Gli autori ringraziano il personale della struttura animale (BRC) per il loro sostegno continuo. Questo lavoro è stato finanziato dal National Health and Medical Research Council e dal Australian Research Council.

Tutte le procedure sono state approvate dall&#39;Università del Nuovo Galles del Sud. 1. Preparazione del transgene (integrazione casuale) <ol><li> Elettroforesi analizzante per gel agarosio. <ol><li> Digestare il plasmide per accise il transgene usando enzimi appropriati (1 h di incubazione) o enzimi digestivi (15-30 minuti di incubazione) in un termociclista seguendo le raccomandazioni del produttore (vedere la figura 2A e la sua leggenda). </li><li> Condurre un agarosio di 1% di tris-acetato-etilendiammeto-tetraacetico (EDTA) (TEA), colorato con 0,5-1,0 μg / ml di etidio bromuro (EtBr). NOTA: usare cautela quando si utilizza EtBr; È un mutageno potente. Utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale (consultare la scheda di sicurezza dei materiali). </li><li> Caricare un marker molecolare di 1 kb. </li><li> Caricare i frammenti linearizzati ( cioè transgene e spina dorsale). </li&gt; <li> Eseguire l&#39;elettroforesi a 100 V per 45 minuti. </li><li> Visualizzare il gel su un transilluminatore ultravioletto (UV) per verificare che la digestione sia completa e confermare la giusta dimensione del transgene ( vale a dire 7.338 bp; vedere la figura 2A ). </li></ol></li><li> Elettroforesi preparato con agarosio gel. <ol><li> Portare un gel agarosico di TAE 1% macchiato con una macchia di gel a bassa tossicità. Caricare 8 aliquote (1 μg ciascuna) di transgene linearizzato senza marcatore di peso molecolare e eseguire l&#39;elettroforesi a 100 V per 45 minuti. Utilizzare un bisturi per accise tutte le 8 bande corrispondenti al transgene linearizzato. </li><li> Estrarre il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel seguendo le raccomandazioni del produttore (vedere la tabella dei materiali ). <ol><li> Sciogliere i frammenti di gel a 50 ° C in tubi da 1,5 ml per almeno 15 minuti. Precipitare con isopropanolo e quindi aggiungere il tampone di legame. </li><li> Combina l&#39;intero DNA pipettandolo tutto in una colonna. Eluire nel tampone di microinjection senza nucleasi (8 mM Tris-HCl e 0,15 mM EDTA). Filtrare attraverso un filtro da microfiltrazione da 0,22 μm e centrifugare per 60 s a 12,000 x g. </li></ol></li><li> Misurare la concentrazione e la qualità del DNA utilizzando uno spettrofotometro. Controllare che il rapporto A260 / A280 sia di circa 1,8 ( cioè, nessuna contaminazione da proteine) e il rapporto A260 / A230 sia almeno 2,0 ( cioè nessuna contaminazione da solventi organici). Diluire fino a 3 ng / μl in tampone di microinjection privo di nucleasi, aliquota (20-50 μL) e congelare a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Sintesi dei componenti CRISPR (targeting del gene) <ol><li> Cas9 mRNA. <ol><li> Diluire l&#39;mRNA Cas9 (ottenuta da una fonte commerciale, vedere la Tabella dei Materiali ) ad una concentrazione di 1 μg / μl in tampone di microinjection privo di nucleasi. </li><li> Aliquota in 2 μL e libera<html> Ze a -80 ° C. </li></ol></li><li> Single-guide RNA (SgRNA). <ol><li> Identificare le sequenze genomiche a due bersodi (guide) usando uno strumento di progettazione computazionale che consenta l&#39;attività minima potenziale fuori bersaglio 17 . <ol><li> Per il knockout genico, selezionare sistematicamente due guide situate in centinaia di coppie di base (bp), in direzioni opposte, e includere il codone iniziale del gene di interesse. Per la riparazione diretta dell&#39;omologia, selezionare due guide sovrapposte (ove possibile), in direzioni opposte. NOTA: ad esempio, le seguenti guide sono state recentemente co-iniettate per interrompere il primo esone del gene TPM4.2 : Guida 1: 5 &#39;CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3&#39;; Guida 2: 5 &#39;CAGAACGATTGAGCTATGGC 3&#39; </li></ol></li><li> Ordinare un insieme di primer come descritto nella tabella 1 . </li><li> Sintetizzare un modello DNA lineare. <ol><li> Dilute px330Ref &quot;&gt; 12 plasmidi a 10 ng / μl in acqua priva di nucleasi. </li><li> Preparare il mix master come indicato nella tabella 1 . Aggiungere la polimerasi alla fine e mantenere il mix master sul ghiaccio. </li><li> Mescolare e suddividere questo in 8 tubi PCR (19 μL / tubo). Aggiungere 1 μL di px330 per tubo e eseguire il PCR nelle seguenti condizioni: 1 min a 98 ° C; 40 cicli di 98 ° C per 10 s, 64 ° C per 30 s e 72 ° C per 15 s; E un allungamento