Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca G0400268 e MR / K018396 / 1 dal Medical Research Council, e da Action Medical Research. Ulteriore supporto è stato fornito dal National Institute for Health Research University College London Hospitals Centro di ricerca biomedica.

Tutti gli esperimenti sugli animali effettuati in questo studio erano conformi alla legislazione nazionale ed europea e sono stati approvati dal Comitato Etico della Scuola UCL di Farmacia e il Regno Unito Home Office (HO). Tutti i lavori animale è stata condotta nell&#39;ambito del progetto HO licenze PPL 80/2243 e PPL 70/7773. 1. Rat Preparazione <ol><li> Eseguire tutti gli esperimenti in vivo utilizzando Wistar ratti neonati esenti da organismi patogeni. </li><li> Conservare tutte le cucciolate di ratto (12 neonati per colonia) in gabbie individuali con le loro madri allattano il bambino (9 - 11 settimane di età femmine), in condizioni ottimali (19 - 21 ° C, 45 - 55% di umidità, 15 - 20 ricambi d&#39;aria / ora e 12 h ciclo luce / buio). </li></ol> 2. cellule batteriche Preparazione <ol><li> Negozio E. scorte coli K1 a 20% (v / v) di glicerolo a -80 ° C. Per ogni esperimento, piastra i batteri azionari su Mueller-Hinton (MH) agar piastre e incubare a 37 ° CO / N. </li><li> Il giorno prima di alimentazione, inocutardo 10 ml di brodo di MH con un singolo E. coli K1 colonia e la cultura O / N a 37 ° C, 200 rpm. Come controllo per mezzo di contaminazione, preparare 10 ml di brodo inoculato MH e incubare a 37 ° C a 200 rpm. </li><li> Trasferire 100 ml di O / N sospensione batterica in 9,9 ml di brodo MH (1: 100 v / v), e incubare a 37 ° C, 200 rpm, fino al raggiungimento metà esponenziale fase, corrispondente ad una densità ottica di 0,6 misurata ad una lunghezza d&#39;onda di 600 nm (OD 600). </li></ol> 3. L&#39;alimentazione di ratti neonati con E. coli K1 <ol><li> Tenere delicatamente l&#39;animale verticalmente in una mano dalla collottola, permettendo alla bocca di aprirsi. Lentamente inserire la punta della pipetta sterile nella bocca dell&#39;animale, e pipettare 20 ml di inoculo (~ 37 ° C) nella bocca dell&#39;animale per un periodo di tempo di 30 sec. Rispedire l&#39;animale verso la sua madre subito dopo la poppata. </li><li> Verificare che il 4 - 8 x 10 6 batteri sono stati alimentati to ogni cucciolo per diluizione seriale del inoculo in PBS e spotting su piastre di agar MH. </li></ol> 4. Valutazione della colonizzazione da E. coli K1 <ol><li> Premere delicatamente l&#39;animale in una mano dalla collottola. Inumidire un panno di cotone sterile in PBS sterile, e poi tamponare delicatamente la zona perianale. Rispedire l&#39;animale verso la sua madre subito dopo tampone. </li><li> Posizionare la punta del tampone in una provetta contenente 300 ml di PBS sterile e memorizzare sul ghiaccio. </li><li> Determinare il numero di batteri vitali da diluizioni seriali in PBS e placcatura su piastre di agar MacConkey. </li><li> Determinare valida E. coli K1 per test di sensibilità batteriofago. Scegli una colonia individuo che usa un ciclo microbiologico sterili, immerso in 200 ml PBS sterile, poi oggetto di vortex. </li><li> Utilizzando un sterili ciclo microbiologico, subcultura su MH agar in linea retta. Lasciare che il piatto ad asciugare per 30 secondi, e poi Pipettare 10 ml di bacteriophage K1E (10 9 unità formanti placca / ml (PFU / ml)) sul centro della linea. Incubare la piastra di O / N a 37 ° C. </li><li> Il giorno dopo, esaminare la piastra per lisi batteriofago-mediata. </li></ol> 5. Valutazione della gravità della malattia <ol><li> Valutare la gravità della malattia di ciascun animale 4 - 5 volte al giorno utilizzando il sistema di punteggio sette punti illustrato nella Tabella 1. </li><li> Se un animale punteggio ≥3 su 7, abbattere immediatamente l&#39;animale per ridurre al minimo le sofferenze. Registrare l&#39;animale morto. </li></ol> 6. euthanization di ratti neonati e prelievo di sangue <ol><li> Premere delicatamente l&#39;animale in una mano, esponendo la testa e il collo. Disinfettare il collo dell&#39;animale strofinando con un tampone imbevuto di alcool. Disinfettare un grosso paio di forbici con etanolo al 70%, prima del risciacquo in PBS sterile per rimuovere tracce di etanolo. </li><li> Premere delicatamente l&#39;animale direttamente sopra una piastra di Petri. Decapitare il neonato utilizzando Surgi forteforbici CAL, assicurando che il sangue gocciola nella piastra di Petri. Evitare il contatto con la testa per evitare la contaminazione del sangue con flora cutanea. </li><li> Subito