI sorti durante la crescita 9. Confrontando il numero di mutazioni indipendenti per la dimensione media della popolazione fornisce una misura del tasso di mutazione. In S. cerevisiae, frequenze di mutazione e le tariffe sono spesso misurata utilizzando i geni URA3 e CAN1, poiché la perdita-di-funzione mutazioni in questi geni producono fenotipi selezionabili. La perdita della funzione URA3 rende le cellule resistenti a 5-fluoroorotic acido (5-FOA), poiché la proteina codificata da URA3 converte 5-FOA in una molecola tossica 10. La perdita della funzione di CAN1 permette alle cellule di diventare resistente ad canavanina, un analogo arginina tossico, dal momento che la proteina codificata da CAN1 trasporta arginina e canavanina in cellule 11. Entrambe le strategie di ordinamento genetici e fisici sono stati impiegati con successo per ottenere più grandi popolazioni di S. cellule madri cerevisiae che facilitano le indagini di invecchiamento replicativo. Strategie genetici includono approcci intelligenti che selezionano contro la sopravvivenza cellula figlia in una popolazione. Il programma di arricchimento madre (MEP) comporta l&#39;induzione beta-estradiolo di espressione ricombinasi Cre solo nelle cellule figlie, che porta alla rottura specifico-figlia di due geni essenziali che sono stati progettati per contenere siti loxP 12. Ceppi MEP possono essere coltivate normalmente in assenza dell&#39;induttore, ma solo le cellule madri continueranno a dividersi dopo induzione, mentre cellule figlie arresteranno a M-fase tipicamente durante il primo progressione attraverso il ciclo cellulare 12. Anche se questo sistema non è stato utilizzato per studiare ampiamente accumulo mutazione durante l&#39;invecchiamento, è stato utilizzato per studiare la perdita di eterozigosi, una forma relativamente frequente di instabilità del genoma in ceppi di lievito diploidi, così come i cambiamenti biochimici nelle cellule madri invecchiamento 13,14. Allo stesso modo, il sistema di figlia-scaricatore comporta-specifico espressione figlia del S. cerevisiae URA3 gene 15. Ceppi Figlia-scaricatore crescono normalmente fino a 5-FOA viene aggiunto al mezzo, in cui le cellule che esprimono URA3 punto figlie moriranno, mentre le cellule madri continuano a crescere 15. Sono sistemi utili per arricchire di cellule madri, ma dipendono mantenimento delle funzioni geniche che costituiscono il sistema di selezione. Mutazioni casuali in uno o più componenti del sistema di selezione potrebbe tradursi in cellule figlie che sfuggono la selezione e proliferano in maniera esponenziale. Durante lo sviluppo dei ceppi MEP, le dimensioni della popolazione appropriate erano determinati a evitare la comparsa di cellule figlie mutanti che potrebbero sfuggire la selezione 12. Tuttavia, questo limite di dimensione della popolazione compromette l&#39;individuazione di forme rare di genoma instabilità durante l&#39;invecchiamento replicativo. Questa restrizione sulla dimensione della popolazione potrebbe essere in parte superato utilizzando ceppi di lievito diploidi con due copie di ogni gene contribuisce al sistema di selezione, poiché la maggior partemutazioni sarebbero probabilmente recessivo 12. Tuttavia, l&#39;uso di ceppi diploidi vincola i tipi di eventi mutazionali che possono essere facilmente rilevabili rispetto a quelli che possono essere facilmente individuati in cellule di lievito aploidi. Strategie fisiche smistamento comprendono l&#39;isolamento di cellule madri con una superficie cellulare etichettata cellule figlie senza etichetta per arricchire di grandi popolazioni di cellule madri. L&#39;osservazione che le proteine ​​della superficie cellulare (proteine ​​di parete) di S. cellule figlie cerevisiae sono state recentemente sintetizzate durante germogliamento è stato sfruttato per etichettare le cellule madri senza etichettare le cellule figlie che producono 16. Per esempio, una popolazione iniziale di cellule di lievito etichettati sulla loro superficie con biotina può coltivare e poi isolata dal loro cellule figlie utilizzando microsfere anti-biotina e magnetico smistamento 16 perché le cellule figlie generate dalla popolazione iniziale non conterranno biotina sulla loro superficie . Crescita seriale eordinamento consente popolazioni progressivamente più vecchie di cellule madri di ottenere e analizzati. Questa procedura è stata utilizzata con successo per esaminare i cambiamenti nella fisiologia cellulare e l&#39;espressione genica durante l&#39;invecchiamento replicativo di lievito 13,14,17,18. Il metodo attuale si adatta questa etichettatura biotina e cernita magnetica per arricchire di cellule madri con lo scopo di misurare l&#39;accumulo di mutazioni potenzialmente rare o di altre forme di instabilità del genoma analizzati attraverso selezioni fenotipiche. Crescita seriale e smistamento fisica consentono l&#39;analisi di accumulo di mutazioni in cellule madri progressivamente più anziani, così come nelle loro popolazioni di cellule figlie. Determinazione dei tassi di mutazione per generazione consente una frequenza di mutazione previsto da calcolare per le cellule madri che hanno subito un particolare numero di divisioni cellulari. Poiché i valori di frequenza attesi sono basati sul previsto aumento a causa di turni aggiuntivi di divisione cellulare, scostamenti sostanziali nei mutati osservatisu frequenze rispetto ai valori previsti fornire la prova per le modifiche specifiche per età del tasso di mutazioni si accumulano. Usando questo protocollo, colorazione fluorescente di cicatrici gemma che corrispondono ai siti di divisioni cellulari in cellule madri accoppiate con l&#39;analisi mediante citometria a flusso può essere utilizzato per determinare rapidamente la distribuzione per età delle popolazioni ordinati e non ordinati. Reagenti fluorescenti aggiuntivi, come ad esempio quelli utilizzati per il rilevamento di specie reattive dell&#39;ossigeno, possono essere utilizzati anche durante questo protocollo. Nel complesso, questo protocollo consente l&#39;analisi efficiente dei cambiamenti età-dipendenti genoma instabilità con il potenziale di correlazione legate all&#39;età cellulari cambiamenti fisiologici in un organismo modello ben si adatta allo studio dei fattori genetici e ambientali che influenzano l&#39;instabilità del genoma di invecchiamento legati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:359px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:108px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21335</td>
			<td style="width:359px;">100mg</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Biotin Microbeads</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-485</td>
			<td style="width:359px;">2ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACS LS columns</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td style="width:359px;">25 columns suitable for QuadroMACS separator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QuadroMACS separator</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td style="width:359px;">Separator Only</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">QuadroMACS Starting Kit</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-051</td>
			<td style="width:359px;">Includes:&#160; QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15ml Tube Rack (130-091-052), One 2ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BD Falcon Cell Strainer, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:108px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:359px;">40 &#181;m for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes.&#160; 50 per pack</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td style="width:359px;">Powder, filtering after dissolving important to remove particulates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">W11261</td>
			<td style="width:359px;">Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P36930</td>
			<td>10 ml, other antifade reagents could also be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining magnetic sorting of mother cells and fluctuation tests to analyze genome instability during mitotic cell aging in saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae è stato un ottimo sistema modello per l&#39;esame dei meccanismi e delle conseguenze di instabilità del genoma. Le informazioni ottenute da questo modello di lievito è rilevante per molti organismi, compresi gli esseri umani, dal momento che i fattori di riparazione del DNA e di risposta danno al DNA sono ben conservati tra le specie diverse. Tuttavia, S. cerevisiae non è stata ancora utilizzata per affrontare pienamente se il tasso di accumulare mutazioni cambia con l&#39;aumentare replicativa (mitosi) età a causa di vincoli tecnici. Ad esempio, le misure di lievito durata replicativa tramite micromanipolazione coinvolgono molto piccole popolazioni di cellule, che vietano la rilevazione di mutazioni rare. Sono stati sviluppati metodi genetici per arricchire di cellule madri nelle popolazioni inducendo la morte delle cellule figlie, ma le dimensioni della popolazione sono ancora limitati dalla frequenza con cui si verificano mutazioni casuali che compromettono i sistemi di selezione. Il protocollo attuale si avvale di Sorti magneticong di cellule madri lievito superficie marcato per ottenere abbastanza grandi popolazioni di invecchiamento cellule madri di quantificare mutazioni rare le selezioni fenotipiche. Tassi di mutazione, misurata attraverso test di fluttuazione, e le frequenze di mutazione sono in primo luogo stabilito per i giovani e le cellule utilizzati per predire la frequenza delle mutazioni in cellule madri di varie età replicative. Frequenze di mutazione sono poi determinati per cellule madri ordinati, e l&#39;età delle cellule madri è determinata in citometria a flusso da colorazione con un reagente fluorescente che rileva cicatrici gemma formate sulla loro superficie delle cellule durante la divisione cellulare. Confronto delle frequenze di mutazione previste in base al numero di divisioni cellulari alle frequenze osservate sperimentalmente per le cellule madri di una determinata età replicativa può quindi identificare se ci sono cambiamenti legati all&#39;età nel tasso di mutazioni si accumulano. Variazioni di questo protocollo di base forniscono i mezzi per studiare l&#39;influenza delle alterazioni nelle funzioni geniche specifiche ocondizioni ambientali specifiche in materia di accumulo mutazione ad affrontare i meccanismi alla base del genoma instabilità durante l&#39;invecchiamento replicativo.