finale a 72 ° C per 5 min. Tenere a 4 ° C. </li><li> Purificare i prodotti PCR utilizzando un kit di purificazione PCR (vedi tabella dei materiali ), un collettore e una sorgente di vuoto (per una più veloce elaborazione). Applicare la forza di vuoto massima ( vale a dire, 8 mbar). <ol><li> Aggiungere 5 volumi (100 μL) di buffer di legame a 1 volume del campione PCR e mescolare. </li><li> Posizionare una colonna di spin di membrana di silice (in dotazione) in un tubo di raccolta da 2 mL fornito (per la centrifugazione) o sul collettore per il processo di vuotoing. Per legare il DNA, successivamente applicare tutti e 8 i campioni alla colonna e sottovuoto o centrifugare per 60 s a 12.000 xg per ogni carico. </li><li> Per lavare, aggiungere 0,75 ml di tampone di lavaggio (tampone PE) alla colonna e sottovuoto o centrifugare per 60 s a 12.000 x g. Centrifugare la colonna per 60 s a 12.000 xg per eliminare l&#39;etanolo residuo. </li><li> Collocare la colonna in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Per eluire il DNA, aggiungere al centro della membrana 30 μL di acqua priva di nucleasi, lasciare la colonna per 1 min e centrifugare per 60 sec a 12.000 g. </li></ol></li><li> Misurare la concentrazione usando uno spettrofotometro; Tipicamente, la concentrazione dovrebbe essere di 100 ng / μL o superiore. Controllare che il rapporto A260 / A280 sia di circa 1,8 ( cioè, nessuna contaminazione da proteine) e il rapporto A260 / A230 sia almeno 2,0 ( cioè nessuna contaminazione da solventi organici). </li></ol></li><li> Trascrizione in vitro utilizzando un kit di sintesi T7 RNA. <ol><li> Preparare tMasterizzare come indicato nella tabella 1 e incubare per 3 ore a 37 ° C in un termociclatore. Aggiungere 28 μl di acqua priva di nucleasi e 2 μL di DNasi I e incubare per altri 15 minuti a 37 ° C in un termociclatore. </li></ol></li><li> RNA purificazione utilizzando colonne di spin. <ol><li> Sciogliere la polvere contenuta nella colonna di centrifuga fornita in 650 μl di tampone di microinjection senza nucleasi, rimuovendo con attenzione tutte le bolle d&#39;aria. Coprire il tubo e l&#39;idrato per 5 - 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il tappo blu in basso e collocare la colonna in un tubo da 2 ml. Centrifugare per 2 min a 750 xg e temperatura ambiente. Collocare la colonna in un nuovo tubo da 1,5 ml e applicare 50 μL di soluzione RNA in goccia al centro senza toccare la parete della colonna. Spin la colonna per 2 minuti a 750 x g. </li><li> Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro (la resa tipica di una reazione è di 30-50 μg). Controllare che il rapporto A260 / A280 sia aIl tondo 2,0 ( cioè, nessuna contaminazione da proteine) e il rapporto A260 / A230 è almeno 2,0 ( cioè nessuna contaminazione da solventi organici). Conservare i sgRNA a -80 ° C fino all&#39;uso. </li><li> Valutare la qualità dell&#39;RNA utilizzando i gel TAE dell&#39;1% usati normalmente per l&#39;elettroforesi del DNA. Eseguire 200-400 ng del modello DNA e il corrispondente sgRNA in parallelo. La banda RNA (≈ 100 bp) dovrebbe essere leggermente più grande della fascia del DNA (vedi figura 3A ). </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Modello del donatore <ol><li> Ordinare oligonucleotidi a singolo filamento sintetizzato commercialmente (ssOligos, vedere la tabella dei materiali ) per mutazioni puntuali o per l&#39;integrazione di piccole sequenze fino a 50 bp; Le armi di omologia sono tipicamente 60-90 bp lunghe. </li><li> Per gli inserimenti più grandi, utilizzare un plasmide donatore come modello. Generare un plasmide adatto utilizzando il metodo classico di clonazione o la sintesi de novo da unFonte commerciale. NOTA: Si consiglia un minimo di 800 bp per braccio di omologia. La dimensione della spina dorsale non ha alcuna influenza sull&#39;efficienza della riparazione diretta dell&#39;omologia (HDR). </li></ol> 4. Mix di iniezione <ol><li> Diluire l&#39;mRNA di Cas9 a 50 ng / μL e gli sgRNA a 12,5 ng / μL (25 ng / μL in totale) utilizzando tampone di microinezione privo di nucleasi per esperimenti di eliminazione dei geni. Aggiungere il template del donatore (ssOligo o plasmide) ad una concentrazione di 200 ng / μL per esperimenti di modifica del genoma basati sulla riparazione diretta dell&#39;omologia. NOTA: I volumi di diluizione possono essere facilmente determinati utilizzando strumenti online, come un calcolatore di resuspension 18 . </li><li> Tenere ogni aliquota sul ghiaccio durante la seduta di microinjection e scartare