raccogliere il sangue con una pipetta sterile e mescolare con eparina sale di sodio ad una concentrazione di 20 - 50 unità / ml in una provetta da 0,5 ml microcentrifuga. </li><li> Determinare il numero di batteri vitali da diluizioni seriali in PBS e placcatura su piastre di agar MacConkey. Determinare il numero di vitali E. coli K1 testando la sensibilità dei batteri vitali per K1E batteriofago. </li></ol> 7. Dissection <ol><li> Dopo la decapitazione del ratto neonato, utilizzare condizioni asettiche di asportare e raccogliere i tessuti di interesse. Lavare tutti gli strumenti (mostrati nella Figura 1) in etanolo al 70% e PBS sterile. </li><li> Pulire la tavola di dissezione e bagnare completamente l&#39;addome con il 70% di etanolo. Posizionare il cadavere sulla schiena e fissare alla scheda dissezione (i) appuntare la zampa posteriore sinistratavolo operatorio con un ago sterile, (ii) allungamento cadavere e pinning zampa anteriore destra al tavolo operatorio, (iii) appunta la zampa posteriore destra e zampa anteriore sinistra al tavolo operatorio. </li><li> Tirare la pelle lungo il lato sinistro del basso addome con una pinza, poi tagliare lungo il lato sinistro del corpo dal basso addome allo sterno con piccole forbici dissezione. </li><li> Estendere l&#39;escissione attraverso lo sterno, e poi lungo il lato destro del corpo dallo sterno al basso addome con pinze e piccole forbici dissezione, garantendo che nessuna delle strutture sottostanti sono danneggiati. </li><li> Infine, tirare delicatamente verso il basso il lembo cutaneo dallo sterno al basso addome con iris pinze dissezione curve per esporre il peritoneo. </li><li> Sollevare delicatamente il peritoneo con una pinza e tagliare verticalmente per esporre gli organi interni, in modo che nessuno degli organi sottostanti sono danneggiati. </li></ol> 8. Raccoltail tratto GI <ol><li> Identificare lo stomaco, intestino tenue, intestino cieco, colon e del sistema linfatico mesenterico. </li><li> Rimuovere lo stomaco da sezionare con delicatezza su entrambi i lati, quindi inserire in un bijou contenente 1,6 ml di PBS sterile con pinza sterile. </li><li> Transetto il colon al retto. Estrarre con cautela l&#39;intera massa intestinale dal cadavere con pinze dissezione e posto in una piastra di Petri sterile. Assicurarsi che questo è fatto delicatamente in modo che la struttura intestinale e strutture linfatici mesenterici non si separano. </li></ol> 9. La separazione del tratto GI e il sistema linfatico mesenterica (Figura 2) <ol><li> Versare 30 ml di PBS sterile nella capsula di Petri, garantendo il tratto gastrointestinale è completamente sommerso. </li><li> Identificare la massa centrale del sistema linfatico mesenterico, e pizzicare con pinza sottile dissezione. Identificare la parte più prossimale del piccolo intestino, e pizzicare con pinza sottile dissezione. </li><li> Tirare lentamente la central massa del sistema linfatico mesenterico e piccolo intestino distale in direzioni opposte fino a due tessuti sono completamente separati gli uni dagli altri. Eseguire questa procedura con attenzione per garantire che l&#39;intestino tenue non sono allungate, come questo impedisce raccolta riproducibile prossimale, medio e regioni distali. Posizionare il sistema linfatico mesenterico in 300-500 ml PBS sterile e disporli sul ghiaccio. </li></ol> 10. Sezione del tratto GI <ol><li> Transect tratto gastrointestinale al cieco per separare tenue dal colon. </li><li> Posizionare i due punti in 300-500 ml PBS sterile e disporli sul ghiaccio. </li><li> Raccogliere tessuti rappresentativi regioni prossimali, medie e distali dell&#39;intestino tenue. Allineare l&#39;intestino tenue dal punto centrale. </li><li> Poi, (i) raccogliere gli ultimi 2 cm di tessuto prima cieco come il piccolo intestino distale, (ii) raccogliere il tessuto 5-7 cm sopra il punto medio come il piccolo intestino prossimale, e(Iii) raccoglie il tessuto dal 3 - 5 cm al di sotto del punto medio come il piccolo intestino medio. </li></ol> 11. Raccolta del Fegato <ol><li> Identificare le tre lobi del fegato di ratto dopo la rimozione dello stomaco. </li><li> Tirare lobi di distanza dalla cavità addominale con pinza sottile dissezione. </li><li> Rimuovere il fegato tagliando eventuali legamenti connessi con le forbici sottili. Mettere il fegato in 300-500 ml PBS sterile e posto sul ghiaccio. </li></ol> 12. Raccogliere la Milza <ol><li> Identificare la milza. </li><li> Tirare milza via dallo stomaco e usare le forbici sottili per tagliare il legamento