Gli enteroidi sono organoidi tridimensionali derivati da cellule epiteliali intestinali. Sono ideali per lo studio di interazioni fisiologiche complesse, segnalazione cellulare e difesa dell'agente patogeno ospite. Il nostro protocollo descrive come coltura degli enteroidi umani dopo aver isolato le cellule staminali intestinali da pazienti sottoposti a resezione intestinale.
La co-somministrazione di lipopolysaccharide nei nostri mezzi di coltura provoca una risposta infiammatoria negli enteroidi che porta ad alterazioni dell'espressione istologica, genetica e proteica simili a quelle osservate nell'enterocolite necrotizzante umana. Dato che lo studio dell'enterocolite necrotizzante e dei potenziali agenti terapeutici è eticamente impegnativo nei soggetti umani, in particolare nei bambini, è altamente auspicabile utilizzare questo nuovo modello enteroide biologicamente rilevante di enterocolite necrotizzante utilizzando tessuto neonatale umano. Il principale vantaggio di questa tecnica è che gli enteroidi sono in grado di ricapitolare i tipi di cellule multiple dell'epitelio intestinale umano e sono in grado di superare i limiti riconosciuti dei modelli animali e dei sistemi cellulari.
A dimostrare la procedura ci saranno Christie Buonpane, una residente chirurgica, e Carrie Yuan, un tecnico di laboratorio del nostro laboratorio. Al momento della raccolta nella suite operativa, posizionare il piccolo campione di tessuto intestinale umano in DPBS freddo. Lavare il campione nel freddo DPBS fino a quando non è libero da sangue e feci.
Conservare il campione in mezzo RPMI 1640 a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'isolamento della cripta. Quando sei pronto a procedere, controlla di nuovo che il campione sia libero da feci e sangue. L'uso di delicate forbici sezionanti rimuove qualsiasi grasso in eccesso o clip chirurgiche e graffette.
Pesare il campione e puntare a un pezzo che è di circa 0,75 a 2,5 grammi. Quindi, tagliare il tessuto in pezzi di 0,5 centimetri e metterli in un tubo contenente 30 millilitri di tampone chelatante numero uno. Agitare a bassa velocità per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi, filtrare il tessuto attraverso un colino cellulare di 100 micrometri e scartare il flusso attraverso. Aggiungere il tessuto filtrato a un tubo contenente 30 millilitri di tampone chelating numero due. Agitare a bassa velocità per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Filtrare il tessuto attraverso un filtro da 100 micrometri e scartare il flusso. Successivamente, scongelare 500 microlitri di matrice di membrana basale sul ghiaccio per un uso successivo. Aggiungere un po 'di tessuto a 10 millilitri di DMEM freddo in un tubo conico da 50 millilitri e agitare vigorosamente a mano per 10 secondi.
Filtrare questa sospensione attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri e raccogliere il flusso attraverso. Tieni questo tubo sul ghiaccio. Aggiungere un po 'di tessuto ad altri 10 millilitri di DMEM freddo in un tubo conico separato da 50 millilitri e agitare vigorosamente a mano per 10 secondi.
Filtrare questa sospensione attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri e raccogliere il flusso attraverso. Ripetere il processo due volte in più fino a quando non ci sono quattro tubi conici contenenti flusso attraverso etichettato da uno a quattro. Quindi, filtrare la soluzione nel tubo numero uno attraverso un filtro a celle da 100 micrometri e trasferire il flusso attraverso un tubo conico da 15 millilitri etichettato anche come numero uno.
Ripetere questo processo per i tubi da due a quattro. Centrifuga i tubi da 15 millilitri a 200 volte G e a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Nella cappa di flusso laminare, rimuovere il supernatante da ogni tubo e scartarlo.
Evitare di interrompere la nube di tessuto immediatamente sopra il pellet, anche se ciò significa lasciare un po 'di supernatante alle spalle. In ogni tubo, pipettare su e giù lentamente per mescolare il pellet con il supernatante rimasto. Trasferire la miscela da ogni tubo in un singolo tubo conico a due millilitri e centrifugare a 200 volte G e a quattro gradi Celsius per 20 minuti.