dopo (non ri-congelare il mix di iniezione). </li></ol> 5. Vasectomia Scrotal NOTA: due tipi di vasectomia vengono comunemente eseguiti nei topi: addominali e scrotal. L&#39;ultimoÈ meno invasivo e è stato precedentemente descritto 15 . <ol><li> Autoclave tutti gli strumenti chirurgici in acciaio inox. </li><li> Determinare il peso del mouse utilizzando una scala di peso e anestetizzare i maschi mediante iniezione intraperitoneale (ip) con anestetici iniettabili (ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg). </li><li> Monitorare la perdita del riflesso del pizzico del piede e una volta che il topo è sedato, posizionarlo sopra un tappetino di riscaldamento. </li><li> Disinfettare la pelle intorno ai testicoli con salviette alternate di antisettico topico come la clorexidina e il 70% di etanolo. </li><li> Spingere i testicoli nel sac scrotal e fare un&#39;incisione cutanea con un bisturi. </li><li> Visualizzare il testis, cauda epididymis e vas deferens. </li><li> Afferrare i vas deferens con le pinze, tenerlo e cauterizzare su ogni lato della pinza per rimuovere 3 mm dei vas deferens. </li><li> Eseguire la stessa procedura sul secondo testicolo. </li><li> Chiudere le incisioni della pelle con le clip della ferita e controllareTopo da vicino fino al completo recupero. </li></ol> 6. Superovulazione (donatori di Oociti) e Time-accoppiamento (Pseudo-pregnant Females) NOTA: è stata descritta altrove la tecnica per generare un numero adeguato di ovociti fecondati e femmine da femmine collegate per la reimplantazione. <ol><li> Iniettare 10 femmine ip con 5 IU di gonadotropina sierica (PMSG) in mare di gravidanza, in circa 100 μL, intorno alle 12 del giorno 1. </li><li> Iniettare le femmine ip con 5 UI di gonadotropina corionica umana (hCG; in 100 μL) 46-48 h più tardi (intorno alle 11 del mattino il giorno 3). </li><li> Collegare immediatamente le femmine con i singoli maschi durante la notte. </li></ol> 7. Iniezioni pronucleari (integrazione casuale) e citoplasmatiche (targeting gene) <ol><li> Togliere i topi superovulati dalla dislocazione cervicale, esporre l&#39;addome e accedere alle ovaie e agli ovuli, come descritto in precedenza 15 . Dissect the oPresenta e raccoglie i complessi cumulo-oociti (COC) sotto uno stereomicoroscopio 15 . Metterli in una goccia di mezzo di ottimizzazione di potassio simplex integrato con amminoacidi (KSOMaa) seguendo il metodo tradizionale 15 . </li><li> Purificare gli oociti aggiungendo approssimativamente 1 μL di ialuronidasi (10 mg / ml) alla goccia del mezzo KSOMaa usando un pezzo di bocca dell&#39;aspirazione e posizionare il piatto in un incubatore di CO 2 di 37 ° C / 5% per 30 s a 1 min. </li><li> Lavare gli oociti con 4 gocce di mezzo di KSOMaa usando il pezzo della bocca dell&#39;aspirazione e trasferirle in una goccia finale di mezzo KSOMaa sovrapposto ad olio minerale (circa 2 ml). Mettere il piatto nel incubatore di CO 2 di 37 ° C / 5% finché gli oociti sono pronti per l&#39;iniezione. </li><li> Iniezione pronucleare (integrazione casuale). <ol><li> Visualizzare le uova sotto il microscopio stereoscopico e trasferire circa 50 uova alla camera di iniezione (un droP di media M2 sovrapposti con olio minerale) utilizzando il pezzo di bocca dell&#39;aspirazione. </li><li> Trasferire la camera di iniezione al microscopio invertito e iniettare gli oociti fecondati (due pronuclei visibili) con pochi picolitri del mix di iniezione, puntando su un pronucleo (qualsiasi pronuclei può essere mirato). Visualizzare un&#39;iniezione di successo osservando il gonfiore del pronucleo. </li></ol></li><li> Iniezione citoplasmatica (targeting gene). <ol><li> Trasferire circa 50 uova a una goccia di KSOMaa contenente 5 μg / mL di Cytochalasin B usando la bocca e incubare per 5 minuti nel 37 ° C / 5% CO 2 incubatore. </li><li> Trasferire le uova alla camera di iniezione usando la bocca. </li><li> Iniettare pochi picolitri del mix di iniezione nel citoplasma a una pressione molto bassa (50-100 hPa), utilizzando la pressione di compensazione del microinjector automatico, ove possibile. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, trasferire gli oociti in una goccia di KSOMaa (usando la bocca) e tenerli nel incubatore di CO 2 di 37 ° C / 5% fino a caricare per reimplantare nell&#39;ovulità delle femmine pseudo-incinte. </li></ol></li></ol> 8. Reimplantazione <ol><li> Autoclave tutti gli strumenti chirurgici in acciaio inox. </li><li> Determinare il peso del mouse utilizzando la bilancia di peso e anestetizzare le femmine mediante iniezione intraperitoneale (ip) con anestetici iniettabili (ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg). </li><li> Monitorare la perdita del riflesso del pizzico del piede e una volta che il topo è sedato, posizionarlo sopra un tappetino di riscaldamento. </li><li> Clip una grande area della pelliccia intorno alla linea mediana dorsale del mouse femminile. </li><li> Disinfettare la pelle esposta con salviette alternate di antisettico topico come la clorexidina e il 70% di etanolo. </li><li> Esporre il tratto riproduttivo seguendo il metodo tradizionale 15 . Fai un&#39;incisione della pelle lunga 1 cm parallela alla linea mediana dorsale, taglia il muscolo e afferra il pad grasso wiUna pinza, quindi estrarre delicatamente l&#39;ovario fino a quando il relativo oviduct attaccato e l&#39;utero sono chiaramente visibili. </li><li> Fissare il pasticcio grasso con un morsetto per vaso. Visualizzare l&#39;ovidotto sotto il microscopio stereoscopico ed usando una coppia di micro-forbici effettuare un&#39;incisione nella parete dell&#39;ovidotto pochi millimetri a monte dell&#39;ampolla. </li><li> Sotto il microscopio stereoscopico, caricare 25 uova microinjected nel capillare di vetro collegato alla bocca pezzo (il diametro interno del capillare dovrebbe essere circa 120 μm di larghezza). Introdurre il capillare di vetro nell&#39;ovidotto e espellere fino a quando una bolla d&#39;aria è visibile all&#39;interno dell&#39;ampolla. </li><li> Rimuovere delicatamente il capillare di vetro e posizionare il tratto riproduttivo nell&#39;addome. Sutura l&#39;incisione con 3-0 suture chirurgiche non assorbibili, quindi chiudere con le clip della ferita. Monitorare attentamente il mouse fino al completo recupero. </li></ol> 9. Strategie di Genotipizzazione / Sequencing NOTA: Isolare la genomicaDNA da biopsie di coda o orecchie da 2 mm, seguendo le normative relative all&#39;etica degli animali. <ol><li> Estrazione del DNA genomica veloce (integrazione casuale). <ol><li> Lyse i campioni di tessuto (~ 2 mm) a 95 ° C per 1 h in 100 μl di reagente alcalino di lisi (25 mM di sodio idrossido e 0,2 mM EDTA, pH = 12). </li><li> Aggiungere 100 μl di reagente neutralizzante (40 mM Tris-HCl, pH 5). </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 12.000 g e 4 ° C. </li></ol></li><li> Estrazione genomica di DNA di alta qualità (targeting del gene). <ol><li> Aggiungere 500 μl di tampone di coda (50 mM Tris, pH 8, 100 mM EDTA, pH 8, 100 mM NaCl, SDS 1% e 0,5 mg / mL proteinasi K, aggiunto di nuovo). </li><li> Incubare per una notte a 55 ° C. </li><li> Mescolare per 5 minuti invertendo (non vorticarsi). </li><li> Aggiungere 250 μl di NaCl saturo (6 M) e mescolare per 5 minuti invertendo (non vortice). </li><li> Spin per 5-10 min a 12.000 xg e 4 ° C e versare il supernatante in un nuovo tubo. </li&gt; <li> Aggiungere 500 μl di isopropanolo e mescolare per 5 minuti invertendo (non vortice). </li><li> Spin per 10 min a 12.000 xg e temperatura ambiente. </li><li> Decanta il surnatante (il pellet è invisibile e si attacca al tubo). </li><li> Lavare con 1 mL di etanolo al 70%. </li><li> Spin per 5-10 min a 12.000 xg e temperatura ambiente. Rimuove con attenzione il surnatante, poiché il pellet bianco non è più appiccicoso e può essere perso. </li><li> Asciugare l&#39;aria per ~ 1 h. </li><li> Aggiungere 400 μl di tampone TE (10 mM Tris e 1 mM EDTA, pH = 8). </li><li> Sciogliere il DNA a 55-60 ° C per 2 ore. </li></ol></li><li> Design primer. <ol><li> Progettare i primer per un minimo di 20 bp lungo utilizzando uno strumento di calcolo 19 . NOTA: Per l&#39;integrazione casuale, i primers dovrebbero ibridizzare con il transgene, generando un frammento distinto di 200-800 bp. Per il targeting del gene, progettare i primer in modo che ibridizzino con il DNA genomico, generando una distinta fRagmentare qualche centinaio di bp intorno ai siti tagliati. Per i grandi inserimenti, i primers possono sedere sul transgene, ma la conferma dell&#39;integrazione mirata dovrebbe essere successivamente eseguita usando il camminatore a primer o una tecnica simile. </li></ol></li><li> Genotipizzazione PCR. <ol><li> Per ogni modifica genomica, progettare un nuovo protocollo PCR e testarlo empiricamente. Si consideri la lunghezza del frammento generato e la temperatura di fusione (Tm) di ciascuna coppia di primer. </li></ol></li><li> Sequencing. <ol><li> Per il targeting gene, inviare i prodotti PCR a un fornitore di servizi di sequenziamento di Sanger. </li></ol></li></ol>