gastrosplenico. </li><li> Mettere milza in 300-500 ml PBS sterile e posto sul ghiaccio. </li></ol> 13. Raccogliere i Reni <ol><li> Identificare i reni che diventeranno visibili nella parte posteriore della cavità addominale alla rimozione del tratto gastrointestinale e di altri organi. </li><li> Ureteri Cut ed eventuali legamenti connessi ucantare belle forbici dissezione e rimuovere reni con una pinza sottile. Rimuovere ghiandole surrenali e qualsiasi materiale grasso (se ancora attaccato) utilizzando una pinza sottile e forbici dissezione. </li><li> Posizionare entrambi i reni in 300-500 ml PBS sterile e disporli sul ghiaccio. </li></ol> 14. Raccogliere il cervello <ol><li> Dopo la decapitazione, tenere la testa in posizione verticale con pinze curve. Pizzicare la pelle sulla parte superiore della testa in senso longitudinale con un altro set di pinze curve, e fare un&#39;incisione con fini forbici dissezione. Tagliare restante pelle in prossimità del collo, ancora una volta in senso longitudinale con fini forbici dissezione. </li><li> Tirare la pelle in una direzione verso l&#39;esterno con una pinza sottile su entrambi i lati per rivelare il cranio e rimuovere lembi cutanei utilizzando sottili forbici dissezione. Bel posto forbici dissezione in apertura della colonna vertebrale e fare un&#39;incisione lungo il cranio verso la tribuna. </li><li> Tirare entrambe le sezioni del cranio in una direzione verso l&#39;esterno con una pinza sottile. Tagliare per rimuovere i segmenti del cranio. </li><li&gt; Rimuovi cervello con grandi pinze, con un movimento verso l&#39;alto scavare dall&#39;apertura del midollo verso la tribuna. Lavare il cervello in PBS due volte per rimuovere il sangue dalla procedura di decapitazione. </li></ol> 15. Lavorazione tessuti e omogeneizzazione <ol><li> Per gli esperimenti che richiedono i conteggi di fattibilità o l&#39;estrazione del DNA, tessuti posto in provette contenenti PBS sterile. Determinare immediatamente il numero di batteri vitali da diluizioni seriali in PBS e placcatura su piastre di agar MacConkey, o conservare a -20 ° C con il 20% di glicerolo per il breve termine. Per l&#39;estrazione del DNA, negozio di tessuti a -20 ° C. </li><li> Per gli esperimenti che richiedono l&#39;estrazione di RNA, posto in tessuti adeguati volumi di soluzione RNAlater (10 ml per 1 mg di tessuto), quindi memorizzare immediatamente a -20 ° C per breve termine o a -80 ° C conservazione a lungo termine. </li><li> Per gli esperimenti che richiedono l&#39;imaging, luogo tessuti in 10 ml di soluzione Methacarn (60% metanolo, 30% di cloroformio e il 10% di acido acetico), quindi memorizzare unt RT (20 - 25 ° C) per 3 settimane. </li><li> Calcolare il peso del tessuto confrontando peso di tubi prima e dopo l&#39;aggiunta dei tessuti. Omogeneizzare i tessuti utilizzando un omogeneizzatore. Lavare l&#39;omogeneizzatore una volta in etanolo al 70% e due volte in PBS sterile tra omogeneizzazione di ogni campione. NOTA: la fissazione Methacarn è auspicabile per il fissaggio dei campioni intestinali, al fine di preservare le strutture di difesa della mucosa mucina correlata; fissazione in formalina può essere utilizzato per tessuti sistemici. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il modello animale qui descritto si basa sul precedente lavoro che mira a riprodurre le caratteristiche salienti di naturali infezioni negli esseri umani. Ratti neonati sono stati inizialmente utilizzati per studiare la meningite infantile a causa di H. influenzae di tipo b come la specie soddisfaceva i criteri chiave per un modello affidabile di infezione. Così, il portale d&#39;ingresso del patogeno in questione dovrebbe riflettere sul fatto che l&#39;infezione umana naturale e riproducibile dar luogo a simile patologia di durata sufficiente per consentire un intervento terapeutico. Le tecniche utilizzate non devono limitare l&#39;applicabilità della procedura e non dovrebbero contribuire al decorso della malattia 20. Il modello di H. influenzae di meningite in ratti neonati sviluppati da Moxon e colleghi risponde a questi criteri 20; l&#39;infezione naturale si verifica dopo la colonizzazione delle membrane mucose del tratto respiratorio superiore e questa caratteristica importante è stato replicato nei ratti da non-traumainstillazione tic dei batteri sulle membrane dei passaggi nasali. È importante sottolineare che la natura età-dipendente del l&#39;infezione è stata replicata nel modello. Lo stesso gruppo sono stati anche i primi a sviluppare un modello di non-invasiva di E. coli K1 NBM nel ratto