Successivamente, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 500 microlitri di matrice di membrana basale pre-scongelata. Utilizzare una punta di pipetta refrigerata per applicare 50 microlitri di questa sospensione al centro di un pozzo in una piastra da 24 potte. Questo campione dovrebbe apparire a forma di cupola.
Ripeti questo processo di applicazione nove volte per riempire 10 pozzi totali. Trasferire la piastra del pozzo 24 in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per 30 minuti per consentire la polimerizzazione. Quindi, aggiungi 500 microlitri di mezzi minigut umani completi a ciascun pozzo.
Continuare a incubare nelle stesse condizioni, assicurandosi di sostituire questo supporto ogni due giorni. In primo luogo, aggiungere 10 microlitri di LPS a una concentrazione di cinque milligrammi per millilitro ai 500 microlitri di mezzi minigut umani completi in ogni pozzo della piastra il giorno zero. Continuare a incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e sostituire i supporti integrati ogni due giorni fino alla raccolta.
Per prepararsi all'incorporamento della paraffina, rimuovere prima delicatamente il supporto, aggiungere un millilitro di PBS e pipettare delicatamente su e giù per sciogliere la matrice della membrana basale facendo attenzione a non lisciviare gli enteroidi. Centrifugare a una velocità inferiore a 300 volte G per cinque minuti per pellet e quindi rimuovere il PBS. Aggiungere il 4% di paraformaldeide e mettere da parte il tubo per un'ora da fissare a temperatura ambiente.
Centrifugare a una velocità inferiore a 300 volte G per cinque minuti per il pellet e quindi rimuovere la paraformaldeide. Lavare delicatamente con un millilitro di PBS e centrifugare a una velocità inferiore a 300 volte G per cinque minuti. Quindi rimuovere il PBS.
Ripetere questo processo di lavaggio con PBS una volta. Posizionare la quantità desiderata del gel per la lavorazione dei tessuti in un tubo conico e scaldarlo in un incubatore di bagni asciutti a 65 gradi Celsius per tre o 10 minuti fino a quando non è liquido. Successivamente, aggiungere il gel di lavorazione dei tessuti fusi al pellet e mescolare delicatamente.
Posizionare un piccolo anello di clonazione in un coverslip. Pipettare il gel di lavorazione dei tessuti e la miscela enteroide nell'anello di clonazione montato su un copripazzo. Lasciare che il gel di lavorazione dei tessuti e la miscela enteroide si solidifichino a quattro gradi Celsius per un'ora.
Quindi, immergere l'anello di clonazione con la miscela solidificata in 70%etanolo per prepararsi all'incorporamento di paraffina. Immediatamente dopo la placcatura, le cripte intestinali appena isolanti appaiono come aste allungate. Nel giro di poche ore gli enteroidi avranno un aspetto rotondo.
Nei prossimi giorni gli enteroidi inizieranno a formare sfere. Lo sbiadimento dovrebbe avvenire tra i cinque e i 10 giorni, o quando dovrebbe verificarsi la raccolta enteroide. Gli enteroidi in crescita mostrano anche polarità, contenente un lume centralizzato, un bordo apicale e un dominio basilaterale.
Gli enteroidi mostrano anche integrità strutturale rappresentata da un robusto citoscheletro actina. Dopo diversi giorni di coltura, gli enteroidi trattati con LBS sperimentano più apoptosi e hanno una resa inferiore rispetto al gruppo di controllo. Come si vede nei NEC umani nei modelli murini del NEC, una maggiore espressione di pedaggio come il recettore quattro si trova negli enteroidi trattati con LPS rispetto ai controlli.
Gli enteroidi possono anche essere raccolti per l'estrazione di RNA e proteine utilizzando tecniche di blotting qRT-PCR ben consolidate e possono essere eseguite l'espressione genica e l'isolamento proteico.
