L'obiettivo generale di questo saggio, è quello di preparare macrofagi e globuli rossi opsonizzati per la visualizzazione della fagocitosi mediante microscopia tridimensionale time lapse. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come come fanno i fagociti a catturare e ingerire particelle. Questa tecnica consente la visualizzazione dell'assorbimento delle particelle in tempo reale, a differenza dei test più tradizionali del punto finale che consentono solo la valutazione se ma non come, una particella è stata ingerita.
Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo possono avere difficoltà fino a quando non si abituano alle procedure di isolamento cellulare. Abbiamo avuto l'idea per la prima volta di questo metodo quando ci siamo resi conto dei vantaggi di girare questa microscopia confocale per l'imaging time-lapse 3D della fagocitosi. Per isolare i macrofagi peritoneali, posizionare un catetere di plastica calibro 24 nel peritoneo di un topo di tre o quattro mesi e utilizzare una siringa di plastica da cinque millilitri per lavare la cavità due volte con 4,5 millilitri di HBSS ghiacciato senza calcio e magnesio per lavanda.
Trasferimento della sospensione aspirata in un tubo inferiore rotondo in polipropilene da 14 millilitri durante la raccolta. Quando entrambi i campioni sono stati raccolti, centrifugare l'aspirato e rimescolare le cellule peritoneali in un millilitro di mezzo RPMI 1640 privo di bicarbonato completo per ottenere circa sei per 10 alla sesta concentrazione di millilitro. Successivamente, per pre-riempire le diapositive aggiungere un millilitro di HEPES completo integrato medio-un serbatoio di uno scivolo a canale rivestito di fibronectina e inclinare il vetrino per consentire l'aspirazione del mezzo dal serbatoio a valle.
Per rimuovere le bolle d'aria indesiderate, aggiungere da uno a due millilitri di mezzo fresco a uno dei due serbatoi e applicare saldamente un tappo del serbatoio. Quindi applicare la pressione ritmica del pollice sul cappuccio per pompare l'aria fuori dalla diapositiva, inclinando lo scivolo se necessario. Quando tutta l'aria è stata espulsa, inclinare lo scivolo verso il mezzo non conciato contenente il serbatoio e rimuovere il tappo per evitare che l'aria venga risucchiata nel canale.
Ora pipettare la soluzione cellulare un paio di volte per ridurre l'accumulo e aggiungere 100 microlitri delle cellule in un canale dello scivolo per un'incubazione di due ore in una camera umida a 37 gradi celsius in assenza di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione sostituire l'HEPES contenente il mezzo in ogni diapositiva con mezzo integrato bicarbonato completo come appena dimostrato. Quindi posizionare le cellule in un incubatore umido di 37 gradi celsius con anidride carbonica del 5% per la loro coltura notturna.
La mattina seguente trasferire un millilitro di sangue donatore sano appena ottenuto in un tubo di microcentrifugo in polipropilene rotondo a due millilitri. Quindi centrifugare il campione. Rimuovere il mantello al plasma e buffy contenente supernatante.
E trasferire con cura 100 microlitri dei globuli rossi sedimentati in un tubo di mircocentrifuge a due millilitri contenente 100 microlitri di mezzo completo integrato hepes. Etichettare il tubo 1:1 e trasferire quattro microlitri dei globuli rossi diluiti in un nuovo tubo microcentrifugo a due millilitri contenente due millilitri di mezzo completo integrato hepes. Quindi etichettare questo tubo 4:2000 e posizionare entrambi i tubi campione di globuli rossi diluiti sul ghiaccio.
Per etichettare i macrofagi peritoneali sostituire il mezzo bicarbonato in ogni diapositiva del canale con mezzi completi integrati con HEPES. Quindi inclinare la diapositiva per consentire l'aggiunta di 100 microlitri dell'anticorpo specifico del macrofago del topo contrassegnato fluorescentmente di interesse all'apertura del canale di 100 microlitri della diapositiva. Aspirare il mezzo che scorre nel serbatoio a valle e incubare le cellule per 20 minuti in una camera umida a 37 gradi celsius in assenza di anidride carbonica.
Mentre le cellule peritoneali vengono etichettate mescolare delicatamente il campione di globuli rossi 4:2000 e trasferire 400 microlitri delle cellule in un nuovo tubo di microcentrifugo a due millilitri, in un blocco di alluminio riscaldato all'interno di una cappa di flusso laminare per circa cinque-otto minuti. Quando le cellule si sono riscaldate a 37 gradi celsius mescolare 0,4 microlitri di un'appropriata macchia di membrana plasmatica fluorescente rossa con le cellule. Quindi riposizionare le celle nel blocco di calore.
Dopo cinque minuti lavare le cellule aggiungendo 1,6 millilitri di HEPES fresco integrato mezzo completo e centrifuga. Ruotare il tubo per identificare il pellet di globuli rossi. Utilizzando la punta della pipetta da uno a 1,5 millilitri rimuovere con cura il supernatante in due volumi senza disturbare il pellet e mescolare 2000 microlitri di HEPES fresco integrato con il mezzo completo con le celle.
Centrifugare e sospendere di nuovo il pellet in 400 microlitri di mezzo. Quindi etichettare il tubo PMS per la macchia di membrana plasmatica. Al termine dell'incubazione peritoneale di 20 minuti per l'etichettatura delle cellule lavare lo scivolo con un millilitro di mezzo fresco completo integrato hepes.
Per opsonizzare i globuli rossi aggiungere un microlitro di anticorpo cd235A monoclonale IGG2B del topo al tubo campione PMS. Dopo otto minuti a 37 gradi celsius con miscelazione una volta al minuto trasferire 100 microlitri della membrana plasmatica macchiato IGG opsonizzato globuli rossi umani al macrofago peritoneale contenente scorrimento del canale. Non appena i globuli rossi umani sono stati aggiunti montare la diapositiva su un microscopio confocale disco rotante.
Con l'incubatore di palcoscenico impostato a 37 gradi celsius e iniziare immediatamente a immaginare le cellule. L'imaging 3D time lapse di macrofagi fluorescenti verdi presentati con globuli rossi fluorescenti rossi consente la visualizzazione di eventi fagocitici a singola particella. Ad esempio, si può osservare la cattura di un topo IGG opsonizzato globuli rossi umani da un filopodio macrofago.
Così come, la spremitura di un globulo rosso umano durante la formazione di coppe fagocitiche. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come isolare i macrofagi peritoneali residenti nel mouse, le cellule etichettate fluorescentmente e le particelle opsonizzate.