neonato 22. Esenti da organismi patogeni Sprague-Dawley cuccioli sono stati colonizzati da alimentazione 8 Ottobre - 10 Ottobre batteri attraverso un sondino gastrico per via orale; l&#39;inoculo era quindi notevolmente superiore a quello impiegato da noi. La colonizzazione con i tre ceppi K1 esaminati, C94 (O7: K1: H-), EC3 (O1: K1: H-) e LH (O75: K1: H3), si è verificato in una percentuale relativamente elevata (48-74%) di animali K1-alimentato, ma l&#39;incidenza di batteriemia, meningite e la mortalità era variabile e significativamente più bassi rispetto ai tassi di colonizzazione. La natura clonale di E. infezione sperimentale coli K1 è stata stabilita entro 23 ed è ora evidente che solo O18: K1 e, in misura minore, O7: sierotipi K1 sono in gradodi provocare costantemente infezione sistemica. Per questo motivo, queste indagini di patogenesi di neuropatogeno E. coli K1 si basavano sull&#39;uso della O18 virulenza avanzata: K1 ceppo A192PP. Un confronto di E. coli K1 alimentazione di ratti neonati attraverso un tubo gastrico, come usato da Glode e colleghi 22, e un metodo di alimentazione goccia come impiegata dal gruppo di Achtman 23 ha rivelato un numero eccessivo di morti con il primo metodo, quasi certamente a causa di danni alle superfici mucose da parte del tubo gastrico. Poiché i tassi di colonizzazione sono paragonabili con questi due metodi, si consiglia di utilizzare il metodo meno invasivo di alimentare i batteri con una pipetta con una punta sterile, come descritto nella presente comunicazione. E. coli A192PP ceppo usato nei nostri studi è O18: K1. Si tratta di un derivato più virulento del ceppo clinico E. coli A192 che è stato originariamente recuperato da un paziente con la setticemia 27 </sup&gt;. La maggiore virulenza del ceppo è stata ottenuta mediante passaggio seriale in ratti neonati 26. Il ceppo suscita una gravità della malattia età-dipendente, con il 100% batteriemia e la mortalità quando somministrato a due giorni animali vecchi 28. Al contrario, a 9 giorni di età animali sono completamente resistenti alle malattie. Specifici K1 batteriofago litico può essere utilizzata per differenziare E. coli K1 da altri E. coli ceppi 29. In questo studio, sensibilità di batteri vitali per K1E batteriofago deve essere utilizzato (i) controllare la purezza del E. sospensioni coli K1 pronti ad essere somministrati agli animali, e (ii) per differenziare E. coli K1 dagli altri coliformi per calcolare la redditività in tamponi perianali, sangue e campioni di tessuto. Se la colonia è E. coli K1, sarà suscettibile di batteriofago K1E lisi, e la crescita batterica viene inibita nel sito di inoculazione batteriofago. Se la colonia non è E. coli K1, sarà bresistenti alla lisi KIE batteriofago e, e ci dovrebbe essere un&#39;area di crescita batterica nel sito di inoculazione batteriofago. Va tenuto presente che modelli animali non possono riflettere tutte le caratteristiche della malattia naturale. Il modello attuale può essere modificato per esaminare le caratteristiche di virulenza dei batteri neuropatogeno diversi da E. coli A192PP e variazioni nelle dimensioni dell&#39;inoculo colonizzare possono essere ospitati. Le future applicazioni della tecnica potrebbero includere la valutazione dei farmaci tanto necessari per trattare la condizione e per scoprire i dettagli della risposta dell&#39;ospite alla colonizzazione e l&#39;invasione dei tessuti. Il metodo qui descritto è semplice ma efficace. Cucciolate singole di 10 - 12 cuccioli sono stati impiegati come gruppi di prova o di controllo e questo approccio intra-lettiera garantisce un alto grado di riproducibilità e validità statistica. È indispensabile che i cuccioli vengono restituiti al loro madri naturali appena possibile dopo ogni immissioe cucciolate e non dovrebbero pertanto comprendere gli animali sottoposti a diversi interventi. È importante che l&#39;inoculo alimentato riscaldare altrimenti i cuccioli rifiuterà cultura offerta. I cuccioli sviluppano rapidamente una microflora complessa ed entro due giorni dalla nascita del tratto gastrointestinale è colonizzato con una vasta gamma di batteri dalla phyla stabilito come i microbi più abbondanti nel bambino e l&#39;adulto intestino. Cuccioli che non sono stati alimentati E. coli A192PP non svolge E. coli K1 nel tratto GI 17 e quindi la determinazione dei tassi di colonizzazione è relativamente semplice. Tuttavia, il Neus -based metodo qPCR per il rilevamento di colonizzare E. coli K1 è molto più sensibile che i metodi di coltura tradizionali ed è fortemente consigliato 17.