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	<li>Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+function+of+tau+mediates+amyloid-beta+toxicity+in+Alzheimer's+disease+mouse+models.">Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease mouse models.</a> Cell. 142 (3), 387-397 (2010).</li><li>Ittner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+phosphorylation+of+tau+inhibits+amyloid-beta+toxicity+in+Alzheimer's+mice.">Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer's mice.</a> Science. 354 (6314), 904-908 (2016).</li><li>Marantz Henig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Monk in the Garden. , (2000).</li><li>Jaenisch, R., Mintz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simian+virus+40+DNA+sequences+in+DNA+of+healthy+adult+mice+derived+from+preimplantation+blastocysts+injected+with+viral+DNA.">Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (4), 1250-1254 (1974).</li><li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei.">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mice:+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century.">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).</li><li>Carbery, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases.">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186 (2), 451-459 (2010).</li><li>Sung, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting.">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 23-24 (2013).</li><li>Jinek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li><li>Kang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+precise+genetic+modifications+into+human+3PN+embryos+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+editing.">Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing.</a> J Assist Reprod Genet. 33 (5), 581-588 (2016).</li><li>Liang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+editing+in+human+tripronuclear+zygotes.">CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes.</a> Protein Cell. 6 (5), 363-372 (2015).</li><li>Ittner, L. M., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pronuclear+injection+for+the+production+of+transgenic+mice.">Pronuclear injection for the production of transgenic mice.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1206-1215 (2007).</li><li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li><li>. Resuspension Calculator Available from: <a target="_blank" href="https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/">https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/</a> (2017)</li><li>Auerbach, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-dependent+differences+in+the+efficiency+of+transgenic+mouse+production.">Strain-dependent differences in the efficiency of transgenic mouse production.</a> Transgenic Res. 12 (1), 59-69 (2003).</li><li>Merriman, J. A., Jennings, P. C., McLaughlin, E. A., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+superovulation+efficiency,+aneuploidy+rates,+and+sister+chromatid+cohesion+in+mice+aged+up+to+15+months.">Effect of aging on superovulation efficiency, aneuploidy rates, and sister chromatid cohesion in mice aged up to 15 months.</a> Biol Reprod. 86 (2), 49 (2012).</li><li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-superovulation+for+the+CRISPR-Cas9-mediated+production+of+gene-knockout,+single-amino-acid-substituted,+and+floxed+mice.">Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice.</a> Biol Open. 5 (8), 1142-1148 (2016).</li><li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images.">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).</li><li>Whitten, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+the+oestrous+cycle+of+the+mouse+by+external+stimuli+associated+with+the+male.">Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male.</a> J Endocrinol. 13 (4), 399-404 (1956).</li><li>Ye, S., Dhillon, S., Ke, X., Collins, A. R., Day, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+procedure+for+genotyping+single+nucleotide+polymorphisms.">An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Res. 29 (17), E88 (2001).</li><li>Yoshimi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ssODN-mediated+knock-in+with+CRISPR-Cas+for+large+genomic+regions+in+zygotes.">ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes.</a> Nat Commun. 7, 10431 (2016).</li><li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+via+CRISPR/Cas9+mediated+homology-independent+targeted+integration.">In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration.</a> Nature. , (2016).</li><li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain.">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-71 (1999).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+mutation+at+the+known+collagenase+cleavage+site+in+mouse+type+I+collagen+impairs+tissue+remodeling.">A targeted mutation at the known collagenase cleavage site in mouse type I collagen impairs tissue remodeling.</a> J Cell Biol. 130 (1), 227-237 (1995).</li><li>Ke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+suppression+of+A315T+mutant+human+TDP-43+expression+improves+functional+deficits+in+a+novel+inducible+transgenic+mouse+model+of+FTLD-TDP+and+ALS.">Short-term suppression of A315T mutant human TDP-43 expression improves functional deficits in a novel inducible transgenic mouse model of FTLD-TDP and ALS.</a> Acta Neuropathol. 130 (5), 661-678 (2015).</li><li>Auerbach, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+functional+transgenic+mice+by+DNA+pronuclear+microinjection.">Production of functional transgenic mice by DNA pronuclear microinjection.</a> Acta Biochim Pol. 51 (1), 9-31 (2004).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice.">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nat Methods. 12 (6), 479 (2015).</li><li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+CRISPR/Cas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells.">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+globin+messenger+RNA+by+the+mouse+ovum.">Translation of globin messenger RNA by the mouse ovum.</a> Nature. 283 (5746), 499-501 (1980).</li><li>Pinkert, C. A., Irwin, M. H., Johnson, L. W., Moffatt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+transfer+into+mouse+ova+by+microinjection.">Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection.</a> Transgenic Res. 6 (6), 379-383 (1997).</li><li>Biggers, J. D., Summers, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+a+culture+medium:+making+informed+choices.">Choosing a culture medium: making informed choices.</a> Fertil Steril. 90 (3), 473-483 (2008).</li><li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+transfer+through+the+wall+of+the+fallopian+tube+in+mice.">Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice.</a> Jikken Dobutsu. 41 (3), 387-388 (1992).</li><li>Truett, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+tris+(HotSHOT).">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT).</a> Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li><li>Richardson, C. D., Ray, G., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+homology-directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA.">Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).</li><li>Delerue, F., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+Mice+Using+CRISPR/Cas9:+Achievements+and+Prospects.">Genome Editing in Mice Using CRISPR/Cas9: Achievements and Prospects.</a> Clon. Transgen. 4, (2015).</li></ol>

