Presentiamo un metodo per generare cellule T multipotenti derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo, specifiche dell'antigene tumorale CD8 alpha beta single-positive utilizzando il sistema di co-coltura OP9-Delta-1. Questo metodo è un potente strumento per la generazione di cellule T in vitro e faciliterà lo sviluppo di cellule T derivate in vitro per l'uso in medicina rigenerativa e terapie a base cellulare. Può anche essere adattato per la generazione di altri linfociti, come le cellule NK.
Quando si esegue questa tecnica, è importante pre-valutare il lotto di FBS e passare le cellule OP9-Delta-1 in modo coerente quando il contatto citoplasmatico da cellula a cellula inizia a prevenire la differenziazione cellulare e la senescenza. A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Meghan Good, un'oncologica chirurgica del mio team. Inizia controllando le colonie iPSC umane in un microscopio stereo e rimuovi qualsiasi aree di differenziazione dalla coltura con il bordo plastico di una punta di pipetta da 200 microliter.
Quando le colonie raggiungono da 0,8 a 1,2 millimetri di diametro, passare gli iPSC umani. Aspirare i supporti spesi e aggiungere 10 millilitri di mezzi iPSC umani integrati con inibitore ROCK a 10 micromolari. Arrotolare uno strumento di passaging a celle usa e getta su tutto il piatto in un'unica direzione, assicurandosi di mantenere una pressione uniforme e che l'intera lama del rullo tocchi il piatto da coltura.
Ruotare il piatto di coltura di 90 gradi e ripetere il rotolamento. Confermare visivamente il corretto taglio delle colonie con un microscopio. Dovrebbero apparire a scacchi.
Quindi, staccare le colonie tagliate con un delicato lavaggio meccanico con una pipetta da 200 microliter. Stima visivamente il numero di grumi di colonia e trasferisci tra 350 e 600 ciuffi in un nuovo piatto di 10 centimetri di fibroblasti embrionali di topo con 10 millilitri di mezzi iPSC umani freschi integrati con inibitore ROCK. Incubare il piatto durante la notte a 37 gradi Celsius.
Il giorno dopo, aspira i media spesi e aggiungi 10 millilitri di nuovi supporti iPSC umani. Cambiare il supporto ogni uno o due giorni, a seconda del tasso di crescita cellulare. Coltura delle celle OP9-Delta-1 nei supporti OP9 a 37 gradi Celsius.
Quando raggiungono la confluenza, aspirano il supporto e lavano le cellule una volta con cinque millilitri di magnesio 1x, calcio e PBS privo di rosso fenolo. Aspirare il PBS, aggiungere due millilitri dello 05% di tripside-EDTA e incubare le cellule per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere quattro millilitri di supporti OP9 e dissociare meccanicamente lo strato cellulare mediante pipettazione.
Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri attraverso un colino a celle da 100 micrometri e centrifugare a 300 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in 12 millilitri di supporti OP9. Aggiungere otto millilitri di supporti OP9 a ciascuno dei sei nuovi piatti di coltura cellulare e placcare due millilitri della sospensione cellulare OP9-delta-1 su ogni piatto.
Dondolare il piatto da un lato all'altro e da davanti a dietro per garantire una distribuzione uniforme delle cellule. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e ripetere il passaggio quando le cellule raggiungono la confluenza. Prepara piatti gelatinizzati OP9-Delta-1 una settimana prima della co-coltura con iPSC umani.
Aggiungere quattro millilitri di gelatina allo 0,1% a tre nuovi piatti di coltura cellulare e incubarli per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aspirare la gelatina e aggiungere otto millilitri di mezzi OP9 ad ogni piatto. Passare un piatto confluente di cellule OP9-Delta-1 a tre piatti rivestiti di gelatina.
Dopo quattro giorni, aggiungere 10 millilitri di supporti OP9 a ogni piatto di cellule, per un totale di 20 millilitri di media per piatto. Inizia la co-coltura iPSC umana su piatti confluenti OP9-Delta-1 da sette a otto giorni dopo aver passato le cellule. Aspirare i supporti da un piatto confluente di iPSC umani e aggiungere 10 millilitri di supporti OP9.
Tagliare e staccare colonie cellulari utilizzando uno strumento di passaging cellulare usa e getta e trasferire da 350 a 600 ciuffi di colonie tagliate su un piatto OP9-Delta-1 pre-gelatinizzato con 10 millilitri di supporti OP9 freschi. Dondola il piatto della cultura da un lato all'altro e da un lato all'altro per garantire una distribuzione uniforme delle colonie. Il giorno dopo, aspira i supporti spesi e sostituiscilo con 20 millilitri di nuovi supporti OP9.