Infezioni batteriche sistemiche sono una grave minaccia per il benessere e la sopravvivenza del neonato; bambini prematuri sono particolarmente vulnerabili. Meningite batterica neonatale (NBM), spesso associata a sepsi batterica, continua ad essere una fonte significativa di mortalità e morbilità nel corso delle prime settimane di vita e il problema è aggravato dalla continua evoluzione della resistenza ai farmaci antibatterici in prima linea 1,2. Un caso di NBM è un&#39;emergenza medica che porta un medico, sociale ed economico di alta pressione 3; di conseguenza, vi è un urgente bisogno di nuove terapie e, in particolare, nuove strategie di profilassi per ridurre l&#39;onere di infezione. Alcune caratteristiche di NBM sono inusuali: nel mondo industrializzato, Escherichia coli e streptococchi di gruppo B sono responsabili della maggior parte dei casi e la capacità di questi ceppi di suscitare NBM è quasi sempre associata alla presenza di un polisaccaride protettiva capsule che permette al patogeno di eludere il riconoscimento immunitario elabora 4. Una percentuale molto elevata (80 - 85%) di neuroinvasive E. coli esprimere la capsula K1 5,6, un polimero di acido α-2,8 polysialic-collegato che è strutturalmente identico a ospitare modulatori di plasticità neuronale 7. La valutazione di nuove terapie e profilassi per NBM e batteriemia e sepsi associati trarrebbe beneficio chiaramente da un modello animale robusto di infezione che imita le caratteristiche principali della malattia nel neonato umano, in particolare il forte all&#39;età di dipendenza e il percorso naturale di infezione . Una vasta gamma di modelli per la meningite batterica Gram-positivi e Gram-negativi sono disponibili 8,9 e questi hanno notevolmente ampliato la nostra conoscenza della patogenesi, fisiopatologia e trattamento opzioni in queste infezioni. Così, infezioni sperimentali su ratti, topi, conigli e scimmie sono stati utilizzati per studiare la meningite sia nel neonate e l&#39;adulto. Tuttavia, molti di questi modelli impiegano iniezione diretta intracisternale o sottocutanea di batteri per apertura di infezione, creando una patogenesi artificiale bypassando processi naturali di diffusione dal sito di colonizzazione. In alcuni casi questi metodi di inoculazione portato a cambiamenti significativi nella patologia; per esempio, la somministrazione sottocutanea di E. ceppi coli K1 abrogati l&#39;età dipendenza associata con l&#39;infezione naturale, la produzione di batteriemia e l&#39;invasione del sistema nervoso centrale (SNC) in entrambi i neonati e gli adulti 10. Predisposizione per E. coli NBM è criticamente dipendente dalla trasmissione verticale l&#39;agente responsabile dell&#39;infezione dalla madre al neonato al momento o subito dopo la nascita 11. Materna di derivazione E. batteri coli K1 colonizzano il tratto gastrointestinale neonatale (GI) 11-13, che è sterile alla nascita, ma rapidamente acquista un microbiota complesso 14. Nei neonati colonizzati, E. coliK1 batteri hanno la capacità di traslocare dal lume intestinale nella circolazione sistemica prima di entrare nel SNC di tutti i ematoencefalica sangue o fluido cerebrospinale barriere 9,15. La progettazione di modelli robusti di infezione sperimentale dovrebbe prendere queste informazioni in considerazione. Anche se i topi sono stati ampiamente utilizzati per lo studio di alcune forme di meningite batterica 8, essi non sono adatti per gli studi di infezione neonatale: sono sopraffatti da infezione sistemica e non mostrano la forte caratteristica di dipendenza dei neonati umani 16. Inoltre, α-defensine, peptidi chiave del tratto gastrointestinale che fornisce una protezione contro l&#39;invasione sistemica da E. coli K1 17, sono altamente espresso nelle cellule Paneth e neutrofili negli esseri umani e ratti, ma non nei topi 18. Vi è un notevole grado di duplicazioni, la ridondanza e l&#39;eterogeneità nel topo defensine e relativi geni cryptidin non si trovano in altri unimals 19. Il ratto neonatale è stato inizialmente utilizzato da Moxon e collaboratori 20 per studiare la patogenesi della meningite da Haemophilus influenzae dopo l&#39;inoculazione intranasale, replicando il sito naturale di colonizzazione di questo patogeno neonatale nell&#39;essere umano, e successivamente adattato per età-dipendente E. coli K1 batteriemia e la meningite. Bortolussi et al. 21 iniezione intraperitoneale occupati della inoculo batterico per avviare l&#39;infezione, ma lo studio chiave di Glode e collaboratori 22 alimentazione gastrica orale per il parallelo la via naturale d&#39;infezione dopo la colonizzazione GI. Poiché il tubo gastrico può danneggiare le superfici mucose, la procedura è stata affinata per includere l&#39;alimentazione dell&#39;inoculo ai neonati 23. Qui, il metodo per la colonizzazione e le procedure per il monitoraggio dell&#39;infezione nei ratti neonati sono sensibili descritte tratto gastrointestinale; Inoltre, sono discusse applicazioni terapeutiche e preventive del modello.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1042">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother)</td>
			<td>Harlan, UK</td>
			<td>www.harlan.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K1 A192PP</td>
			<td>Taylor lab</td>
			<td>www.ucl.ac.uk</td>
			<td>Mushtaq et al. 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriophage K1E</td>
			<td>Taylor lab</td>
			<td>www.ucl.ac.uk</td>
			<td>Mushtaq et al. 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>G5516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller-Hinton Agar</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0337</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller-Hinton Broth</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacConkey Agar</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>P4417</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>E7023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>84020 
			Prepare 20-50 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Solution</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>R0901 
			10&#181;l/mg tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>320099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>C2432</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>322415</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped swabs</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>11542483</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcotip Swabs</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td>www.scientificlabs.co.uk</td>
			<td>SWA1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>P5856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mL Universal Tube</td>
			<td>AlphaLaboratories, UK</td>
			<td>www.alphalabs.co.uk</td>
			<td>CW3890</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>I1405-1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>I1415-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1&#181;l calibrated loops</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>E1412-0112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-shaped spreaders</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>E1412-1005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>10594175</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight with fine points</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12780036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight with blunt tips</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12391369</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps watchmaker&#39;s curved with very fine points&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12740926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors straight with very fine points</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12972055</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Scissors</td>
			<td>VWR, UK</td>
			<td>www.vwr.com</td>
			<td>USBE4251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25g Syringe Needles</td>
			<td>Greiner Bio-One Ltd</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
			<td>N2525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers</td>
			<td>PerkinElmer, UK</td>
			<td>www.perkinelmer.co.uk</td>
			<td>L60000BB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unitemp Incubator</td>
			<td>B&#38;T, UK</td>
			<td></td>
			<td>OP958</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>INFORS HT, UK</td>
			<td>www.infors-ht.com</td>
			<td>AJ118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Turrax T-10 homogenizer</td>
			<td>IKA Werke</td>
			<td>www.ika.com</td>
			<td>0003737000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive model of neuropathogenic escherichia coli infection in the neonatal rat