Gli autori forniscono servizi accademici di transgenesis nei topi attraverso l&#39;Università del Nuovo Galles del Sud Mark Wainwright Analytical Center.

Fasi critiche all&#39;interno del protocollo La generazione di topi geneticamente modificati è noto per essere tecnicamente impegnativa. Tuttavia, il protocollo qui presentato è un metodo ottimizzato e semplificato che consente di masterizzare e risolvere la tecnica in tempo record. Ci sono due fasi necessarie per il completamento della tecnica. In primo luogo, la sintesi di modelli lineari del DNA (per la sintesi di sgRNAs) può essere ottenuta senza cloruro di magnesio (MgCl2). Tuttavia, è...

I modelli animali, sia in vertebrati che in invertebrati, sono stati strumentali ad esaminare la fisiopatologia delle condizioni umane come la malattia di Alzheimer 1 , 2 . Sono anche strumenti preziosi per la ricerca di modificatori della malattia e per sviluppare in ultima analisi nuove strategie di trattamento nella speranza di una cura. Sebbene ogni modello abbia limiti intrinseci, l&#39;uso degli animali come interi modelli sistemici è fondamentale per la ricerca biomedica. Questo perché l&#39;ambiente fisiologico metabolico e complesso non può essere interamente simulato nella cultura del tessuto. Fino ad oggi, il topo rimane la specie mammiferi più diffusa per la manipolazione genetica perché presenta diversi vantaggi. I processi fisiologici e i geni associati alle malattie sono altamente conservati tra topi e esseri umani. Il topo è stato il primo mammifero a sequenziare il proprio genoma (2002), un anno prima del genoma umanoMe (2003). Oltre a questa ricchezza di informazioni genetiche, il mouse ha buone capacità di allevamento, un veloce ciclo di sviluppo (6 settimane dalla fecondazione allo svezzamento) e una dimensione ragionevole. Tutti questi vantaggi, accoppiati con indicatori fisiologici, come i colori del cappotto distinti (richiesti per le strategie di attraversamento), hanno reso il topo un modello attraente per la manipolazione genetica. Soprattutto, nella prima età della genetica moderna, Gregor Mendel ha iniziato a lavorare sui topi prima di passare alle piante 3 . Le tecniche di trasferimento del gene hanno determinato la generazione del primo topo transgenico più di tre decenni fa 4 , inizialmente creato usando la consegna virale. Tuttavia, i ricercatori hanno subito capito che una delle principali sfide del transgenesi del mouse era l&#39;incapacità di controllare il destino del DNA esogeno. Poiché la consegna virale di transgeni nei oociti del mouse ha portato a copie multiple integrate casualmente nel genoma, la possibilitY di stabilire linee transgeniche successive era limitata. Una tale limitazione è stata superata quando Gordon et al. Ha generato la prima linea del mouse transgenica mediante microinjection 5 , 6 . Ciò ha inizio l&#39;epoca della tecnologia del DNA ricombinante ei parametri che influenzano l&#39;esito di una sessione di microinjection sono stati ampiamente studiati 7 . Sebbene la microinjection non consente di controllare il sito di integrazione del transgene (che alla fine determina livelli di espressione specifici per ogni mouse fondatore), il vantaggio principale della microinjection pronucleare rimane la formazione di concatenanti ( cioè, array di copie multiple del transgene, Collegati in serie) prima dell&#39;integrazione genomica 5 . Questa caratteristica è stata utilizzata nel corso degli anni per stabilire migliaia di linee di topi transgenici che sovraespressionano un gene di interesse. Da allora, la transgenesis, l&#39;aModificazione rtificale del genoma di un organismo, è stata ampiamente utilizzata per identificare il ruolo dei geni singoli nel verificarsi di malattie. Un altro successo chiave nella manipolazione del genoma del mouse è stato raggiunto quando Mario Capecchi ha interrotto con successo un singolo gene nel topo, aprendo l&#39;era del gene targeting 8 . Tuttavia, i principali inconvenienti sono emersi rapidamente dal targeting genico basato su cellule ES, incluse le sfide di coltura delle cellule ES, il grado di chimerismo un po &#39;variabile e la durata del processo ( ovvero 12-18 mesi, minimo per ottenere il topo) . Recentemente, i metodi alternativi per le nuove tecnologie, come le endonucleasi ingegnerizzate ( es. Le nucleasi a dito di zinco (ZFN), le nucleasi efficace di attivazione della trascrizione (TALEN) e le cluster ripetute palindromiche brevi (CRISPR / Cas9) Accelerare il processo di targeting genico nel micE 9 , 10 . Queste endonucleasi possono essere facilmente iniettate in oociti del mouse mediante microinjection, permettendo la generazione di topi mirati per il gene in appena 6 settimane. Dalla prima relazione sull&#39;utilizzo di CRISPR per la modifica del genoma 11 , questo sistema immunitario adattativo batterico ha sostituito ZFN e TALEN a causa dei suoi molti vantaggi, tra cui la facilità di sintesi e la capacità di individuare contemporaneamente più loci (indicati come &quot;multiplexing &quot;). CRISPR è stato utilizzato per l&#39;individuazione genica nei topi 12 e da allora è stato applicato a innumerevoli specie, dalle piante agli esseri umani 13 , 14 . Ad oggi non esiste alcuna relazione di una singola specie resistente al montaggio del genoma CRISPR. Le due principali fasi di limitazione della generazione di topi transgenici sono l&#39;iniezione di oociti e la reimplantazioneDi questi oociti in femmine pseudo-incinte. Anche se questa tecnica è stata descritta da noi 15 e altri 16 , i recenti miglioramenti tecnici nell&#39;embrione del topo e nelle tecniche di trasferimento del gene hanno rivoluzionato il processo di generazione di topi geneticamente modificati. Questi miglioramenti saranno descritti qui.