I grumi umani iPSC co-coltivati su OP9-Delta-1 per un giorno dovrebbero apparire come piccole colonie rotonde e monostrato. Il quinto giorno, aspira 10 millilitri di supporti spesi e aggiungi 10 millilitri di supporti OP9 freschi. Le colonie inizieranno a differenziarsi in mesoderma primitivo, che è caratterizzato da un centro scuro multistrato.
Ripeti questo processo il primo giorno, a quel punto le strutture del centro multistrato si evolveranno in forme simili a cupole. Raccogli le cellule progenitrici ematopoietiche il giorno 13, a quel punto le strutture sono composte da un organoide centrale scuro circondato da una rete di aree simili a cupole. Aspirare il supporto e lavare le cellule una volta con cinque millilitri di soluzione salina bilanciata di Hanks senza fenolo 1x con calcio e magnesio, o HBSS.
Dopo il lavaggio, aggiungere 250 microlitri da 5.000 unità per millilitro collagenasi IV a 10 millilitri di HBSS. Aggiungere la miscela alle cellule e incubarle a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Aspirare la miscela HBSS-collagenasi e lavare le cellule una volta con cinque millilitri di PBS.
Dopo il lavaggio con PBS, aggiungere cinque millilitri dello 0,25% di tripside-EDTA e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi, aggiungere quattro millilitri di supporti OP9 e dissociare lo strato cellulare pipettando per effettuare una sospensione a cella singola. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri attraverso un colino di 100 micrometri e centrifugare il tubo a 300 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in 10 millilitri di supporti OP9. Placcare la sospensione cellulare su un nuovo piatto di coltura cellulare gelatinizzato di 10 centimetri e incubarli a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Quindi, raccogliere eventuali cellule non aderenti mediante pipettazione delicata.
Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri attraverso un colino e centrifugare come descritto in precedenza. Quindi, aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in 10 millilitri di mezzi di differenziazione. Placcare la sospensione cellulare su un nuovo piatto confluente OP9-Delta-1.
Passa le celle il giorno 16 secondo le indicazioni manoscritte e continua a passare le celle non aderenti ogni cinque o sette giorni dopo. Dopo 35 giorni di differenziazione, arricchire la popolazione cellulare cd4-positiva con l'isolamento del tallone magnetico CD4 secondo il protocollo del produttore. Quindi, resospend le cellule in mezzi OP9 e placcare un millilitro di sospensione cellulare in ogni pozzo di una coltura tissutale, fondo piatto, piastra a 24 pozzetti di OP9-Delta-1 confluente.
Stimola le cellule aggiungendo 100 unità internazionali di IL-2 umano, cinque nanogrammi di IL-7 umano, 500 nanogrammi di anticorpi CD3 anti-umani e due microgrammi di anticorpi CD28 anti-umani per ogni pozzo. Dopo quattro o sette giorni, le cellule possono essere raccolte per ulteriori analisi. Dopo la coltura su OP9-Delta-1 non gelatinizzato in presenza di fattore di cellule staminali umane, ligando FLT3 umano e interleuchina-7 umana, progenitori ematopoietici differenziati in cellule di lignaggio T cd3, CD7, CD4 e CD8, la maggior parte dei quali esprimeva recettori cellulari T specifici dell'epitopo MART1.
Quando il CD4, le cellule T double-positive CD8 sono state stimolate con anticorpi anti-umano CD3 e CD28 in presenza di interleuchina umana-7 e 2, il numero di cellule mono-positive CD3-positive CD8 alpha beta è aumentato e è rimasto specifico per l'epitopo MART1, confermando la conservazione della loro specificità antigene ereditata. Un saggio di ELISpot ha rivelato che se coltivate in presenza di peptide MART1, le cellule T cd8 alfa beta mono-positive derivate da iPSC umano secernono quantità più elevate di gamma di interferone rispetto alle cellule T alfa alfa alfa mono-positive sia in massa che CD8. Non è stata rilevata alcuna espressione gamma di interferone solo per le cellule T e le cellule che presentano antigeni, dimostrando che le cellule T derivate da T-iPSC umano sono specifiche dell'antigene e funzionali.
Un passo importante in questo metodo è l'arricchimento delle perline magnetiche CD4 per eliminare le cellule doppio-negative CD4-negative CD8-negative, che possono causare l'uccisione diretta di cellule doppio positivo al momento della stimolazione. Questa tecnica è applicabile per l'uso con diverse fonti di cellule umane, tra cui cellule staminali ematopoietiche e cellule staminali embrionali. Le cellule T immature derivate dall'iPSC generate da questo metodo potrebbero essere ulteriormente migliorate per la generazione di cellule T ingene-simili all'antigene tumorale umano mature per un futuro uso terapeutico.
Dopo aver visto questo video, lo spettatore dovrebbe capire come generare cellule T cd8 alfa beta alfa alfa derivate da iPSC umane utilizzando il sistema di co-coltura OP9-Delta-1.