Studio delle interazioni tra ospite e batterio patogeno animale ha senso solo se il modello di infezione utilizzato replica le caratteristiche principali di infezione naturale. Questo protocollo descrive le procedure per la creazione e la valutazione di infezioni sistemiche a causa di neuropatogeno K1 Escherichia coli nel ratto neonato. La colonizzazione del tratto gastrointestinale porta alla diffusione del patogeno lungo il corso budello linfatico-ematoencefalica dell&#39;infezione e il modello mostra forte dipendenza dell&#39;età. Un ceppo di E. coli O18: K1 con una maggiore virulenza del ratto neonato produce eccezionalmente elevati tassi di colonizzazione, traslocazione al vano di sangue e l&#39;invasione delle meningi seguendo il transito attraverso il plesso coroideo. Come nell&#39;ospite umano, la penetrazione del sistema nervoso centrale è accompagnata da infiammazione locale e un risultato invariabilmente letale. Il modello è di provata utilità per gli studi del meccanismodi patogenesi, per la valutazione degli interventi terapeutici e per valutare la virulenza batterica.

Il E. coli K1 modello di infezione sistemica qui descritto replica molte delle caratteristiche della infezione naturale nell&#39;uomo. I batteri sono ingeriti, colonizzare il tratto gastrointestinale, traslocare nel compartimento sanguigno attraverso i linfonodi mesenterici prima di stabilire la malattia organo-specifica, con infiammazione associata del cervello 24. È importante sottolineare che il modello mostra una forte dipendenza degli anziani; come mostrato in Figura 3, due giorni di età (P2) ratti sono altamente suscettibili alla malattia invasiva ma per un periodo di sette giorni gli animali diventano progressivamente più refrattari alle infezioni, ma non Gi colonizzazione del tratto 17. Dopo transito dal sito di colonizzazione GI al comparto sangue, i batteri possono essere visualizzati in campioni di sangue mediante microscopia a fluorescenza (Figura 4) prima di entrare nel SNC prevalentemente nel plesso coroide 25. In alcuni animali, vi è ampia invasione di altri organi importanti comepolmone, milza e reni 25. Numeri batterica in tessuti possono variare notevolmente tra i singoli cuccioli 25, ma quando la carica batterica è segnato come presente o assente vi è un alto grado di riproducibilità in materia di invasione di organi. Con una cucciolata di 12 cuccioli come una singola coorte di prova, calcoli di potenza utilizzando G * software Alimentazione determinato che questa dimensione del campione equivale a una probabilità del 98,6% di trovare un effetto basato sulla sopravvivenza con sei animali della coorte e&gt; probabilità del 99% se tutti dodici sono presi in considerazione. Il modello è quindi adatto alla valutazione di nuovi agenti appositamente per il trattamento di infezioni batteriche neonatali ed è stato utilizzato nella procedura per valutare il potenziale terapeutico della capsula depolymerase EndoE che rimuove selettivamente la capsula K1 dalla superficie batterica 24-26. Può anche essere usato per studiare interazioni ospite-batteri che impatto sul pathogenesis di E. coli neuropathogens; in questo contesto è stato impiegato per studi di E. colonizzazione coli A192PP e la diffusione. È stato dimostrato che E. cellule coli A192PP persistono nel tratto gastrointestinale di P2, P5 e P9 cuccioli in gran numero; aspetti temporali della colonizzazione in questi tre gruppi erano molto simili (Figura 5) e riflette la capacità dei batteri di replicare e mantenere la densità di popolazione all&#39;interno dell&#39;intestino. La virulenza del A192 isolato clinico è stata potenziata mediante passaggio seriale in ratti neonati per garantire poca o nessuna ridondanza di uso animale. E. coli A192 colonizzato P2 ratti neonati con il 100% di efficienza, ha suscitato batteriemia nel 35% degli animali e ha prodotto un effetto letale nel 25% 27. Il A192PP derivata diversi passaggi colonizza il tratto gastro-intestinale, produce batteriemia e causa letalità in tutti i cuccioli P2. Pertanto, il modello può essere impiegato per studiare la virulenza different K1 ceppi rispetto alla loro capacità di invadere il SNC e altri organi dal sito di colonizzazione. In questo contesto, Pluschke e collaboratori 23 hanno utilizzato un modello di infezione ratto neonato per determinare la capacità di 95 E. coli K1 ceppi di origine umana per provocare batteriemia dopo la colonizzazione dell&#39;intestino; hanno osservato notevoli differenze in termini di efficienza sia di colonizzazione e la capacità invasiva, alla base della natura clonale di E. coli K1 neuropathogens. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Materiali per la raccolta dei tessuti: (A) bilancia, (b) i tubi pre-pesato contenenti supporti necessari, (C) Funzionamento tavolo, righello e aghi da definire l&#39;animale, (D) il 70% (v / v) etanolo e PBS per sterilizzare le attrezzature di raccolta dei tessuti, <sTrong&gt; (E) kit di raccolta del tessuto compreso un grosso paio di forbici per decapitazione e forbici e pinzette e lame di varie dimensioni e forme, (F) ghiaccio per preservare i tessuti, (G) 70% (v / v) di etanolo per la sterilizzazione il tavolo operatorio e circonda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2. Separazione del tratto gastrointestinale e il sistema linfatico mesenterico. (A) Afferrare la massa centrale del sistema linfatico mesenterico con pinza sottile dissezione. (B) Afferrare la parte prossimale del piccolo intestino, e tirare in direzioni opposte. (C) Il tratto gastrointestinale e del sistema linfatico mesenterico sarà completamente separate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. La sopravvivenza dei cuccioli di ratto neonatale di età compresa tra due giorni (P2) a nove giorni (P9) a seguito della somministrazione orale di E. coli A192PP, che illustra la forte dipendenza degli anziani di infezione sistemica. Ogni gruppo rappresenta 24 neonati. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. immagini di fluorescenza di E. cellule coli A192PP in uno striscio di sangue da un cucciolo P2 infetta dopo somministrazione orale di batteri. L&#39;antigene lipopolisaccaride O sulla superficie batterica era stained con coniglio anti-O18 anticorpo policlonale e secondo anticorpo Alexa546 coniugato capra anti-coniglio. La capsula K1 è stato visualizzato con il reagente EndoE-GFP. Praticamente tutti i batteri rilevati nei campioni di sangue visualizzata la K1 capsula protettiva. Le immagini sono state catturate dal dottor Andrea Zelmer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. E. coli A192PP colonizzazione intestinale dopo somministrazione dell&#39;inoculo batterico. Il DNA è stato estratto da tutta dell&#39;intestino ed E. coli K1 unità formanti colonia / g (CFU / g) dei tessuti determinato per reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) mira il gene polysialyltransferasi (Neus) come descritto altrove 17 </sup&gt;. LOD: limite di rilevazione. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Caratteristica </td><td> Sano </td><td> Malsano </td></tr><tr><td> Colore della pelle </td><td> Rosa </td><td> Pallido / giallo </td></tr><tr><td> Agility (riflesso di raddrizzamento) </td><td> Pup inverte immediatamente sul collocamento indietro </td><td> Difficoltà a invertire il posizionamento all&#39;indietro (&gt; 3 sec) o non possono raggiungere </td></tr><tr><td> Leggera pressione sull&#39;addome </td><td> Nessun suono </td><td> Suono di agitazione </td></tr><tr><td> Stomaco / Linea latte </td><td> Visibile e nero </td><td> Non visibile </td></tr><tr><td> Temperatura </td><td> Caldo </td><td> Relativamente freddo * </td></tr><tr><td> Peso </td><td> Guadagno di 1,5-2 g al giorno </td><td> Nessun aumento di peso o perdita di peso </td></tr><tr><td> Comportamento quando messo in gabbia </td><td> Si muove verso la madre e inizia flimentazione </td><td> Non può muoversi verso la madre e mostra la difficoltà di alimentazione </td></tr></tbody></table> Tabella 1. sette punti sistema di punteggio: I primi tre punteggi riportati sono di solito i primi segnali osservati. * I neonati con infezione sistemica esperienza temperatura corporea elevata (&gt; 2 ° C). Tuttavia, a causa della mancanza di agilità degli animali per raggiungere la loro madre per mantenere la temperatura corporea, animali insalubri possono separarsi da lettiera e sentire freddo alla mano nuda.