<table><tbody><tr><td>Micropipette 0.1-2.5 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000016</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 2 - 20 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000040</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 20 - 200 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000067</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 100 - 1,000 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000083</td><td></td></tr><tr><td>Molecular weight marker&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33025</td><td>HyperLadder 1 kb</td></tr><tr><td>Molecular weight marker&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33056</td><td>HyperLadder 100 bp</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>EDTA buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93296</td><td>10x - Dilute to 1x</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe gel stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification kit (Qiaquick)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum system (Manifold)</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free microinjection buffer&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>MR-095-10F</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC microcentrifuge filter&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 mRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS9MRNA</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR expressing plasmid (px330)</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Phusion polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T7 Quick High Yield RNA kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2050S</td><td></td></tr><tr><td>RNA purification spin columns (NucAway)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>ssOligos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO STANDARD</td><td></td></tr><tr><td>Donor plasmid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>GeneArt</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>KSOMaa embryo culture medium</td><td>Zenith Biotech&amp;nbsp;</td><td>ZEKS-100</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Zenith Biotech&amp;nbsp;</td><td>ZSCO-100</td><td></td></tr><tr><td>M2 Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>Mouthpiece</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Glass microcapillaries</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Applichem</td><td>A3830.0100</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Vessel clamp</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>18374-43</td><td></td></tr><tr><td>Wound clips&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>Clips applier&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>12018-12</td><td></td></tr><tr><td>Micro-scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Cauterizer</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0)</td><td>Ethicon</td><td>1691H</td><td></td></tr><tr><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>MG Scientific</td><td>Galaxy 14S</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6321 000.515</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis set up</td><td>BioRad</td><td>1640300</td><td></td></tr><tr><td>UV Transilluminator</td><td>BioRad</td><td>1708110EDU</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6334000069</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopic microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>2x Micromanipulators</td><td>Eppendorf</td><td>5188000.012</td><td></td></tr><tr><td>Oocytes manipulator</td><td>Eppendorf</td><td>5176000.025</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector (Femtojet)</td><td>Eppendorf</td><td>5247000.013</td><td></td></tr><tr><td>Mice C57BL/6J strain</td><td>Australian BioResources</td><td>C57BL/6JAusb&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of genetically modified mice through the microinjection of oocytes

L&#39;uso di topi geneticamente modificati ha contribuito in maniera significativa agli studi sui processi fisiologici e patologici in vivo . L&#39;iniezione pronucleare di espressioni del DNA in oociti fecondati rimane la tecnica più comunemente utilizzata per generare topi transgenici per sovraespressione. Con l&#39;introduzione della tecnologia CRISPR per il targeting genico, l&#39;iniezione pronucleare in oociti fecondati è stata estesa alla generazione di topi di knockout e knockin. Questo lavoro descrive la preparazione del DNA per l&#39;iniezione e la generazione di guide CRISPR per il targeting genico, con particolare attenzione al controllo di qualità. Le procedure di genotipizzazione necessarie per l&#39;identificazione dei potenziali fondatori sono critiche. Le strategie innovative di genotipizzazione che sfruttano le funzionalità &quot;multiplexing&quot; di CRISPR sono qui presentate. Sono inoltre descritte procedure chirurgiche. Insieme, i passaggi del protocollo consentiranno la generazione di genI topi eticamente modificati e per la successiva istituzione di colonie del mouse per una pletora di campi di ricerca, tra cui immunologia, neuroscienza, cancro, fisiologia, sviluppo e altri.

Di seguito sono descritti i flussi di lavoro per la microinjection in caso di integrazione casuale e CRISPR-mediated gene targeting ( Figura 1 ). <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig1v2.jpg" /> Figura 1: flusso di lavoro tipico per la generazione di topi modificati geneticamente. Per l&#39;integrazione casuale, il transgene purificato vien...