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Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Tassi di mutazione nei giovani Saccharomyces cerevisiae cellule misurati mediante test di fluttuazione vengono utilizzati per prevedere le frequenze di mutazione di cellule madri di età diverse replicative. Ordinamento magnetico e citometria a flusso vengono poi utilizzati per misurare le frequenze di mutazione effettivi e l&#39;età delle cellule madri per individuare eventuali scostamenti dalle frequenze di mutazione previste.

La combinazione di ordinamento magnetico di cellule madri e test di fluttuazione per analizzare genoma instabilità mitotica Durante l&#39;invecchiamento cellulare in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

combining-magnetic-sorting-mother-cells-fluctuation-tests-to-analyze

Research

JoVE Journal

Biology

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

12.4K Views.  Rensselaer Polytechnic Institute.  Tassi di mutazione nei giovani Saccharomyces cerevisiae cellule misurati mediante test di fluttuazione vengono utilizzati per prevedere le frequenze di mutazione di cellule madri di età diverse replicative. Ordinamento magnetico e citometria a flusso vengono poi utilizzati per misurare le frequenze di mutazione effettivi e l'età delle cellule madri per individuare eventuali scostamenti dalle frequenze di mutazione previste. 

Video: Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissezione di Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

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Biologia

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Fosfoproteomica quantitativa in acidi grassi Stimolati Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Vescicole lipidiche-mediata Cromatografia di affinità mediante Magnetic separazione delle cellule attivate (LIMACS): un nuovo metodo per l&#39;analisi delle interazioni proteina-lipide

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

Studiare età-dipendente instabilità genomica utilizzando il S. Saccharomyces Modello Durata cronologica

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Diretto Evolution Metodo<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Creazione e screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).