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Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Qui, una procedura è descritta per la creazione di infezione sistemica nel ratto neonatale con colture di Escherichia coli K1. Questa procedura non invasiva consente colonizzazione del tratto gastrointestinale, traslocazione del patogeno alla circolazione sistemica, e l&#39;invasione del sistema nervoso centrale al plesso coroide.

Non invasiva Modello di neuropatogeno<em&gt; Escherichia coli</em&gt; L&#39;infezione neonatale nel ratto

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

non-invasive-model-neuropathogenic-escherichia-coli-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

10.8K Views.  University College London.  Qui, una procedura è descritta per la creazione di infezione sistemica nel ratto neonatale con colture di Escherichia coli K1. Questa procedura non invasiva consente colonizzazione del tratto gastrointestinale, traslocazione del patogeno alla circolazione sistemica, e l'invasione del sistema nervoso centrale al plesso coroide. 

Video: Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

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Immunologia e infezioni

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

A seguito di Cell-destino<em&gt; E. coli</em&gt; Dopo l&#39;infezione da fago lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Non invasiva Imaging di candidosi disseminata nelle larve Zebrafish

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Non invasiva di imaging ottico del sistema vascolare linfatico di un mouse

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Coltura Microglia dal Sistema Nervoso Centrale neonatale e adulti

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di Zebrafish larvale<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infezione

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. pylori-induced gastric inflammation by activating several innate leukocytes including neutrophils, monocytes, and mast cells. The immunogenic and immunomodulatory properties of HP-NAP make it a potential diagnostic and vaccine candidate for H. pylori and a new drug candidate for cancer therapy. In order to obtain substantial quantities of purified HP-NAP used for its clinical applications, an efficient method to purify this protein with high yield and purity needs to be established.
In this protocol, we have described a method for one-step negative chromatographic purification of recombinant HP-NAP overexpressed in Escherichia coli (E. coli) by using diethylaminoethyl (DEAE) ion-exchange resins (e.g., Sephadex) in batch mode. Recombinant HP-NAP constitutes nearly 70% of the total protein in E. coli and is almost fully recovered in the soluble fraction upon cell lysis at pH 9.0. Under the optimal condition at pH 8.0, the majority of HP-NAP is recovered in the unbound fraction while the endogenous proteins from E. coli are efficiently removed by the resin.
This purification method using negative mode batch chromatography with DEAE ion-exchange resins yields functional HP-NAP from E. coli in its native form with high yield and purity. The purified HP-NAP could be further utilized for the prevention, treatment, and prognosis of H. pylori-associated diseases as well as cancer therapy.

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

A high yield method for one-step negative purification of recombinant Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) overexpressed in Escherichia coli by using diethylaminoethyl resins in batch mode is described. HP-NAP purified by this method is beneficial for the development of vaccines, drugs, or diagnostics for H. pylori-associated diseases.

Un passo negativo cromatografica Purificazione di<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofili-attivazione della proteina sovraespresso in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; In modalità batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Rilevamento della colonizzazione di Escherichia Coli enteroemorragica in murino Host di sistema Non invasivo In Vivo bioluminescenza

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sovrapressione e purificazione dell&#39;uomo<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasi in<emEscherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

Un protocollo Facile generare proteine site-specifically acetilati in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...