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Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

La microinezione di ovociti del mouse è comunemente utilizzata sia per il transgenesi classico ( cioè l&#39;integrazione casuale dei transgeni) sia per il targeting del gene mediato da CRISPR. Questo protocollo riesamina gli ultimi sviluppi della microinjection, con particolare attenzione alle strategie di controllo della qualità e genotipizzazione.

Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

20.4K Views.  University of New South Wales.  La microinezione di ovociti del mouse è comunemente utilizzata sia per il transgenesi classico ( cioè l'integrazione casuale dei transgeni) sia per il targeting del gene mediato da CRISPR. Questo protocollo riesamina gli ultimi sviluppi della microinjection, con particolare attenzione alle strategie di controllo della qualità e genotipizzazione. 

Video: Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss e approccio guadagno-di-funzione per indagare cellulare precoce Fate Determinanti in preimpianto embrioni di topo

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Usando i Oocytes del Mouse per valutare la funzione del Gene umano durante la meiosi I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genetica

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a routine procedure is widely utilized throughout the world and its main limitation resides in the poor efficacy of transgene integration, resulting in a low yield of founder animals. Only few percent of animals born after implantation of injected fertilized oocytes have integrated the transgene. In contrast, lentiviral vectors are powerful tools for integrative gene transfer and their use to transduce fertilized oocytes allows highly efficient production of founder transgenic mice with an average yield above 70%. Furthermore, any mouse strain can be used to produce transgenic animal and the penetrance of transgene expression is extremely high, above 80% with lentiviral mediated transgenesis compared to DNA microinjection. The size of the DNA fragment that can be cargo by the lentiviral vector is restricted to 10 kb and represents the major limitation of this method. Using a simple and easy to perform injection procedure beneath the zona pellucida of fertilized oocytes, more than 50 founder animals can be produced in a single session of microinjection. Such a method is highly adapted to perform, directly in founder animals, rapid gain and loss of function studies or to screen genomic DNA regions for their ability to control and regulate gene expression in vivo.

Here, we present a protocol to promote transgene integration and production of founder transgenic mice with high efficacy by a simple injection of a lentiviral vector in the perivitelline space of a fertilized oocyte.

Produzione di topi transgenici mediata lentivirali: un metodo semplice ed altamente efficiente per uno studio diretto dei fondatori

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

Uso di embrioni congelati per la produzione ad alta efficienza di topi geneticamente modificati

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

Germline genetically engineered mouse models (G-GEMMs) have provided valuable insight into in vivo gene function in development, homeostasis, and disease. However, the time and cost associated with colony creation and maintenance are high. Recent advances in CRISPR-mediated genome editing have allowed the generation of somatic GEMMs (S-GEMMs) by directly targeting the cell/tissue/organ of interest.
The oviduct, or fallopian tube in humans, is considered the tissue-of-origin of the most common ovarian cancer, high-grade serous ovarian carcinomas (HGSCs). HGSCs initiate in the region of the fallopian tube distal to the uterus, located adjacent to the ovary, but not the proximal fallopian tube. However, traditional mouse models of HGSC target the entire oviduct, and thus do not recapitulate the human condition. We present a method of DNA, RNA, or ribonucleoprotein (RNP) solution microinjection into the oviduct lumen and in vivo electroporation to target mucosal epithelial cells in restricted regions along the oviduct. There are several advantages of this method for cancer modeling, such as 1) high adaptability in targeting the area/tissue/organ and region of electroporation, 2) high flexibility in targeted cell types (cellular pliancy) when used in combination with specific promoters for Cas9 expression, 3) high flexibility in the number of electroporated cells (relatively low frequency), 4) no specific mouse line is required (immunocompetent disease modeling), 5) high flexibility in gene mutation combination, and 6) possibility of tracking electroporated cells when used in combination with a Cre reporter line. Thus, this cost-effective method recapitulates human cancer initiation.

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

This protocol describes microinjection and in vivo electroporation for regionally restricted CRISPR-mediated genome editing in the mouse oviduct.

Modelli murini di ingegneria genomica somatica mediante microiniezione ed elettroporazione in vivo

Germline genetically engineered mouse models (G-GEMMs) have provided valuable insight into in vivo gene function in development, homeostasis, and disease. ...

Ricerca sul cancro

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Microiniezione di zigote per la creazione di alleli knock-in e flox a cassetta genica nei topi

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

<meta charset="utf8"></head><body>Procedura di iniezione di spermatidi rotondi murini per studiare lo sviluppo embrionale

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Iniezione di spermatide rotondo di topo

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Loss e approccio guadagno-di-funzione per indagare cellulare precoce Fate Determinanti in preimpianto embrioni di topo

Usando i Oocytes del Mouse per valutare la funzione del Gene umano durante la meiosi I

Produzione di topi transgenici mediata lentivirali: un metodo semplice ed altamente efficiente per uno studio diretto dei fondatori

Uso di embrioni congelati per la produzione ad alta efficienza di topi geneticamente modificati

Modelli murini di ingegneria genomica somatica mediante microiniezione ed elettroporazione in vivo

Microiniezione di zigote per la creazione di alleli knock-in e flox a cassetta genica nei topi

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione